全 文 ：真 菌 学 报 13 ( 4) :2 7 6一 2 2 7, 1 9 9 4
A
e t a
M y
e o l叩 i e a S i n i e a
裂褶菌胞内多糖的分离纯化鉴定及其性质
李 兆 兰 李学 信
(南京大学生物系 南京 2 1 0 0 0 8 )
摘要 裂褶菌菌丝体用热水提取 , 乙醇沉淀 , s e v ag 法脱蛋白 , 逆向流水透析 , 得胞内多糖
粗品 , 经 s e p h a d e x A 一 5 0 、 s e p h a d e x G 一 2 0 0 柱层析纯化 , 得胞内多糖纯品 , 称 s p G 。 纯度
经纸层析 、 se P h a d e 二 G 一 20 。 柱层析 、 高效液相色谱分析 、 聚丙烯酚胺凝胶电泳侧定 , 结果表明
s P G 为单一均匀组分 。
s P G 水解物经纸层析 、 薄层层析分析证实它是由葡萄糖组成的一种葡聚糖结构 , s PG 的
部分水解 、酶解 、 红外光谱 、 核磁共振氢谱分析表明具有 月( 1* 3 ) , 月( l* 6 ) 糖昔键 。 凝胶 过
滤法测定 s P G 的分子量约为 10 万 。
关键词 裂褶多糖 , 口一萄聚糖 , 药用真菌 ,真菌多糖
根据 日本小松信彦教授的药理实验表明 ,裂褶多糖为免疫活性多糖 ,能提高细胞 免疫
功能 ,促进免疫球蛋白的形成 ,刺激单核吞噬细胞系统的活性 , 增强巨噬细胞的吞噬和消
化功能 , 增进迟发性皮肤变态反应 , 对荷瘤鼠的巨噬细胞移动有抑制作用 , 裂褶多糖对
s a 。。 m a 一 15 0 , s a C 。 m a 一 3 7 , E h r l i s h C a r e i n o m a , Y o s h id a s a e o m a , 4 种动物实验肿瘤有明
显的抑制作用 1[’ ` · soJ
裂褶多糖与抗菌素联合使用 ,则比两药各自单独使用时疗效更高 。 它与链霉素 、庆大
霉素亦或利福平联合使用起到提高抗菌素效价 , 降低抗菌素副作用的理想效果 〔4] 。
80 年代 , 日本已将裂褶多糖试用于临床治疗一些以消化道癌为主的胃癌 、 胰腺癌及
直肠癌等 , 结果证明 ,裂褶多糖作为一个免疫治疗剂对进行性癌是有效果的 。 在对癌性胸
膜炎的治疗过程中几乎全部患者在 1一 2 个月后胸水均有淋巴细胞及巨噬细胞出现 , 虽然
胸水没有消失 ,但癌细胞变性 、 消失或明显减少 〔习。
1 材料与方法
1
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1 仪器与药品
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1一 紫外吸收光谱 ( U v ) : s p G 溶液在 D O N T R o N U v l K O N 8 6 0 紫外分析仪上 , 描记紫外吸收
光谱 ( 1 8 0一 4 0 o n m ) o
一 1 . 2 红外吸收光谱 ( I R ) : s p G 干粉用 K B r 压片 ,在 N l c o E T 1 7 0一 s x F T 型红外光谱仪上描记红
外光谱 。
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3 核磁共振氢谱 ( , H一 N M R ) : 溶剂是重水 ( D : 0 ) , 参考标准是四甲基 硅 烷 ( T M s ) , , 0 0 M H z ,
B R U K E R 核磁共振仪 。
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l
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4 比旋光度在 w z z 自动显示旋光仪上测定 。
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5 粘度 : 3% 多塘溶液在 R o “ t i o n a l v i s c o m e t e r N D J一 1 粘度计上测定 。
国家七五攻关项目。 获国家专利。
1 9 93一 0 5一 2 3 收稿 。
DOI : 10. 13346 /j . mycosystema . 1994. 04. 007
2 68真 菌 ’ 、笋 报 1 3卷
1
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6元素分析 :在 0 2 C 4兀索分析仪上分析
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7药品 : Dx e t ra n标准品 , D E A E一 S e p h a d e x A 一 5 0 均为 p h a r m a c i a 产品 。 单糖标准品为进 口或
国产生化试剂 ,其它试剂均为国产分析纯试剂 。
1
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2 菌种来源
从南京紫金山树林中采集裂褶菌 cS h i : 。 p h刃 l “ 。 ` 。 。 m “ , 巴 rF . 子实体 ,表面 消毒 ,组织分离 ,获纯
