全 文 ：乌克兰龙葵毛状根诱导条件优化
刘 琪，刘立业，刘金帅，李秀霞* (佳木斯大学生命科学学院，黑龙江佳木斯 154007)
摘要 ［目的］利用 3种发根农杆菌 A4、C58C1、A1476诱导乌克兰龙葵产生毛状根，探究乌克兰龙葵毛状根诱导的最佳条件。［方法］利
用植物组织培养技术，研究不同外植体、菌株、侵染时间、预培养天数、菌液浓度和共培养天数等对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影响。
［结果］叶片为最佳外植体材料;3种菌株均能诱导出毛状根，但 A4诱导率最高;最佳菌液浓度为 OD600 = 0． 6;最佳侵染时间为 5 min;预
培养和共培养均为 2 d时诱导率最高。［结论］乌克兰龙葵毛状根诱导条件的优化，为其他植物毛状根诱导提供参考，同时为进一步利用
植物毛状根生产药用成分提供试验基础。
关键词 毛状根诱导;龙葵;发根农杆菌;条件优化
中图分类号 S567． 21 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2016)08 －128 －04
Optimization of Induction Condition of Hairy Ｒoots of Ukraine Solanum nigrum L．
LIU Qi，LIU Li-ye，LIU Jin-shuai，LI Xiu-xia* (College of Life Sciences，Jiamusi University，Jiamusi，Heilongjiang 154007)
Abstract ［Objective］ To induce the hairy roots of Ukraine Solanum nigrum L． by the three agrobacterium rhizogenes A4，C58C1 and
A1476，and to discuss the optimal condition of hairy roots induction of Ukraine S． nigrum． ［Method］Using the plant tissue culture technolo-
gy，we researched the effects of explants，strain，infection time，precultivation days，bacterium concentration and cocultivation days on the in-
duction rate of hairy roots of Ukraine S． nigrum． ［Ｒesult］Leaf was the best explants material;the three kinds of strains could all induce hairy
root，but the highest was A4． The best bacterium concentration was OD600 = 0． 6;the best time to infect was 5 min． Precultivation and coculti-
vation for 2 d could obtain the maximum induction rate．［Conclusion］Optimizing the induction conditions of hairy root provides technical refer-
ences for the hairy root induction of other plants，and offers experiment basis for the medicinal component production by hairy roots．
Key words Hairy roots induction;Solanum nigrum L．;Agrobacterium rhizogenes;Condition optimization
基金项目 佳木斯大学大学生科技创新重点项目(XSYZ2014-001)。
作者简介 刘琪(1994 －) ，男，黑龙江大庆人，本科生，专业:生物科学。
* 通讯作者，博士，教授，从事植物资源学与生物技术等
研究。
收稿日期 2016-02-08
龙葵(Solanum nigrum L．)为茄科茄属一年生草本植
物［1］，广泛分布于世界温带和热带地区，在我国也遍布各
地［2］。研究表明，龙葵有修复细胞正常的生理活动，抑制细
胞突变，抑制肿瘤细胞的生长及增殖，促进肿瘤细胞凋亡，抑
制肿瘤细胞转移和增强机体免疫的功能 ［3 －4］。全草含茄碱
(Solanine)、茄解碱(Solsonine)、澳洲茄碱(Solaonine)、澳洲茄
边碱(Solsmargine)等多种生物碱［5］。现代药学研究表明，龙
葵生物碱具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、散瘀消肿、清热解毒等药
理作用［6］。
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)属根瘤菌科(Ｒhi-
zobiaceae)农杆菌属(Agrobacterium)的一类具有侵染性的革
兰氏阴性土壤杆菌。目前，有关毛状根的应用绝大部分集中
在应用毛状根系的离体培养来生产药用植物的有效成分，如
生物碱类(萝芙木生物碱)、萜类、甙类、试类(人参皂试、绞
股蓝皂试等)等化合物［7］。在自然状态下，发根农杆菌通过
