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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(9):140-148
收稿日期 ：2016-01-25
基金项目 ：中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（BLX2014-36，JC2013-1），国家自然科学基金项目（31422001）
作者简介 ：孟歌，女，硕士研究生，研究方向 ：药用真菌的代谢产物研究 ；E-mail ：meng_ge3132@163.com
通讯作者 ：司静，女，讲师，研究方向 ：大型真菌资源及其酶的开发利用 ；E-mail ：jingsi1788@126.com
崔宝凯，男，教授，研究方向 ：大型真菌的分类与资源利用 ；E-mail ：cuibaokai@yahoo.com
锦带花纤孔菌液体培养过程中的抗氧化活性
孟歌1  郑飞1  刘红霞2  司静1  崔宝凯1
（1. 北京林业大学微生物研究所，北京 100083 ；2. 北京林业大学林学院，北京 100083）
摘 要 ： 为更好地研究和开发药用真菌锦带花纤孔菌（Inonotus weigelae）的药理作用，以菌丝体生物量、pH、还原糖含量、
漆酶活性、多酚含量、丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性、总抗氧化能力
（Total antioxidant capacity，T-AOC）和 1，1- 二苯基 -2- 三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力为检测
目标，对锦带花纤孔菌在液体培养过程中的抗氧化活性进行了评价。结果显示，抗氧化活性与菌株生长状况、胞外酶活性及次级
代谢产物分泌密切相关。菌丝体生物量增长呈“S”型，6-12 d 迅速增长，第 12 天达到最大值，在此过程中还原糖含量、漆酶活
性及多酚含量均出现高峰，且菌丝体生物量的变化趋势与漆酶活性和多酚含量基本一致，说明菌株的营养利用与生理代谢相互依存。
SOD 活性与 T-AOC 在培养过程中均呈上升趋势，说明菌株在氧化胁迫的压力下可启动自身的抗氧化系统以抵御外界的损伤。此外，
锦带花纤孔菌对 DPPH 自由基的清除能力也较强，第 2 天时清除率为 78.56%，第 14 天时仍能达到 50% 以上。结果证明药用真菌
锦带花纤孔菌具有较强的抗氧化活性。
关键词 ： 药用真菌 ；锦带花纤孔菌 ；菌丝体生物量 ；漆酶活性 ；抗氧化活性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.019
Antioxidant Activity of Inonotus weigelae During the Liquid Cultivation
MENG Ge1 ZHENG Fei1 LIU Hong-xia2 SI Jing1 CUI Bao-kai1
（1. Institute of Microbiology，Beijing Forestry University，Beijing 100083 ；2. College of Forestry，Beijing Forestry University，
Beijing 100083）
Abstract: In order to better study and develop the pharmacological effect of the medicinal fungus Inonotus weigelae in the future，based
on the tested indicators of mycelial biomass，pH，reducing sugar content，laccase activity，polyphenol content，MDA（Malonaldehyde）
content，SOD（Superoxide dismutase）activity，T-AOC（Total antioxidant capacity），and DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）
radicals scavenging activity，the antioxidant activity of I. weigelae was evaluated during the liquid cultivation. The results demonstrated that
the strain’s antioxidant activity was closely correlated with its mycelial growth，extracellular enzyme activity，and secondary metabolite
secretion. The variations of mycelial biomass presented S-like curve，which increased rapidly from 6 to 12 d，reaching its peak at the 12th day.
During the liquid cultivation，the increased peaks on reducing sugar content，laccase activity，and polyphenol content were also observed.
Variation trends among the mycelial biomass，laccase activity，and polyphenol content were approximately consistent，indicating that there
existed a mutual dependence between the nutrition utilization of this fungal strain and its physiological metabolism. The SOD activity and T-AOC
during the culture tended to increase，indicating that the strain activated its antioxidant system to resist the damage from external environment
under the oxidative stress. Additionally，I. weigelae exhibited remarkable scavenging capacity against DPPH radicals，showing the scavenging
efficiency was up to 78.56% on the 2nd day and remaining over 50% on the 14th day. The above results confirmed that the medicinal fungus I.
weigelae possesses the superior antioxidant activity.