菌株 ,经出菇鉴定证实分离成功 。裂褶菌生于阔叶树或针叶林的腐木上 , 散生或群生 。菌盖宽 6一 4 2 m m ,
呈复瓦状 ,质韧 , 白至灰白色 ,上有绒毛 ,扇形或肾形 ,边缘内卷 , 具多数裂瓣 ,菌褶窄 ,从基部辐射而出 ,
沿边缘纵裂而反卷 。 抱子无色 ,圆柱形 ,光滑 。 5 · 0一 5 · 5 只 2 · 0件m 。
1
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3 深层发醉
P D A 斜面保藏菌种 ,临 用前转管话化 , 摇瓶扩大 , 5 0 皂升 、 2 0 0 0 毫升 2 级摇瓶发酵 。种子罐 4 0 立
升 ,生产罐 5吨 。 发酵终点 % 小时 , s G 葡萄糖培养基 。
1
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4 提取
发酵液用板框机过滤 , 菌丝体经热水提取 , 乙醇沉淀 , 沉淀物用乙醇洗涤数次 , 热水溶解 , 滤去杂
质 ,薄膜浓缩 , 冷冻十燥 , 获粗多糖 。
1
·
5 分离 L` 」
粗多塘溶液 S e v a g 法脱蛋日 7 次 以 L ,逆向流水透析 ,得到裂褚 多搪半纯品 。
1
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6 纯化 ,分子最测定 『’ , ”
D E A E
一 s e p h a d e x A 一 5 0 溶胀 ,浸洗 ,装柱前浸泡在 o . o l M 的 N a : H p o 。 p H S . 6 缓冲液中 ,装柱 ,柱长
7 0 e m ,直径 1 . s e m ,平衡 2 4 小时 , `巨流泵控制流速 , 0 . s m l / m i n , 上样量 2 0 m g , 缓冲液 1 p H s . 6 , 0 . 0 1
M
o l N a : H P o
。 缓冲液 2 , p H S . 4 , 0 . , M o l N a Z H p o 。 + 0 . I M o l N a C I 作梯度洗脱 , B s Z 一 1 6 0 型 白动分部收
集器进行收集 ,每管 6 m l ,收集液用酚 一硫酸法进行检测 。
采用凝胶过滤法测定分子量 , s e P h a d e x G 一 2 0 0 装填于 1 . 5 只 7 0 e m 的玻璃柱中 , 以 0 . 0 5M N a C I 平
衡 ,流速恒定至 s m l/ h r ,将各种不同的已知分子量的多糖分别相继上柱 ,上柱量各 Z m g , 用同一离子强
度的洗脱液洗脱 ,每管 3 ml 分部收集 ,苯酚一硫酸法显色 。 分别合并各流出液的体积 , 求得洗脱体积 v 。 ,
再用蓝色葡聚塘上柱 , 求得柱之空体积 v 。 , 以 v e / v 。 为纵座标 , Lo g M 为横座标 , 绘制标准曲线 。 sP G
样品按上述相同条件上柱 ,求得 v e ,根据 v 。 / v 。 查标准曲线 , 得到 sP G 的分子量 。
一 7 纯度鉴别 「’ }
2
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7
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1 纸层析 ( p p C )
取新华 l 号滤纸 ( 3 x 2 0c m ) , 距端点 l o m 处的中部点样 , 展开剂为正丙醇 : 浓氨水 : 水 ( 6 。 : :4
, ) 饱和 2 小时 ,室温展层 8 小时 ,距前沿约 1 . sc m , 取出后吹干 , 用 。 · 5% 甲苯胺蓝乙醇液染色 , 立即
用 9 . , % 乙醇漂洗至背景褪去 。
1
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7
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2 s e p h a d e x G一 2 0 0 凝胶柱层析 (申 1 . 5 X 7 o c m ) , 装柱 ,平衡 , 上样量 l o m g , 洗脱液为 o . o 5 N
N : c1
,流速为 ,一 6 m l /hr , 按每管 3 m l 体积 自动分部收集 ,酚 一硫酸法测糖含量 。
l
·
7
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3 高效液相色谱测定 ( H P L C )
K o N T R o N H p L C 斗0 0 系统 , 柱 : L C 一 7 4 0 , 5卜 , 4 . 6 m m l · D x 2 5 c m L , 检测器 2 1 5 n m , p 一 3 0 0
型记录仪 ,流动相 o . 0 5 m o l N a C I , l . o m l / m i n o
1
·
7
·今 聚丙烯酞胺凝胶电脉 ( P A G E )
分离胶浓度为 7 . 5肠 , p H S . 9 , 浓缩胶浓度为 4% , p H 6 . 8 。 电极缓冲液为 rT is 一甘氨酸系统 , p H
8
.
