全 文 ：乌头散的抗肿瘤活性研究
郑 蕾，古米兰·司迪克，张彦民*
(西安交通大学医学院，陕西 西安 710061)
摘要 目的:通过体外细胞增殖检测试验，观察乌头散中药材不同提取物对 5 种肿瘤细胞生长的抑制作用。
方法:选用肝癌细胞系(SMMC7721)、乳腺癌细胞系(MCF7)、肺癌细胞系(A549)、宫颈癌细胞系(Hela)和胃癌细胞
系(SGC7901)5 种肿瘤细胞系，以 MTT法观察生川乌、制川乌、黄柏 3 种药材水提物及 70%醇提物对肿瘤细胞生长
的抑制作用，对药材的提取物进行联合应用，筛选获得具有协同抗肿瘤效果的药物配伍。结果:生川乌、制川乌、黄
柏 70%醇提物以及黄柏水提物对 A549 和 Hela具有明显的抑制生长作用，并呈明显量效关系;通过比较细胞增殖
抑制率以及计算联合作用指数，筛选得到了黄柏和乌头两者的最佳协同作用配比。结论:生川乌、制川乌、黄柏的
醇提物和黄柏的水提物，对 A549 和 Hela细胞具有明显的生长抑制作用，川乌与黄柏联合用药能够对宫颈癌细胞
Hela增殖起到协同抑制作用。
关键词 乌头散;抗肿瘤;细胞增殖检测;协同作用
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)08-1301-04
收稿日期:2013-01-04
基金项目:国家“十二五”重大新药创制专项子课题(2011ZX09401-308-031)
* 通讯作者:张彦民，E-mail:zhang2008@ mail. xjtu. edu. cn。
Study on Antitumor Effect of Wutousan
ZHENG Lei，GU-milan·SIDIKE，ZHANG Yan-min
(School of Medicine，Xian Jiaotong University，Xian 710061，China)
Abstract Objective:To screen the active extracts from three traditional Chinese medicines. Methods:Five traditional Chinese
medicines including Unprocessed Aconiti Ｒadix，Aconiti Ｒadix Cocta，Phellodendri Chinensis Cortex were extracted with 70% alcohol or
water respectively. The cell proliferation effect of these extracts was tested with MTT assay in SMMC7721，MCF7，A549，Hela and
SGC7901. Ｒesults:The 70% alcohol extract of Unprocessed Aconiti Ｒadix，Aconiti Ｒadix Cocta，Phellodendri Chinensis Cortex dis-
played remarkable inhibitory effect in the A549 and Hela in a dose-dependent manner. Conclusion:The alcohol extract of Unprocessed
Aconiti Ｒadix，Aconiti Ｒadix Cocta，Phellodendri Chinensis Cortex and the water extraction of Phellodendri Chinensis Cortex present ob-
viously inhibitory effect in both A549 and Hela. The combination of Aconiti Ｒadix with Phellodendri Chinensis Cortex has synergistic in-
hibitory effect on Hela.
Key words Wutousan;Anti-cancer;Proliferation;Synergistic effect
近年来，肿瘤的发病率和死亡率在全世界范围
内呈持续上升趋势，给人类的生命造成了极大威胁，
因此寻找有效治疗各类肿瘤药物的研究已成为一大
热点〔1〕。中医中药历史悠久，随着科学技术的发
展，我国的抗癌中草药研究正在向多层次、多方位的
研究领域深入发展。中药复方是中医药防治疾病的
主要手段〔2〕。近些年来，从中医古医书记载、民间
验方和中医治癌临床实践中寻找治疗肿瘤的有效药
物受到广泛的注意和重视。乌头散源自《医心方》
卷十六引《古今录验》，由乌头一两、黄柏二两组成，