Key words: medicinal fungus ；Inonotus weigelae ；mycelial biomass ；laccase activity ；antioxidant activity
2016,32(9) 141孟歌等 ：锦带花纤孔菌液体培养过程中的抗氧化活性
我国真菌资源丰富，截至 2010 年，已发现的
真菌总数达 14 060 种［1］，其中食用菌 936 种［2］，药
用菌 473 种［3］。锦带花纤孔菌（Inonotus weigelae T.
Hatt. & Sheng H. Wu），隶属于锈革孔菌科（Hymen-
ochaetaceae），纤孔菌属（Inonotus），广泛分布于我国
贵州、湖北、湖南、浙江等地，主要寄主为多种阔
叶树的活立木或倒木［4］。作为一种白腐真菌，锦带
花纤孔菌是重要的药用资源，具有抑肿瘤、抗氧化
等多种功效［5］。
抗氧化能力是指对机体内氧化物质的清除能力，
而生物体中有氧化作用的物质主要有超氧阴离子、
羟自由基及过氧化氢等，由于其性质较不稳定，极
易攻击机体内细胞和体液中的生物大分子 DNA、脂
类和蛋白质等［6，7］。在微生物细胞中，机体主要通
过两种途径进行抗氧化作用及自我调节。一种为预
防性抗氧化途径，主要是通过分解过氧化物、阻断
氧化链或去除起催化作用的金属离子以达到保护机
体的目的。此途径主要涉及一些细胞内的自由基清
除剂，包括超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，
SOD）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）、过氧化氢
酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（Gluta-
thione peroxidase，GPX）、谷胱甘肽还原酶（Gluta-
thione reductase，GR）、谷胱甘肽转移酶（Glutathione
transferase，GST）、一些维生素、氨基酸和金属蛋
白等［8-10］；另一种为即时性抗氧化途径，主要通过
抗 坏 血 酸（Ascorbic acid，AA， 维 生 素 C）、 生 育
酚（维生素 E）、没食子酸（Gallic acid）和一些酚
类物质等清除一个或多个自由基，避免机体脂质过
氧化［11，12］。
目前已有大量研究报道了药用真菌的抗氧化
活性。Kan 等［13］通过响应面设计优化了亮盖灵芝
（Ganoderma lucidum）多糖的产量，当提取时间、提
取 温 度 和 水 样 比 分 别 为 137 min、66℃ 和 35 mL/g
时，多糖产量为 2.44%，比热水提取时增加了 2.0%。
Xu 等［14］探索了不同脂肪酸、表面活性剂和有机溶
剂等对桦纤孔菌（Inonotus obliquus）分泌多糖能力
及其抗氧化活性的影响，得到 Tween 80 可显著提
高菌株多糖的抗氧化活性。Zhang 等［15］发现利用
超声波辅助提取可明显增强火木层孔菌（Phellinus
igniarius）分泌多糖的能力及其抗氧化活性。程鑫颖
等［16］对瓦宁木层孔菌（Phellinus vaninii）中的多酚
和黄酮类成分进行了分离，并研究了其清除自由基
的能力。Luo 等［17］利用响应面设计优化了鲍姆桑黄
（Sanghuangporus baumii）菌丝体的多糖产量，并测
定了多糖的单糖组成及抗氧化活性。钱骅等［18］证
实了桑黄（Sanghuangporus sanghuang）子实体分泌
的多糖、黄酮和多酚类物质均具有抗氧化活性。
然而，大多数研究均集中于灵芝、桦纤孔菌、
桑黄等少数模式菌株，缺乏对新资源的探索。鉴于
锦带花纤孔菌也是一种药用真菌，与上述多种模式
菌株在系统发育关系上十分相近［19］，因此，本研究
主要是将锦带花纤孔菌进行液体培养，测定其在此
过程中的菌丝体生物量和漆酶活性变化，并评价体