伤口侵染植物，Ｒi质粒上的一段 DNA分子(T-DNA)在宿主
细胞中整合表达，使植物产生毛状根［8］。迄今，利用发根农
杆菌对茄科植物如澳洲茄(Solanum aviculare)和(紫脉)少花
龙葵(S． photeinocarpum)的遗传转化所产生的毛状根来产生
澳洲茄胺或龙葵生物碱和总皂甙已有报道［9 －10］，另外发现三
叶鬼针草毛状根可作为潜在修复污染水体中重金属的新材
料［11］。对于龙葵毛状根的诱导条件鲜有报道，笔者以乌克
兰龙葵为试验材料，利用发根农杆菌侵染乌克兰龙葵外植体
获得毛状根，在此基础上，研究 6 种不同因素对乌克兰龙葵
毛状根诱导率的影响，初步优化了乌克兰龙葵毛状根的诱导
条件，为龙葵毛状根的诱导提供参考。
1 材料与方法
1． 1 试验材料 乌克兰龙葵实生苗于佳木斯大学生命科学
学院植物组织培养室培养;发根农杆菌菌株 A4、C58C1、
A1476由佳木斯大学生命科学学院植物学研究所提供。
1． 2 培养基 菌株活化培养基:YEB培养基，pH 7． 0;预培
养培养基:MS，pH 5． 8;共培养培养基:MS + 乙酰丁香酮
(AS，200 mg /L) ;除菌培养基:MS +头孢噻肟钠(400 mg /L)
+羧苄青霉素(100 mg /L) ，pH 5． 8;毛状根继代培养基:MS，
pH 5． 8。
1． 3 试验方法
1． 3． 1 外植体的获得。乌克兰龙葵种子经常规灭菌后，种
植于灭菌蛭石中，定期浇营养液，待其成苗后，取其幼叶、嫩
茎、叶柄作为外植体。
1． 3． 2 菌株的活化。将发根农杆菌 A4、C58C1 和 A1476 分
别置于 YEB液体培养基中，在 28 ℃、160 r /min 的摇床下振
荡培养 24 h左右，测定 OD600，用于侵染外植体。
1． 3． 3 外植体的转化。在乌克兰龙葵苗上取其幼叶、嫩茎、
叶柄作为外植体，经常规灭菌后剪成边长 5 ～10 mm的方块，
接种于 MS培养基，预培养 2 d后将外植体浸入活化好的农
杆菌液中，5 min后取出，用无菌滤纸吸去表面多余菌液。将
侵染好的外植体放回原 MS培养基，共培养 2 d 后移植除菌
培养基上进行除菌，每隔5 d转接一次，经多次除菌操作培养
直至培养基上无农杆菌菌落时转至 MS 培养基进行继代
培养。
1． 3． 4 不同试验条件梯度设置。外植体选用幼叶、嫩茎、叶
柄;3种不同种类发根农杆菌为 A4、C58C1、A1476;菌液浓度
OD600设置为 0． 3、0． 6、0． 9;侵染时间设置为 5、10、15 min;预培
养时间设置为 0、1、2、3、4 d;共培养时间设置为 0、1、2、3、4 d。
责任编辑 李占东 责任校对 况玲玲安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2016，44(8) :128 － 131
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2016.08.046
1． 3． 5 毛状根的 PCＲ检测。取乌克兰龙葵无菌毛状根 200
g，利用微量 CATB法提取毛状根DNA，纯化后作为 PCＲ的扩
增模板，以农杆菌质粒为阳性对照，同时以非转化乌克兰龙
葵根的 DNA为阴性对照。参考王丽等［13］发表的 rolB引物:
P1 5-GCTCTTGCAGTGGCTAGATTT-3，P2 5-GAAGGTG-
CAAGCTACCTCTC-3;rolC 引 物:P1 5-CTCCTGACAT-
CAAACTCGTC-3， P2 5-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3。
PCＲ反应体系 50 uL。扩增程序:94 ℃预变性 3 min;94 ℃变
性 1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，35个循环;72 ℃
延伸 10 min。扩增产物使用 0． 9%的琼脂糖凝胶电泳和 EtBr
染色，在紫外成像系统下观察 DNA条带并进行拍照保存。
2 结果与分析
2． 1 不同外植体对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影响 由表
1可知，叶片的毛状根诱导率最高，达 46． 7%;茎段次之，为
23． 3%;叶柄最低，为 6． 7%。观察发现，被侵染的外植体在
侵染 7 d左右有少量白色多毛的根从被侵染的外植体长出，
叶片诱导的毛状根粗壮，密集;茎段和叶柄诱导的毛状根稀
疏，较细，且生根较晚(图 1)。最早生根天数无明显差异。
这表明乌克兰龙葵不同外植体对毛状根的诱导存在一定的
影响。
表 1 不同外植体对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影响
Table 1 Effects of explants on the induction rate of hairy roots of
Ukraine S． nigrum
外植体类型
Explants type
最早生根天数
Earliest rooting
days∥d
供试外植体数
Number of
tested
explants∥个
生根外
植体数
Number of
rooting
explants ∥个
诱导率
Induction
rate ∥%
叶片 Leaf 6 30 14 46． 7
茎段 Stem 8 30 7 23． 3
叶柄 Petiole 8 30 2 6． 7
注:a．叶片;b．叶柄;c．茎段。
Note:a． Leaf;b． Petiole;c． Stem induction．