方中乌头辛温，祛风除湿，散结消肿;黄柏苦寒，清热
燥湿，泻火解毒，二味合用具有清热解毒、燥湿消肿
之效，主治鼠瘘及痈疮属湿热者。笔者运用四甲基
偶氮唑盐(MTT)酶还原法进行细胞毒性检测试验，
考察了乌头散中药材体外的抗肿瘤药效。
1 材料与仪器
1. 1 细胞株 肝癌细胞株 SMMC7721、乳腺癌细胞
株 MCF7、肺癌细胞株 A549、宫颈癌细胞株 Hela、胃癌
细胞株 SGC7901均购自中国科学院上海生命科学研
究院细胞资源中心。37 ℃、含5% CO2 的培养箱内进
行培养。
1. 2 药物与试剂 生川乌、制川乌、黄柏均购自西
安市万寿路药材市场，经西安交通大学牛晓峰副教
授鉴定为正品;MTT(Sigma公司) ;胎牛血清(兰州民
海生物工程有限公司) ;胰蛋白酶(美国 Amersco 公
司) ;DMEM和 ＲPMI-1640培养基(美国 Gibco公司) ;
硫酸链霉素(华北制药股份有限公司) ;青霉素钠(哈
药集团制药总厂) ;胰蛋白酶(Invitrogen) ;二甲基亚
砜(DMSO) (天津市巴斯夫化工试剂有限公司) ;磷酸
二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·H2O)、
磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化钠(NaCl)、氯化钾
(KCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、盐酸、氢氧化钠等均为
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DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2013.08.027
分析纯(西安化学试剂厂)。
1. 3 主要仪器 CO2恒温培养箱(MCO-15AC，日本
SANYO 公司) ;倒置显微镜(Ti-u，日本 Nikon 公
司) ;超净工作台(SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有
限公司) ;微量移液器(Eppendorf 公司) ;酶联免疫
检测仪(680，美国 Bio-Ｒad 公司) ;便携式涡旋仪
(QL-901，海门市其林贝尔仪器制造有限公司) ;细
胞计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司) ;高压
蒸汽灭菌锅(YXQ-LS-50SⅡ，上海博迅实业有限公
司医疗设备厂) ;电子天平(上海民桥精密科学仪器
有限公司) ;96 孔培养板(美国 Costar公司) ;除菌滤
器(上海医药工业研究院)。
2 方法
2. 1 药物制备 称取生川乌、制川乌、黄柏 3 种药
材各 50 g，粉碎，一份用三蒸水提取，一份用 70%乙
醇提取。每次用 5 倍体积溶剂量提取，每份提取 3
次，将 3 次的提取液合并。用滤纸过滤药渣，再用微
孔滤膜过滤药渣粉末，滤液用旋转蒸发仪旋干。在
60 ℃真空干燥箱烘至粉末状。各提取物均用 DM-
SO超声溶解，配置成饱和溶液作为储备液，于 4 ℃
冰箱内备用。
2. 2 药物抗肿瘤有效性初筛 将处于对数生长期
的 5 种肿瘤细胞消化并计数后，用完全培养基并以
2 × 104 /孔平行接种于 96 孔板中。24 h 后每孔加入
试药 20 μL，阴性对照组则加入 20 μL 含 DMSO 的
培养基，培养 48 h。弃去培养孔板内培养液，各孔加
入无血清培养基 180 μL，然后加入 5 mg /mL MTT溶
液 20 μL /孔，于 37 ℃培养箱内孵育 4 h 后，弃去孔
内培养液，再加入 150 μL DMSO，室温振荡 15 min，
使生成的甲臜充分溶解。置于酶联免疫检测仪 490
nm波长下测定各孔光密度 D(λ)值，记录 D(λ)值，
以 D(λ)值反映细胞活性和增殖。每组平行 5 孔，
每组实验均重复 3 次。
2. 3 联合作用指数分析 采用上述 MTT方法检测
联合用药的协同抑制作用，用金正均 Q 值法可以判
断两药合用是否有协同作用〔3〕。
Q = EAB /(EA + EB － EAEB)
式中，EA、EB 为 2 种药物单独作用抑制率，EAB为联合抑
制率，Q大于 1. 15 协同，小于 0. 85 拮抗，在 0. 85 与 1. 15 之
间为相加作用。
2. 4 统计学处理 测定指标采用 珋x ± s 表示，用
Studentst 进行统计分析，计算相应的统计学参数，
组间比较采用方差分析。P ＜ 0. 05 表示差异具有统
计学意义。
3 结果
3. 1 药物抗肿瘤有效性初筛的细胞增殖实验 药
材水提物和醇提物分别对 5 种肿瘤细胞生长的抑制
