全 文 ：江南卷柏总黄酮对 HT-29 细胞增殖及 COX-2 mRNA表达的抑制作用
孙颖桢1，2， 陈科力1* ， 刘 震1
(1.省部共建中药资源和中药复方教育部重点实验室;湖北中医药大学，湖北 武汉 430065;2.紫琅职业技术
学院生物技术系，江苏 南通 226002)
收稿日期:2009-04-14
基金项目:国家自然科学基金项目(30470193)
作者简介:孙颖桢(1983 －)，女，助教，硕士，研究方向:中药资源及其品质。Tel:15162773776 E-mail:oisunyz@ 163. com
* 通讯作者:陈科力(1947 －)，男，教授，学士，从事中药资源及其品质研究。Tel:(027)68890106 E-mail:kelichen@ 126. com
关键词:江南卷柏;总黄酮;COX-2;HT-29;RT-PCR
摘要:目的:研究江南卷柏总黄酮对环氧化酶-2(COX-2)mRNA 的抑制作用。方法:以江南卷柏总黄酮作用于人结肠癌
HT-29 细胞，应用氮蓝四唑盐实验(MTT法)计算其不同浓度、不同作用时间对细胞生长的抑制率，分析其对细胞增殖的
影响;药物设高中低剂量组和阴性对照组共 4 个组别处理细胞，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增细胞中提取的
COX-2 mRNA，用电泳凝胶成像自动分析系统检测各扩增带 COX-2 mRNA水平。结果:江南卷柏总黄酮有一定的抗肿瘤
作用，与阴性对照组比较，其可以在 mRNA水平上抑制 COX-2 的表达，且呈量效关系。结论:江南卷柏总黄酮能在 mRNA
水平上抑制 COX-2，进而抑制 COX-2 蛋白质表达，降低 PGE2 产量，可能是江南卷柏抗肿瘤作用的机制之一。
中图分类号:R285. 5 文献标识码:B 文章编号:1001-1528(2010)09-1590-02
江南卷柏是卷柏科植物江南卷柏 Selaginella moellendor-
fii Hieron的全草，用于治疗各种疾病出血、血小板减少症，以
及急性黄疸型传染性肝炎等多种疾病［1］。《广西中药材标
准》将其作为石上柏的原植物之一收载，用于癌症及多种炎
症的治疗［2］。江南卷柏所含的化学成分主要为双黄酮类，包
括穗花杉双黄酮、鸡毛松双黄酮 A和 B、4′-甲醚-罗波斯塔双
黄酮、罗波斯塔双黄酮、扁柏双黄酮等，还含有 3 种黄酮苷
类［3，4］，其中穗花杉双黄酮的含量较高。黄酮类具有抗炎、
抗氧化的作用，穗花杉双黄酮具有抗肿瘤，抗病毒，血管舒张
作用［5］，因此，总黄酮是江南卷柏的主要活性部位。炎症与
癌症的发展密切相关［6］，环氧化酶-2(COX-2)是炎症介质分
子前列腺素合成关键的限速酶，它在肿瘤组织中的高度表
达，使它成为抗癌药研究的一个重要的靶点［7］。COX-2 可反
映在蛋白质水平及 mRNA 水平上，本实验考察江南卷柏总
黄酮对 COX-2 mRNA 水平的调节作用，探讨江南卷柏总黄
酮可能的抗肿瘤作用及其机制。
1 实验材料
1. 1 细胞系
结肠癌 HT-29 细胞系，购自武汉大学中国典型培养物保
藏中心。培养液为 RPMI-1640 加 10%新生牛血清、100 ng /
mL 的青霉素和链霉素，常规条件培养(5% CO2，37℃，
下同)。
1. 2 仪器及试剂
洁净工作台 (上海博迅);倒置显微镜 (OLYMPUS);
CO2 培养箱 (Sheldon);紫外检测仪(Hitachi U-2001 日立公
司);基因扩增仪(Biometra 德国);电泳仪(DYY-8C 北京);
凝胶成像分析仪(WD-9413A 北京);新生牛血清(武汉三
利);RPMI-1640 (Sigma);DMSO (Amresco);oligodT18、Rna-
sin(上海捷瑞);BIOZOL 裂解液、DEPC、Marker 等(北京天
根);引物均由上海生工合成。
1. 3 材料和药物样品
江南卷柏 Selaginella moellendorfii Hieron. 系蕨类卷柏科
卷柏属 Selaginella植物，于 2004 年 8 月采集于湖北宜昌雾渡
河，原植物由湖北中医药大学陈科力教授鉴定，标本留存于
湖北中医药大学标本室。江南卷柏总黄酮为本实验室按文
献从江南卷柏中提取制备［8］，江南卷柏总黄酮中黄酮类成分
的含量大于 50%，其中穗花衫双黄酮含量为 40%以上。江
南卷柏总黄酮用 DMSO 溶解制得 100 mg /mL 的样品贮备
液。
2 方法
2. 1 药物对细胞生长的抑制作用
采用氮蓝四唑盐实验(MTT 法)，取对数生长期细胞稀
释至 5 × 105 /mL，接种于 96 孔板，200 μL /孔，常规培养 24 h
后，弃取原培养液，加入用培养液稀释的样品贮备液，使其终
浓度分别为 100、50、25、12. 5 μg /mL，对照组加同体积培养
液，每组设 4 复孔，设 3 个时间梯度 24 h、48 h、72 h，药物作
用结束后，去除培养液，加入 MTT 5 mg /mL，20 μL /孔，37 ℃
孵育 4 h，加入 DMSO 150 μl /孔，震荡溶解 10 min，570 nm测
各孔吸光度。实验重复 3 次，取均值。分别计算抑制率和半
数抑制浓度 IC50(抑制一半细胞生长所需的药物浓度)。抑
制率 =(1—A给药孔 /A对照孔)× 100%。
2. 2 RT-PCR法检测药物对 HT-29 细胞 COX-2mRNA 表达
的影响
将对数生长期的结肠癌细胞 HT-29 细胞接种至 6 孔板
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2010 年 9 月