图 1 不同外植体诱导毛状根情况
Fig． 1 Situation of hairy roots of Ukraine S． nigrum induced by different explants
2． 2 不同发根农杆菌对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影
响 由表 2可知，3种发根农杆菌均能诱导出毛状根，诱导率
差异不大，但 A4菌株毛状根的诱导率略高于其他 2种菌株。
A4的诱导率为 53． 3%;C58C1和 A1476的诱导率分别为 46．
7%和 43． 3%。最早生根天数无明显差异。观察发现，A4菌
株诱导的毛状根较其他 2 种菌株诱导的毛状根粗壮，密集
(图 2)。这表明不同发根农杆菌对乌克兰龙葵毛状根的诱
导存在一定的影响。
表 2 不同发根农杆菌对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影响
Table 2 Effects of agrobacterium rhizogenes on the induction rate of
hairy roots of Ukraine S． nigrum
农杆菌类型
Agrobacterium
type
最早生根天数
Earliest rooting
days ∥d
供试外植体数
Number of
tested
explants∥个
生根外植
体数
Number of
rooting
explants∥个
诱导率
Induction
rate∥%
A4 6 30 16 53． 3
C58C1 6 30 14 46． 7
A1476 7 30 13 43． 3
2． 3 不同侵染时间对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影响 由
表 3可知，侵染时间 5 min 时叶片的毛状根诱导率最高，为
53． 3%;侵染 10 和 15 min 的叶片毛状根诱导率分别为
23． 3%和 10． 0%，与侵染 5 min的毛状根诱导率有显著差异，
最早生根天数差异不大。这表明不同侵染时间对乌克兰龙
葵毛状根的诱导存在较大影响。
表 3 不同侵染时间对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影响
Table 3 Effects of infection time on the induction rate of hairy roots of
Ukraine S． nigrum
侵染时间
Infection time
min
最早生根天数
Earliest rooting
days ∥d
供试外植体数
Number of
tested
explants∥个
生根外植
体数
Number of
rooting
explants∥个
诱导率
Induction
rate∥%
5 7 30 16 53． 3
10 7 30 7 23． 3
15 6 30 3 10． 0
2． 4 不同预培养时间对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影
响 由表 4可知，预培养 2 d时叶片诱导率最高，为 50． 0%;
不进行预培养的叶片诱导率最低，为 33． 3%;预培养 3、4 d
后叶片诱导率逐渐下降，分别为 40． 0%和 36． 7%。观察发
现，预培养 3 d后的叶片慢慢变黄，生命活力减弱，且最早生
根天数无明显差异。这表明预培养时间过长过短均不利于
92144 卷 8 期 刘 琪等 乌克兰龙葵毛状根诱导条件优化
马克兰龙葵毛状根的诱导。
注:a． A4;b． C58C1;c． A1476。
Note:a． A4;b． C58C1;c． A1476．
图 2 不同发根农杆菌诱导毛状根情况
Fig． 2 Situation of hairy roots of Ukraine S． nigrum induced by agrobacterium rhizogenes
表 4 不同预培养时间对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影响
Table 4 Effects of precultivation days on the induction rate of hairy
roots of Ukraine S． nigrum
预培养天数
Precultivation
days
d
最早生根天数
Earliest rooting
days ∥d
供试外植体数
Number of
tested
explants∥个
生根外植
体数
Number of
rooting
explants∥个
诱导率
Induction
rate∥%
0 6 30 10 33． 3
1 7 30 14 46． 7
2 6 30 15 50． 0
3 6 30 12 40． 0
4 7 30 11 36． 7
2． 5 不同菌液浓度对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影响 由
表 5可知，菌液浓度 OD600为 0． 6 时，叶片诱导率最高，为
56． 7%;OD600为 0． 3 和 0． 9 时，诱导率分别为 33． 3% 和
13． 3%。由此可知，菌液浓度过低或过高均影响诱导率，且高
浓度诱导率较低。这表明菌液浓度对乌克兰龙葵毛状根的
诱导存在一定的影响。
表 5 不同菌液浓度对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影响