3 。 上样量为 。 . 2 m g ,点样体积为 1 0。闪 。 电流每管 Zm A ,澳酚蓝作指示剂 , 电泳 4 小时 ,染色液 sc ih f
试剂 。
1
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8 组成分析
l
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8
·
1 完全酸水解 〔 ` “ ’
李兆兰等 : 裂褶菌胞内多糖的分离纯化鉴定及其性质 2 6 9
取 s p2 G0 mg,加 4 N H Zs o 。 , 1 0 0℃ ,水解 8小时 ,碳酸钡中和 ,离心 ,取上清液 ,供分析用 。
1
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8
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1
.
1 纸层析 ( P C ) 以葡萄搪 、 半乳糖 、 甘露搪 、 木搪为标准塘做对照 , 展开剂正丁醇 : 冰醋酸 :
水 ~ 略: 1 : 5 ,显色剂为苯胺一邻苯二甲酸 ,室温上行 16 小时。
1
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8
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1
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2 薄层层析 ( T L C ) : 对照标准糖与纸层析相同 , 薄板制备用 0 . I N 硼酸调制硅胶成糊状 , 平
铺在玻璃板上 ( 7 . 5 x 1 c0 m , ) , 1 10 ℃ , 活化 l 小时 , 展开剂正丁醇 : 乙酸乙醋 : 异丙醇 : 乙醇 : 水 =
7 : 2 0 : 1 2 : 7 : 6 。 显色剂 :苯胺邻苯二甲酸 。
1
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8
·
2 部分酸水解川 ’
sP G 样品 1 0 m g , 0 · 9% 硫酸水解 , 1 0 ℃水解 2 小时 ,碳酸钡中和水解物 ,过滤 ,滤液浓缩 ,活性炭
柱分离 。先将活性炭用 20 % 盐酸煮沸半小时 , 然后用蒸馏水洗至中性 , 再用等量的硅藻土加水调成浆
状 , 装柱 ,巾2 X 20 o m , 平衡 3 小时 , 上样 。 先用水洗脱样品中的盐分和单塘 ,然后用 ,% , 10 % 乙醇溶
液洗脱 , 分部收集 。 酚一硫酸法显色检测 。 合并分级洗脱的管号 ,寡糖级分减压浓缩 ,乙醇沉淀 , 过滤 ,
纸层析分析 。
1
·
8
·
3 酶解 【” ’
淀粉酶 、 纤维素酶 、 蜗牛酶作用于 s P G 进行酶解 。 淀粉酶溶于蒸馏水中 , 浓度 0 . , U /m l ,加 l m l 酶
液于sP G 溶液中 ,保温 40 ℃ , 30 分钟 , 酶解液测糖 Q 纤维素酶浓度 。 . S U /m1 , 保温 40 ℃ , 30 分钟 。 蜗
牛酶 3肠 ,保温 34 ℃ , 4小时 , 用 D N s 法测还原糖 。
2 实验结果
.2 1 提取
菌丝体经热水提取 ,提取液浓缩 ,乙醇沉淀 , 脱蛋白 ,透析 、 沉淀 , 获胞内粗多糖 , 呈白
色纤维状 ,冷冻干燥呈海绵状。
.2 2 分离纯化
粗多糖经 D E A E 一 S e P h a d e x A 一 5 0 柱层析 ,
梯度洗脱 , 分部收集 , 收集液经酚一硫酸法检测 ,
以管号对光密度作图 (图 l) 呈一洗脱峰 , 洗脱
体积高峰为 3 42 m l 。 合并含有胞 内 多糖 的 管
号 ,减压蒸馏 ,浓缩到最小体积 , 再经 S eP h a d e x
G
一 2 0 进行第 2 次纯化 ,得胞内多糖纯品 ,称作
S P G
。
.2 3 纯度鉴定
纸层析 : 层析完毕 ,纸条吹干 , 用 95 务 甲
苯胺蓝乙醇液染色 , 95 外乙醇漂洗背景 ,显示单
一斑点 ,呈海蓝色 。
0刀 礴9 0。厂飞
0
.