外抗氧化活性，从而为该种真菌进一步的药理研究
及开发利用奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 锦带花纤孔菌（Inonotus weigelae）
菌株 Dai 15768，采自于重庆市金佛山森林公园的锦
带花（Weigela sp.）死树上，经分离纯化获得，现保
藏于北京林业大学微生物研究所。
1.1.2 试剂 2，2’- 连氮 - 双（3- 乙基苯并噻唑 -6-
磺酸）（2，2’-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulp-
honic acid），ABTS）、福林 - 酚（Folin-Ciocalteu）试
剂、3，5- 二 硝 基 水 杨 酸（3，5-dinitrosalicylic acid，
DNS）和 1，1- 二苯基 -2- 三硝基苯肼（1，1-diphenyl-
2-picrylhydrazyl，DPPH） 购 自 Sigma ； 丙 二 醛
（Malonaldehyde，MDA）测定试剂盒、SOD 测定试剂
盒和总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）
测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所 ；其他试
剂为分析纯。
1.1.3 培养基 固体培养基 ：葡萄糖 20.0 g/L，酵
母 浸 粉 5.0 g/L， 琼 脂 粉 20.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，
MgSO4·7H2O 0.5 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05 g/L，pH 自
然，1×105 Pa 高压灭菌 30 min，待指温可触时加入
终浓度为 0.01 g/L 已过滤除菌的维生素 B1，充分混
匀备用。
液体培养基：葡萄糖 20.0 g/L，酵母浸粉 5.0 g/L，
KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，ZnSO4·7H2O
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.9142
0.05 g/L，pH 自然，1×105 Pa 高压灭菌 30 min，待
指温可触时加入终浓度为 0.01 g/L 已过滤除菌的维
生素 B1，充分混匀备用。
1.2 方法
1.2.1 活 化 及 培 养 于 固 体 平 板 培 养 基 上 活 化，
28℃恒温培养箱培养 10 d 备用。
1.2.2 种子发酵及液体培养 取 250 mL 三角瓶分装
100 mL 液体培养基，接种 5 个直径 1 cm 菌饼，于
摇床 28℃、150 r/min 振荡培养 9-10 d。内切式匀浆
机将种子发酵菌液制成悬液，充分振荡，以 5.0%（体
积比）的接种量加入含 100 mL 液体培养基的 250
mL 三角瓶中，于摇床 28℃、150 r/min 振荡培养，
设 3 个重复。
1.2.3 样 品 制 备 每 2 d 取 样， 将 整 瓶 培 养 物 抽
滤，所得菌丝球经去离子水冲洗数次，于烘箱 65℃
烘干至恒重后称重，计算菌丝体生物量。培养液经
12 000 r/min 离心 20 min，上清液一部分用于测定培
养液 pH，一部分用于测定还原糖含量、漆酶活性、
多酚含量、MDA 含量、SOD 活性、T-AOC 和 DPPH
自由基清除能力。
1.2.4 还原糖含量测定 采用 DNS 法测定还原糖含
量［20］。
1.2.4.1 DNS 试剂配制 称取 3.15 g DNS 溶于 500.0
mL 去离子水中，搅拌 5 s，水浴至 45℃。后加入
100.0 mL 0.2 g/mL 氢氧化钠溶液，期间不断搅拌，