Table 5 Effects of bacterial concentration on the induction rate of
hairy roots of Ukraine S． nigrum
菌液浓度
Bacterial
concentration
OD600
最早生根天数
Earliest rooting
days ∥d
供试外植体数
Number of
tested
explants∥个
生根外植
体数
Number of
rooting
explants∥个
诱导率
Induction
rate∥%
0． 3 7 30 10 33． 3
0． 6 6 30 17 56． 7
0． 9 6 30 4 13． 3
2． 6 不同共培养时间对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影
响 由表 6 可知，共培养 2 d 时叶片的诱导率最高，为
53． 3%;叶片的诱导率随着共培养时间的延长呈先增后减的
趋势。共培养 4 d的叶片逐渐开始变黄，失去活力而死亡，最
早生根天数无明显差异。这表明共培养天数对乌克兰龙葵
毛状根的诱导存在一定的影响。
2． 7 乌克兰龙葵毛状根的 PCＲ检测结果 由图 3 可知，利
用发根农杆菌诱导的毛状根均扩增出特异性条带，而未转化
的乌克兰龙葵根则未扩增出条带，表明发根农杆菌的 Ｒi 质
粒 DNA已整合入乌克兰龙葵的毛状根基因组中。
表 6 不同共培养时间对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影响
Table 6 Effects of cocultivation days on the induction rate of hairy
roots of Ukraine S． nigrum
共培养天数
Cocultivation
days∥d
最早生根天数
Earliest rooting
days ∥d
供试外植体数
Number of
tested
explants∥个
生根外植
体数
Number of
rooting
explants∥个
诱导率
Induction
rate∥%
0 6 30 7 23． 3
1 7 30 8 26． 7
2 7 30 16 53． 3
3 6 30 9 30． 0
4 7 30 6 20． 0
3 结论与讨论
合适的外植体是影响试验结果的一个重要因素。当细
胞处于分裂期时才能与外源 DNA整合［14］，由于幼嫩叶片处
于旺盛的分裂期，所以该试验选用乌克兰龙葵叶片作为外植
体，保证了发根农杆菌与可被侵染细胞的接触，增加了生根
的几率。
该试验中 3 种发根农杆菌 A4、C58C1、A1476 均能诱导
乌克兰龙葵外植体产生毛状根，而非农杆菌侵染的外植体则
不能产生毛状根，这可能是由于龙葵为双子叶植物，对农杆
菌较为敏感，更容易与其发生作用，所以普通发根农杆菌即
可诱导出龙葵毛状根。
该试验结果表明，不同菌液浓度对毛状根的诱导也存在
影响。当菌液浓度 OD600为 0． 6 时诱导率最高，浓度过低或
过高诱导率反而下降。这可能是由于菌液浓度过低，菌液中
的菌体数量较少，转化的概率降低;菌液浓度过高，菌体活力
下降，侵染能力降低。同时菌液过多会附着在外植体上，加
速叶片老化，不易生根。
共培培养时间同样是影响毛状根诱导的一个因素。共
培养时间较短不利于农杆菌基因的转化，共培养时间过长导
致外植体营养的过度缺乏，细胞活力降低，影响毛状根的生
031 安徽农业科学 2016年
注:1、5、9为未转化的乌克兰龙葵根的阴性对照;2、3、4、6、7 和 8
为转化的乌克兰龙葵毛状根;10 为 Ｒi 质粒阳性对照。M 为
DNA分子量标准。
Note:M． DNA Marker;1，5，9 were negative control of untransformed
hairy roots of Ukraine S． nigrum;2，3，4，6，7 and 8 were trans-
formed hairy roots of Ukraine S． nigrum;10 was positive control
of Ｒi plasmid．
图 3 乌克兰龙葵毛状根 PCＲ扩增图谱
Fig． 3 PCＲ amplification hairy roots of Ukraine S． nigrum
根率。适宜的共培养时间为 2 d。
该试验结果发现，除菌培养基对毛状根的生长有很大影
响。在共培养过程中，农杆菌会大量增殖，如不进行除菌会
影响毛状根的正常生长，导致叶片褐化或死亡。但侵染后存
活的叶片，均能长出毛状根。在农杆菌介导的植物基因转化
中，共培养后需要利用抑菌性抗生素除去残留的农杆菌 ［15］。
培养基的除菌用抗生素是目前常用的除菌方法，抗生素浓度
过低除菌效果较差，浓度过高也会影响外植体的生长进而影
响生根［16 －17］。该试验结果表明，当共培养时间为 2 d时，诱
导效果较好，除菌 MS培养基中加入头孢噻肟钠(400 mg /L)
和羧苄青霉素(100 mg /L) ，保证了毛状根的正常生长。
毛状根培养系统克服了植物生长缓慢、有效成分积累不
足的缺陷，具有不依赖外源植物激素，次生代谢物质合成能
力较强，同时生产能力稳定等优点［18 －19］。乌克兰龙葵毛状
根诱导条件优化，有利于研究龙葵次生代谢产物，同时也为
毛状根诱导提供了试验基础，利于天然药物的开发利用，但
毛状根的扩大培养还有待于进一步研究。
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13144 卷 8 期 刘 琪等 乌克兰龙葵毛状根诱导条件优化