7
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幻. 2
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.
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不一 三。 ` 0 5。 ` 6 0 7 0 。。 Lo b。 如
图 l 粗多糖在葡聚糖凝胶 A 一 50 柱 上 层 析
F i g一 P u r i f i e a t i o n p r o f i l e o f e r u d e
P o l y s a c c h a r i d e o n a S e P h a d e x A
一
50 c o l u m n
凝胶柱层析 : 收集液经酚 一硫酸法检侧 ,以管号对光密度作图 ,为单一对称吸收峰 ,洗
脱体积范围为 30 ~ 60 m l , 洗脱体积高峰在 45 m lo
高效液相色谱 : S P G 经高效液相色谱测定呈单一对称吸收峰 。 聚丙烯酞胺凝 胶 电
泳呈单一带 。
.2 4 组成分析
完全酸水解经纸层析 、 薄层层析分析 , 在层析纸上及薄层上 , S P G 的水解物 R f 与标
真 菌 学 报 1 3卷
准糖— 葡萄糖的 R f值相同 ,表明 S P G 是由葡萄糖组成的一种葡聚糖结构S P G 的部分酸水解物经纸层析 、 薄层层析结果表 明有龙胆二糖 、 昆布二糖 ,提示胞 内
多糖有 夕( 1 * 6 ) 搪营键 ,月( 1 、 3 ) 糖营键 。
酶解试验结果 ,证实 S P G 不能被淀粉酶 、 纤维素酶水解 ,提示无 a( 1一 钓及 风 1” 的
糖昔键 ,但能被蜗牛酶水解 ,表明有 烈 1 ” 3 ) 糖普键 。
.2 5 分子 t
采用凝胶过滤法 ,测得 S P G 的分子量为 10 万 。
2.6 光谱分析
紫外吸收光谱 ( U V ) : 紫外光谱分析具末端吸收 , 未发现核酸吸收峰 ( 2 60 一 2 9 0n m )
及蛋白质吸收峰 ( 2 5 0一 3 0 0 n m ) 。 (图 z )
a b写 P已 a k 刀e t . : 卜 。 n
诩 瓦一一 一 一 }
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L、、 、.、、、℃
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仁了
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C
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0门口仁 _ _ _ _
!邵口
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了三5 2 , 0 3 4亏 4口口, n
图 2
F i g
.
2
S P G 的紫外光谱
于高浓度的乙醇 、
s P e c t r u m o f S P g
乙醚 、 丙酮 ,
红外吸收光谱 ( IR ) : 分析图谱显示 3 2 0 0一
3 6 O0 o m 一 ` 出现一种宽峰是 O 一 H 的伸缩振动 ,
2 8 0 0一 3 0 0 0 “ m 一 , 的一组峰是糖 类 C 一 H 伸 缩
振动 ,在这区域的吸收峰是糖类的特征吸收峰 , -
12 0 0 ~ 1 4 0 o c m 一 ` 的吸收峰是 C 一 H 的变 角 振
动 。 8 9 o C m一 , 处有一吸收峰 , 是毗 喃 糖 产型
C 一 H 变角振动的特征吸收峰 , 吠喃糖是不会有
这种吸收峰的 。 (图 3)
核磁共振氢谱 ( `H 一 N M R ) (图 4 ) :
S P G 的核磁共振氢谱中 C 、 质子 区 的 信
号峰在 5 . OP P M 以下 , 表明 S P G 是 户糖营
键 。
.2 7 性状
S P G 为白色 、 纤维状 、溶于水 ,粘绸 。 不溶
乙酸乙醋等有机溶剂中 , p H 中性 。 S P G 的比旋 度 为
1…七 / /一 \{\ \ / { _ 八 夕
! 、 j、 / 丫\厂/ : { ` \了
} \ / 、 {` 又 / {洲
仁 丁 — 一 一布一— 一~ 一洲 - 一一~ 一一一~ 飞~ 一一一一一~ 一飞一一一` 一~ 户一 ~ 一「 乙四 万知 曰 乙月 i 扣口 翻县 `叨
图 3 S P G 的红外光谱
F 19
.