直到溶液清澈透明。再逐步添加 91.0 g 四水酒石酸
钾钠、2.5 g 苯酚和 2.5 g 无水亚硫酸钠，45℃水浴加
热，补加 300.0 mL 去离子水，期间不断搅拌，直至
加入的物质完全溶解，冷却至室温后用去离子水定
容至 1.0 L，室温下避光保存 7 d 后备用。
1.2.4.2 标 准 曲 线 制 作 准 确 配 制 0.1、0.2、0.3、
0.4、0.5、0.6 和 0.7 mg/mL 葡萄糖标准液。分别吸
取上述葡萄糖标准液 0.5 mL 于 8 支 20 mL 具塞刻
度试管中，加入 1.5 mL DNS 试剂，摇匀后沸水浴 5
min，取出冷却后用去离子水定容至 20.0 mL，充分
混匀。于 540 nm 处测定吸光值，设 3 个重复，求
平均值。以反应体系中葡萄糖标准品的浓度为横坐
标、吸光值为纵坐标作标准曲线，计算回归方程为：
y=0.057 6x-0.013 6，相关系数 r2=0.997 1。
1.2.4.3 样品还原糖含量测定 取 0.5 mL 离心后的
上清液，加入 1.5 mL DNS 试剂，摇匀后沸水浴 5
min，取出冷却后用去离子水定容至 20.0 mL，按制
作标准曲线的方法进行还原糖含量测定。以去离子
水替代上清液同体积的反应混合液为对照，还原糖
含量以培养液中葡萄糖当量计。
1.2.5 漆酶活性测定 3.0 mL 反应体系中，含 1.95
mL 柠檬酸 - 磷酸盐缓冲液（pH5.0）、50.0 μL 上清
液 和 1.0 mL 1.0 mmol/L ABTS，25℃ 反 应 3 min 后，
于 420 nm 处测定吸光值，以去离子水替代上清液同
体积的反应混合液为对照［21］。定义 1 min 内催化氧
化 1 μmol ABTS 所需的酶量为 1 个酶活力单位（U），
设 3 个重复，求平均值。已知 420 nm 处 ABTS 摩尔
消光系数 ε420=3.6×10
4 L/（mol·cm）。
1.2.6 多酚含量测定 采用 Folin-Ciocalteu 法测定多
酚含量［22］。
1.2.6.1 标准曲线制作 准确配制 0.08 g/L 没食子
酸标准液。分别吸取上述没食子酸标准液 0、0.1、
0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 和 0.7 mL， 加 入 0.3 mL 1.0
mol/L Folin-Ciocalteu 试 剂， 避 光 放 置 8 min， 再 加
入 0.6 mL 10%（质量体积比）Na2CO3 溶液，混匀
后室温下避光反应 30 min，用去离子水定容至 5.0
mL，于 750 nm 处测定吸光值。设 3 个重复，求平
均值。以反应体系中没食子酸标准品的浓度为横坐
标、吸光值为纵坐标作标准曲线，计算回归方程为：
y=0.235 0x-0.183 0，相关系数 r2=0.996 8。
1.2.6.2 样品多酚含量测定 取 5.0 mL 离心后的上
清液，加入等体积的乙酸乙酯，重复萃取 3 次后，
萃取液合并浓缩定容至 5.0 mL［23］，按制作标准曲线
的方法进行多酚含量测定。以去离子水替代上清液
同体积的反应混合液为对照，多酚含量以培养液中
没食子酸当量计。
1.2.7 MDA 含量测定 采用南京建成生物工程研
究所试剂盒测定。原理 ：过氧化脂质降解产物中的
MDA 可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在
532 nm 处有最大吸收峰，以此可测定样品中 MDA
的含量。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。
1.2.8 SOD 活性测定 采用南京建成生物工程研究
所试剂盒测定。原理 ：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶
反应系统产生超氧阴离子，后者氧化羟胺形成亚硝