作用结果如图 1 ～ 6 所示。生川乌、制川乌、黄柏的
70%醇提物以及黄柏的水提物对 A549 和 Hela具有
明显的抑制生长作用。此外生川乌的醇提物和水提
物对 MCF7 细胞也表现出生长抑制作用。从图中可
以看出，随着药物浓度的增加，细胞活力逐渐下降，
细胞的增殖受到了明显的抑制作用，且均表现出了
明显的剂量依赖性。
图 1 生川乌醇提物对肿瘤细胞的生长抑制作用 图 2 生川乌水提物对肿瘤细胞的生长抑制作用
图 3 制川乌醇提物对肿瘤细胞的生长抑制作用 图 4 制川乌水提物对肿瘤细胞的生长抑制作用
·2031· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 8 期 2013 年 8 月
图 5 黄柏醇提物对肿瘤细胞的生长抑制作用 图 6 黄柏水提物对肿瘤细胞的生长抑制作用
3. 2 联合作用指数分析计算 笔者选择了对药物
较为敏感的 Hela 细胞进行联合作用实验。联合作
用指数实验结果如表 1、2 所示，0. 35 mg /mL生川乌
与 0. 11 mg /mL 黄柏、1. 77 mg /mL 生川乌与 0. 11
mg /mL黄柏、0. 35 mg /mL生川乌与 0. 55 mg /mL黄
柏、1. 77 mg /mL生川乌与 0. 55 mg /mL 黄柏联用之
后对 Hela细胞的生长表现协同抑制，其中 0. 35 mg /
mL生川乌与 0. 11 mg /mL 黄柏联用时协同作用最
为显著。
4 讨论
目前上市的抗肿瘤药物主要是通过直接杀伤肿
瘤细胞或抑制肿瘤细胞生长、增殖的一类化学药物，
这类药物也是目前治疗恶性肿瘤的主要手段之一。
但是，药物的细胞毒性对正常细胞增长也会有抑制
作用。因此，采用不同的药物联合作用于肿瘤细胞，
可以有效地降低药物的浓度，并且提高疗效，这对减
少药物引起的副作用有很大的帮助。
表 1 黄柏与制川乌联用对 Hela的抑制率(%)以及联合作用指数
黄柏 /(mg /mL)
制川乌 /(mg /mL)
0. 33 1. 64 8. 22 41. 08
0. 11 57. 75(1. 09) 55. 23(0. 96) 51. 56(0. 61) 55. 50(0. 61)
0. 55 50. 08(0. 80) 48. 90(0. 74) 46. 54(0. 53) 62. 25(0. 67)
2. 77 79. 38(0. 95) 79. 00(0. 90) 75. 79(0. 79) 77. 67(0. 80)
13. 83 83. 79(0. 74) 82. 81(0. 74) 81. 28(0. 80) 79. 92(0. 80)
表 2 黄柏与生川乌联用对 Hela的抑制率(%)以及联合作用指数
黄柏 /(mg /mL)
生川乌 /(mg /mL)
0. 35 1. 77 8. 86 44. 32
0. 11 55. 21(2. 36▲) 60. 67(2. 06▲) 56. 25(0. 63) 63. 98(0. 61)
0. 55 59. 88(1. 55▲) 58. 50(1. 35▲) 59. 44(0. 65) 65. 91(0. 63)
2. 77 77. 71(1. 07) 74. 91(0. 95) 77. 33(0. 80) 80. 34(0. 79)
13. 83 86. 10(0. 75) 86. 68(0. 73) 85. 78(0. 83) 85. 31(0. 87)
注:▲表示 Q大于 1. 15，表现出协同作用效果的组合
乌头散具有潜在的抗肿瘤活性，通过细胞增殖
实验的考察，方中药材乌头和黄柏的提取物在不同
肿瘤细胞株上表现出明显的抑制细胞生长的作用效
果。乌头辛、苦，热;有毒，归心、肝、肾、脾经;具有祛
风除湿，温经止痛之功效，现代药理研究发现川乌具
有抗炎、扩血管、降压、镇静、强心等作用〔4，5〕。黄柏
苦，寒，归肾、膀胱、大肠经;具有清热燥湿，泻火解
毒，疮疡肿毒之功效，现代药理研究发现黄柏具有抗
炎、镇咳、降压、治疗溃疡等作用〔6，7〕。因此，笔者将
药材进行联用，研究其联合作用指数，目的在于发现
一种新的抗肿瘤组方，以期在机体整体水平上达到
有效抑制肿瘤生长的效果。
体外实验结果表明，生川乌、制川乌、黄柏的
70%醇提物以及黄柏的水提物对 A549 和 Hela具有
明显的抑制生长作用。生川乌的醇提物和水提物对
MCF7 细胞也表现出生长抑制作用。随着加入药物
浓度的增加，肿瘤细胞活力逐渐下降，细胞的增殖受
到了明显的抑制作用，且都表现出了明显的剂量依
·3031·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 8 期 2013 年 8 月
赖性。而对人肝癌和人胃癌细胞作用较弱，提示药
材虽然对抑制肿瘤细胞的增殖具有一定的广谱作