第 32 卷 第 9 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
September 2010
Vol. 32 No. 9
中，常规培养 24 h后加入样品贮备液使其终浓度分别为:40
μg /mL(高剂量组)、20 μg /mL(中剂量组)、10 μg /mL(低剂
量组)、0 μg /mL(阴性对照组)，培养 24 h。药物作用后，用
BIOZOL裂解提取 RNA。用琼脂糖凝胶电泳检测所提 RNA
的完整性。用微量比色皿在紫外下检测 RNA 的纯度及浓
度，并将各组总 RNA 浓度调整至同一水平。各组取等量
RNA加入 1 μL oligodT18，Rnasin 1 μL，dNTP 1 μL，MLV 1
μL，5 × buffer 10 μL，在 50 μL 体积下，42 ℃水浴 60 min，沸
水浴 3 min，冰浴 3 min，得 cDNA。完成逆转录的反应后，进
行聚合酶链反应。COX-2 引物序列如下:上游 5′-GTC TGA
TGA TGT ATG CCA CAA TCT G-3′，下游 5′-GAT GCC AGT
GAT AGA GGG TGT TAA A-3′，反应产物理论大小为 275 bp;
β-actin引物序列如下:上游 5′-CCC AGC ACA ATG AAG ATC
AA-3′，下游 5′-TTT CTG CGC AAG TTA GGT TTT GAC AA-
3′，反应产物理论大小为 234 bp。反应条件为:95 ℃，预变性
5 min;94 ℃，1 min变性;58℃ 50 s退火;72 ℃ 90 s延伸，循
环 40 次，72 ℃最终延伸 10 min。经 2%琼脂糖凝胶电泳，用
电泳凝胶成像自动分析仪检测各扩增带的产物，结果用下列
公式表示:COX-2 灰度值 = COX-2mRNA密度 /β-actin mRNA
密度。
2. 3 统计学处理
采用统计软件 SPSS 13. 0 分析。组间差异进行 t检验处
理，P < 0. 05认为差异有显著性。
3 结果
3. 1 药物对细胞生长的抑制作用
江南卷柏总黄酮干预后对细胞生长的抑制呈剂量和时间
依赖性，25 ～100 μg /mL抑制细胞增殖较明显，结果见表 1。
表 1 江南卷柏总黄酮对 HT-29 细胞生长的抑制
作用(IC50)
作用
时间
药物浓度
/(μg /mL)
OD值(x ± s)
抑制率
/%
IC50
/(μg /mL)
2d 阴性对照 1. 565 ± 0. 189 / 108. 6
100 1. 046 ± 0. 095 33. 16
50 1. 104 ± 0. 121 29. 46
25 0. 946 ± 0. 090 39. 55
12. 5 1. 533 ± 0. 252 2. 04
3d 阴性对照 0. 791 ± 0. 078 / 70. 9
100 0. 471 ± 0. 061 40. 45
50 0. 494 ± 0. 056 37. 55
25 0. 502 ± 0. 058 36. 54
12. 5 0. 793 ± 0. 085 0
4d 阴性对照 0. 958 ± 0. 035 / 33. 5
100 0. 374 ± 0. 093 60. 96
50 0. 350 ± 0. 104 63. 47
25 0. 412 ± 0. 093 56. 99
12. 5 0. 723 ± 0. 528 24. 53
3. 2 半定量检测样品对 HT-29 细胞 COX-2mRNA 表达的
影响
RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图 1，所测灰度值
见表 2。
图 1 RT-PCR反应结果图
表 2 各组 COX-2mRNA表达水平(n =6)
组别 江南卷柏总黄酮 /(μg /mL) COX-2 灰度值(x ± s)
阴性对照组 0 0. 653 ± 0. 054
低剂量组 10 0. 734 ± 0. 069
中剂量组 20 0. 441 ± 0. 041*
高剂量组 40 0. 288 ± 0. 053*
注:与阴性对照组比较:* P < 0. 05，P > 0. 05。
4 小结和讨论
本实验考察了江南卷柏总黄酮处理 24 h 对结肠癌细胞
HT-29 COX-2 mRNA的影响，结果显示江南卷柏总黄酮在浓
度为 20 μg /mL和 40 μg /mL 时能显著下调 COX-2mRNA 的
水平，且呈现量效关系(图 1、表 2)。实验还发现江南卷柏总
黄酮对结肠癌细胞 HT-29 的生长有一定抑制作用，且呈现剂
量和时间的依赖性(表 1)，但作用较为温和，其作用 48 h 时
IC50为 108 μg /mL。
COX-2 在各肿瘤组织中都有较高的表达，本文证明江南
卷柏总黄酮能在 mRNA 水平上抑制 COX-2 的蛋白质表达，
降低 PGE2 产量，这可能是江南卷柏抗肿瘤作用的机制之
一。本研究为卷柏属药用植物黄酮类提取物用于癌证治疗
提供了一定的理论依据，将有助于拓展卷柏的药用价值。
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2010 年 9 月
第 32 卷 第 9 期
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September 2010
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