2016,32(9) 143孟歌等 ：锦带花纤孔菌液体培养过程中的抗氧化活性
酸盐，加入显色剂后显紫红色，在 550 nm 处有最大
吸收峰。当样品中含 SOD 时，则会以超氧阴离子为
底物进行氧化，使形成的亚硝酸盐减少，得到的吸
光值低于对照管的吸光值，以此可测定样品中 SOD
的活性。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。定义
1.0 mL 样品中使超氧阴离子的抑制率达 50% 时所需
的样品量为 1 个 SOD 活力单位（U）。
1.2.9 T-AOC 测定 采用南京建成生物工程研究所
试剂盒测定。原理 ：机体中有许多抗氧化物质，能
使 Fe3+ 还原成 Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固
的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。
具体操作步骤按试剂盒说明书进行。定义在 37℃下
1.0 mL 样品 1 min 内使反应体系的吸光值每增加 0.01
所需的样品量为 1 个 T-AOC 单位（U）。
1.2.10 DPPH 自由基清除能力测定 DPPH 自由基
清除能力测定参照 Brand-Williams 等［24］的方法并稍
作改动。
准确称取 20.0 mg DPPH，用无水乙醇溶解并定
容至 250 mL，得到 2.0×10-4 mol/L DPPH 溶液。吸
取 2.0 mL 上清液及 2.0 mL 2.0×10-4 mol/L DPPH 溶
液加入同一具塞试管中，充分摇匀，避光反应 30
min 后于 517 nm 处测定其吸光值 A 样品，同时测定
2.0 mL 2.0×10-4 mol/L DPPH 溶液与 2.0 mL 无水乙醇
混合液的吸光值 A 空白。设 3 个重复，求平均值。根
据下列公式计算样品对 DPPH 自由基的清除率 ：清
除率 =（1-A 样品 /A 空白）×100%，其中，A 样品为添加
样品后 DPPH 溶液的吸光值 ；A 空白为未添加样品时
DPPH 溶液的吸光值。
1.2.11 统计分析 所得结果以 x-±s 表示。利用 SP-
SS 20.0 软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA）、
t- 检验和 LSD 检验。
2 结果
2.1 生物量和pH
为探索锦带花纤孔菌在液体培养过程中的生长
变化，连续 14 d 对其菌丝体生物量进行了测定。结
果（图 1）显示，在液体培养过程中，前 12 d 内锦
带花纤孔菌的菌丝体生物量随着培养时间的增加而
增长，其生长曲线呈“S”型，表现出典型的适应期、
对数生长期和缓慢期。前 2-6 d 生长较缓慢，菌丝
体表面致密光滑，形态饱满 ；6-12 d 迅速增长，期
间菌株开始分泌酚类等小分子物质，并伴有色素产
生，出现黄褐色；到第 12 天生物量达到最大值（0.12
g），此后呈下降趋势，菌丝体开始凋亡，出现自溶
现象。
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0 2 4 6 8 10 12 14 16ษޫᰦ䰤/d㧼эփ⭏⢙䟿/g
图 1 锦带花纤孔菌液体培养过程中菌丝体生物量的变化
锦带花纤孔菌液体培养过程中的 pH 变化（图 2）
显示，接种后培养液 pH 为 5.13，随着培养时间的
增加，pH 上升，尤其是第 6 天，pH 达到 5.71，可
能是由于此时的菌株生长旺盛，可降解利用培养基
中大量的有机物，例如，糖类等大分子物质被分解
为各种小分子物质，因而造成 pH 较高。而第 6 天
后 pH 下降，源于经过一段时间的积累，菌株分泌
的酸性次级代谢产物增加，进而使得环境中 pH 下降。
随后，pH 在第 10 天后又呈增长趋势，可能是由于
此时的菌株开始启动自身的抗氧化机制，使得代谢
活动较为频繁。但总体而言，锦带花纤孔菌液体培
养过程中的 pH 变化较小。