3 1
.
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.
s p e c 仁 r u m o f S P g
4期 李兆兰等 :裂褶菌胞内多糖的分离纯化鉴定及其性质
2 0卜g / 口 L
~-一 ~一门一一 , 一 -尸一 , 一 - , 一一 r 一 ’ 一 ~一 ; -一 飞 一 T -
图 4 s PG 的核磁共振氢谱
F i g
.
4 H一 N M R o f S P G
加〕合~ + 12 . 5“ 。 3多 溶液其粘度为 2 0 0 0厘泊 。 元素分析 : C : 42 . 6 , H : 6 . 64 。 显色反 应 :
葱酮试剂反应呈蓝绿色 ,苯酚 一硫酸试剂反应呈红色 , a 一蔡酚试验呈紫红色 。
3 讨论
本研究制备的胞内多糖经北京医科大学林志彬教授的药理实验表 明 , 胞内多糖能促
进 C on A 诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应 ,还显著地对抗氢可的松对淋巴细胞增殖反应的
抑制作用 , 胞内多糖可恢复 14 月龄老年小鼠低下的脾淋巴细胞的增殖反应 , 能明 显 增
强二硝基氯苯 (D N C B ) 所致小鼠迟发型皮肤过敏反应 ( D C H ) 。 可显著增强羊红 细 胞
( SR B C ) 诱导的小鼠脾脏空斑形成细胞 ( P F C ) 反应 , 胞内多糖还可使老年小鼠的 P F C
反应恢复到成年小鼠的水平 。 S P G 可恢复老年动物低下的细胞免疫及体液免疫功能 , 提
高老年小鼠抗体形成细胞的数 目 ,提示对延缓衰老有一定的意义 【` 3] 。
参 考 文 献
, .曰ō井J, .苦.1J.,1.
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主13 )
N o b u il i k o K o m a t s u
.
G a n 称 , 19 6 9 , 60 : 1 3 7一 1 44 .
M
o t o
i i S
u z u k i
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N o b u h i k o K o m a t s u
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K e l i k o M
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2 72真 菌 学 报 1 3卷
I S OL AT ION
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P U R I F IC A T IO N A D N I D E N T IF IC A T IO N
O F S C H IZ O P H Y L L A N
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h o t w a t e r
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S P G h a s b e e n i s o l a t e d a n d P u r i f i e d t h r o u g h D E A E
一
S e P h a d e x A
一
5 0
,
S e P h a d e x G
一 2 0 0
f r o m t h e w a t e r s o l u b l e p o l y s
a e e h a r id e m i x t u r e e x t
r a e t e d f r o m m y e e l i a o f s c h i之 o P h y -
l l u解 c o娜 m “ n o F r . T h e P u r i t y o f S P G w a s id e n t i f i e d b y u s i n g t h e t e c h n iq u e s o f
P C
,
H P L C
,
S e Ph a d e x G
一 2 0 0 e o l u 瓜 n e h r o m a t o g r a p h y a n d P o l y a e r y l a m i n e g e l e l e e t r o -
p il o r e s i s
.
t h e r e s u l t s `h o w e d t h a t t h e S PG t o b e a u n iq u e , h o m o g e n e o u s e o m P o n e n t s .
T h e r e s u l t s o f c o m P l e t e o r p a r t i a l a e i d h y d r o l y s i s
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S P G 15 a s im p l e g l u e a n e o n s i s t i n g o f 夕一 l , 3 a n d 夕一 1 , 6 一 g l u c o s i d i c l i n k a g e s . T h e m o -
l e e u l a r w e i g h t o f S P G 15 a b o u t 1 0 0 0 0 0
.
K E Y W O R D S S
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z o p h y l l a n
, 口一 g l u c a n , M e d i e i n a l f u n g i , F u n g a l p o l y s a c e h a r id e