用，但对于不同癌症的疗效可能具有一定的选择性。
不同溶剂提取物差异作用的原因是由于提取得到的
化合物不同，笔者后续将会对不同提取部位的有效
成分进行进一步研究。
实验选择较低浓度的生川乌、制川乌与黄柏联
用，从结果可以看出生川乌、制川乌与黄柏联用后对
人宫颈癌细胞系 Hela抑制率均有提升，通过联合作
用指数的计算，生川乌与黄柏联用表现出了较好的
协同作用，抑制率提高明显。通过上面对联合给药
的种类和浓度的筛选，结果表明 0. 35 mg /mL 生川
乌与 0. 11 mg /mL黄柏联合作用于 Hela抑制率与单
独使用比较明显提高，表现出明显的协同作用。
综上所述，笔者认为乌头散具有显著地抗肿瘤
作用，这为后续有效成分的发现以及作用机理的研
究奠定了良好的基础。
参 考 文 献
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中药方剂 1 号对小鼠免疫功能和抗氧化能力的影响
黄治官1，马仁强2*
(1. 广州体育学院运动与健康系，广东 广州 510500;2. 广州博济医药生物技术股份有限公司，广东 广州
510663)
摘要 目的:观察中药方剂 1 号的免疫调节及抗氧化作用。方法:1、SPF 级 BALB /c 小鼠随机分为对照组(蒸
馏水)、阳性对照组(破壁灵芝孢子粉，1. 0 g /kg)及中药方剂 1 号低(0. 35 g /kg)、中(0. 70 g /kg)、高(1. 4 g /kg)剂量
组，灌胃给药 1 次 /d，持续 30 d;通过脾脏和胸腺指数、脾淋巴细胞增殖、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞、碳廓清等指
标考察中药方剂 1 号的免疫调节作用。2、SPF级 BALB /c小鼠随机分为正常对照组、模型组(D-半乳糖致过氧化损
伤)、破壁灵芝孢子粉阳性对照组及中药方剂 1 号低、中、高剂量组，给药 1 次 /d，持续 30 d;检测脑组织 SOD 活性、
MDA及 LPO含量，western blotting分析脑组织胞核 Nrf2 蛋白表达。结果:与对照组比较，中药方剂 1 号高剂量组和
破壁灵芝孢子粉组动物胸腺及脾脏指数显著升高，各给药组淋巴细胞增殖和巨噬细胞吞噬功能均显著提高;中药
方剂 1 号中、高剂量和阳性对照药能显著提高模型小鼠脑组织 SOD活性、降低 MDA和 LPO含量、增加 Nrf2 蛋白表
达，中药方剂 1 号低剂量能显著减少小鼠脑组织 MDA含量，增加 Nrf2 蛋白含量。结论:中药方剂 1 号对免疫功能
有良好的调节作用，同时可能通过调节脑组织 Nrf2 蛋白表达及其相关信号通路发挥抗氧化作用。
关键词 中药方剂 1 号;小鼠;免疫功能;抗氧化;大豆肽粉;破壁灵芝孢子粉
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)08-1304-05
收稿日期:2012-09-14
基金项目:广州市发改委资助项目 (穗发改［2012］243 号)
作者简介:黄治官(1980-) ，男，博士，讲师，主要从事运动与健康促进等研究;E-mail:zhiguan1980 @ 163. com。
* 通讯作者:马仁强，E-mail:pony213@ 163. com。
Chinese Medicine Formula 1 Ｒegulating Immunity and Anti-oxidation Experiments in Mice
HUANG Zhi-guan1，MA Ｒen-qiang2
(1. Department of Exercise and Health，Guangzhou Institute of Physical Education，Guangzhou 510500，China;2. Guangzhou Boji Me-
dicinal and Biotechnological Co. Ltd，Guangzhou 510663，China)
Abstract Objective:To observe the effect of immunoregulation and anti-oxidation of Zhongyaofangji NO1(ZYFJ). Methods:1.
SPF BALB /C mice were randomly divided into control group (distilled water) ，positive control group(Broken Spore) ，ZYFJ low dose
·4031· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 8 期 2013 年 8 月