5.0
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
0 2 4 6 8 10 12 14 16ษޫᰦ䰤/dpH
图 2 锦带花纤孔菌液体培养过程中 pH 的变化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.9144
2.2 还原糖含量
如图 3 所示，锦带花纤孔菌在液体培养过程中
的还原糖含量变化较小。接种后，初始还原糖含量
为 41.28 mg/mL。前 4 d 呈增长趋势，这可能是由于
液体培养基经过高温灭菌后，如酵母浸粉等物质被
降解为单糖，这就为锦带花纤孔菌菌株的生长提供
了充足的碳源，同时也为菌丝体合成各种酶类和分
泌次级代谢产物提供了相应的能源，使得还原糖含
量在第 6 天时呈下降趋势。随着培养时间的增加，
该菌株逐渐分泌大量降解酶类，可更快地分解利用
培养基，为还原糖的合成提供了基物，使得其合成
量超过了消耗量，因此在第 10 天出现最大值，达
68.33 mg/mL。此后，由于各种物质的积累和周围环
境的变化，使得菌株启动自身的抗氧化机制，需要
消耗大量营养物质，造成还原糖的消耗量远远超过
合成量，呈现明显的下降趋势。
其自身的生长状况密切相关。
2.5 丙二醛含量（MDA）
本研究对锦带花纤孔菌液体培养过程中 MDA
的含量变化进行了测定，结果（图 6）显示，前 4 d
内 MDA 含量迅速上升，这可能是由于菌株在液体培
养过程中受到了来自环境压力下的氧化胁迫，处于
适应阶段 ；随后，机体开始启动自身的抗氧化机制
以抵抗外界的氧化损伤，表现在 MDA 含量的降低
上 ；从第 8 天开始，MDA 含量与菌丝体生物量、漆
酶活性、多酚含量和还原糖含量的变化一致，均呈
现上升趋势后缓慢下降，表明氧化胁迫既可以激发
35
40
45
50
55
60
65
70
75
0 2 4 6 8 10 12 14 16ษޫᰦ䰤/d䘈৏㌆ਜ਼䟿/mg·mL-1 
图 3 锦带花纤孔菌液体培养过程中还原糖含量的变化
2.3 漆酶活性
本研究对锦带花纤孔菌液体培养条件下的漆酶
活性进行了测定。结果（图 4）显示，由于营养利
用与生理代谢相互依存，使得漆酶活性的变化趋势
与菌丝体生物量基本一致，都是前期稳步增长，到
第 12 天出现最高峰（0.25 U/mL），此后又开始降低。
2.4 多酚含量
如图 5 所示，锦带花纤孔菌在液体培养过程中
的多酚含量变化与菌丝体生物量及漆酶活性的变化
趋势基本一致，都是随着培养时间的增加而增长，
尤其是在 6-8 d 内迅速上升，到第 12 天时达到最大
值（4.70 mg/mL），这表明该菌株分泌多酚的能力与
-0.05
0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0 2 4 6 8 10 12 14 16ษޫᰦ䰤/d┶䞦⍫ᙗ/U·mL-1 
图 4 锦带花纤孔菌液体培养过程中漆酶活性的变化
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16ษޫᰦ䰤/dཊ䞊ਜ਼䟿/mg·mL-1 
图 5 锦带花纤孔菌液体培养过程中多酚含量的变化
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16ษޫᰦ䰤/dMDAਜ਼䟿/nmol·L-1 
图 6 锦带花纤孔菌液体培养过程中 MDA 含量的变化
2016,32(9) 145孟歌等 ：锦带花纤孔菌液体培养过程中的抗氧化活性
菌株自身的抗氧化能力，又通过不断的代谢反应产
生多种自由基，以维持生物体代谢机能的动态平衡。
2.6 超氧化物歧化酶（SOD）活性
如图 7 所示，前 6 d 内，锦带花纤孔菌在液体
培养过程中的 SOD 活性从初始的 1.64 U/mL 减少至
1.59 U/mL，这可能是由于菌丝球经过匀浆后有损伤
和破碎，受到的氧化胁迫压力较大，致使分泌 SOD
的能力下降 ；随后，SOD 开始迅速增长，到第 14 天
可达到 1.89 U/mL，表现出一定的优势，说明菌株已
适应环境，并启动自身的抗氧化机制，以抵御外界
的损害。
1.55
1.60
1.65
1.70
1.75
1.80
1.85
1.90
1.95
0 2 4 6 8 10 12 14 16ษޫᰦ䰤/dSOD⍫ᙗ/U·mL-1 
图 7 锦带花纤孔菌液体培养过程中 SOD 活性的变化
2.7 总抗氧化能力（T-AOC）
锦带花纤孔菌液体培养过程中 T-AOC 的变化
如图 8 所示，前 8 d 内，T-AOC 几乎无变化，说明
菌株处于适应环境阶段，并通过分泌各种自由基为
合成次级代谢产物做准备。从第 8 天开始，T-AOC
迅速上升，说明在氧化胁迫的刺激诱导下，菌株通
过启动自身的抗氧化机制以抵抗外界的损害，这与
SOD 活性的变化趋势一致 ；同时，也促进机体合成
大量抗氧化酶和抗氧化物质，包括漆酶和多酚在内，
进而导致机体微环境中氧含量的减少和局部氧化胁
迫的减轻。但相对而言，该锦带花纤孔菌菌株的抗
氧化能力较强，第 14 天可达到 93.12 U/mL。
2.8 DPPH自由基清除能力
为评价锦带花纤孔菌在液体培养过程中的抗氧
化活性，对其清除 DPPH 自由基的能力也进行了探
索，结果（图 9）显示，培养初期，锦带花纤孔菌
对 DPPH 自由基的清除率可达到 78.56%，随着培养
时间的增加，该菌株对 DPPH 自由基的清除能力稍
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10 12 14 16ษޫᰦ䰤/dT-AOC/U·mL-1 
图 8 锦带花纤孔菌液体培养过程中 T-AOC 的变化
稍下降，但在第 6 天时清除率仍可达 75.58%，可能
是由于此阶段的菌株生长较为旺盛，各种代谢功能
都较强，致使其对自由基的清除能力也处于高峰时
期。从第 6 天起，菌株对 DPPH 自由基的抑制作用
开始迅速下降，这是因为到了培养后期，菌株的生
长代谢能力下降，甚至出现自溶现象，其自身的抗
氧化能力也相应降低，但在第 14 天时对 DPPH 自由
基的清除率仍达到 52.81%，进一步说明该锦带花纤
孔菌菌株的抗氧化能力较强。
50
55
60
65
70
75
80
85
0 2 4 6 8 10 12 14 16ษޫᰦ䰤/dDPPH㠚⭡ส␵䲔⦷/%
图 9 锦带花纤孔菌液体培养过程中 DPPH 自由基清除能
力的变化
3 讨论
氧 自 由 基（Reactive oxygen species，ROS）， 又
称活性氧，主要包括超氧阴离子、羟自由基及有机
过氧化物自由基等。在正常代谢过程中机体可产生
ROS，而一些外界环境因素会增加细胞中 ROS 的浓
度，如若不及时清除以恢复平衡，就会引起生物膜
的过氧化损伤，甚至造成细胞器的损害和 DNA 与蛋
白质等的降解与失活［25，26］。因此，锦带花纤孔菌作
为一种潜在的药用真菌，研究其抗氧化活性就显得
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.9146
尤为重要。
相 对 于 同 期 培 养 的 绒 毛 栓 孔 菌（Trametes
pubescens）而言，锦带花纤孔菌的长势相对较慢，
且培养过程中分泌大量色素，后期培养液呈现棕褐
色［27］。随着培养时间的增加，培养液的 pH 先升高
后下降再升高，呈波浪式变化，但总体而言 pH 变
化较小，这些变化与锦带花纤孔菌菌株的次级代谢
产物积累、营养物质利用、胞外酶分泌及抗氧化机
制启动等密切相关。次级代谢产物积累会导致 pH
下降，抑制菌丝体生物量的增加，但迫于环境的压力，
自身的抗氧化系统活动频繁，又使得 pH 上升。漆
酶是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶
家族，可降解木质纤维素类化合物，其活性大小可
以衡量出菌株对营养物质的利用能力［28］。在降解木
质素的过程中，漆酶可触发启动一系列的自由基链
反应，同时将有机物氧化成多种自由基，而这些自
由基作为基物在一定程度上能够促使菌株启动自身
的抗氧化机制以抵抗外界环境的变化，说明漆酶活
性的大小也可以间接反映出菌株的抗氧化能力［29］。
因此，若以收获菌丝体为目的进行液体培养，则第
12 天是其最佳的液体种子收获期。
多 酚 含 量、MDA 含 量、SOD 活 性、T-AOC 和
DPPH 自由基清除能力直接反映锦带花纤孔菌菌株
的抗氧化活性。其中，多酚是真菌在生长代谢过程
中分泌的次级代谢产物，由一个或多个芳香环与一
个或多个羟基结合而成，是一类具有生物活性的天
然化合物，由于具有较高的羟基取代和吞噬自由基
能力，多酚表现出较强的抗氧化活性［30］。此外，大
量研究发现，多酚还可以抗感染、抗病毒、抗细菌、
抗过敏、抗出血和抑制肿瘤形成等［31］。本研究中，
锦带花纤孔菌在液体培养过程中的多酚含量随培养
时间的增加而不断增长，说明该菌株可分泌大量酚
类物质，十分有益于其清除自由基和保护机体免于
氧化损伤。MDA 作为脂质过氧化的代谢产物，其含
量可直接评估 ROS 的水平和细胞受损伤的程度［32］。
而本研究发现，锦带花纤孔菌在液体培养过程中的
MDA 含量变化趋势与菌丝体生物量、还原糖含量、
漆酶活性和多酚含量基本一致，说明脂质过氧化既
可以激发菌株自身的抗氧化能力，又通过不断的代
谢反应产生多种自由基，以维持生物体代谢机能的
动态平衡。SOD 是一种广泛存在于生物体内的金属
酶，由细胞自发或酶促反应生成，通过催化超氧阴
离子发生歧化反应，将其转变为过氧化氢和分子氧，
清除机体代谢过程中产生的过多自由基，减轻或消
除氧自由基对细胞的损伤，因此，SOD 在机体的抗
氧化系统中起着极为重要的作用［33］。T-AOC 是机体
内所有抗氧化性能的总和，也是衡量共同抗氧化系
统功能状态的综合性指标［34］。SOD 活性和 T-AOC
的变化趋势后期基本一致，都说明在氧化胁迫下，
菌株通过启动自身的抗氧化机制以抵御外界的损伤，
同时也通过分泌大量抗氧化酶来减少微环境中氧的
含量。
DPPH 是一种很稳定的自由基，其乙醇溶液显
紫色，在 517 nm 处有最大吸收峰。当有供氢能力的
抗氧化剂存在时，DPPH 的溶液颜色会变浅，吸光
值变小，据此可用于测定该物质的抗氧化活性［6］。
本研究中，锦带花纤孔菌对 DPPH 自由基的清除率
最高可达 78.56%，随着培养时间的增加，清除作用
逐渐减小，但到第 14 天时菌株对 DPPH 的清除率仍
能保持在 50% 以上，说明该锦带花纤孔菌菌株的抗
氧化活性较高。
与同期培养的药用真菌桑黄和槐生多年卧孔菌
（Perenniporia robiniophila）相比，锦带花纤孔菌在液
体培养过程中的多酚含量、MDA 含量、SOD 活性、
T-AOC 和 DPPH 自由基清除能力显著高于槐生多年
卧孔菌，略高于桑黄。
综上所述，在液体培养过程中，菌株的抗氧化
活性与对营养物质的利用情况、次级代谢产物的分
泌及胞外酶的活性有较大的相关性，营养物质利用
越充分，菌丝体生长越旺盛，生物量越大，菌株分
泌次级代谢产物和胞外酶的能力也就越强，进而其
抵抗自由基损伤的抗氧化活性也就越高［18，33］。本研
究为深入了解锦带花纤孔菌的培养特性和大批量液
体培养提供了理论指导，同时也为该菌株后续的药
理学研究奠定了基础。
4 结论
本研究通过测定锦带花纤孔菌在 14 d 液体培养
过程中菌丝体生物量、pH、还原糖含量、漆酶活性、
多酚含量、MDA 含量、SOD 活性、T-AOC 和 DPPH
2016,32(9) 147孟歌等 ：锦带花纤孔菌液体培养过程中的抗氧化活性
自由基清除能力的变化，得到该药用真菌菌株具有
较强的抗氧化活性，且这一活性与其对营养物质的
利用情况、次级代谢产物的分泌及胞外酶的活性密
切相关。
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（责任编辑 马鑫）