全 文 ：北方园艺２０１５（０４）：１０７～１１１ ·生物技术·
第一作者简介：王丽（１９８８－），女，硕士研究生，研究方向为资源植
物学与生物技术。Ｅ－ｍａｉｌ：９１７５４９４９０＠ｑｑ．ｃｏｍ．
责任作者：李秀霞（１９６３－），女，博士，教授，现主要从事植物资源学
与生物技术等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｘｉｕｘｉａ２００６＠１６３．ｃｏｍ．
基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究资助项目（１２５２１５２３）；佳
木斯大学研究生科技创新资助项目 （ＬＺＺ２０１４＿００１）；黑龙江省高
校科技成果产业化前期研发培养资助项目（１２５３ＣＧＺＨ０８）。
收稿日期：２０１４－１１－１３
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１５０４０２５
龙葵毛状根诱导条件的研究
王 丽，刘 琪，宁 明 明，张 卫 东，戚 小 利，李 秀 霞
（佳木斯大学 生命科学学院，黑龙江 佳木斯１５４００７）
摘 要：以发根农杆菌Ａ４、Ｃ５８Ｃ１和Ａ１４７６为诱导菌株，探讨外植体类型、发根农杆菌种类、
侵染时间、预培养时间、菌液浓度和共培养天数对龙葵毛状根诱导率的影响。结果表明：外植体
以叶片诱导率最高；发根农杆菌Ａ４、Ｃ５８Ｃ１和Ａ１４７６侵染龙葵叶片均能诱导出毛状根，Ｃ５８Ｃ１诱
导率较高；较佳侵染时间为５ｍｉｎ；发根农杆菌浓度在ＯＤ６００＝０．６时诱导效果较好；预培养和共培
养时间均为２ｄ时诱导率较高。该试验为大量生产毛状根，并利用毛状根培养技术生产药物龙葵
碱提供了试验基础。
关键词：龙葵；发根农杆菌；毛状根诱导；条件优化
中图分类号：Ｓ ５６７．２３＋９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１５）０４－０１０７－０５
龙葵（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍＬ．）属茄科茄属１年生草本
植物，广泛分布于欧、亚、美洲的温带至热带地区［１］，我国
各地均有分布［２］，是我国传统的中草药，其全草均可入
药。中国龙葵有３个种及１个变种，分别为龙葵、少花龙
葵、红果龙葵和黄果龙葵［３］。龙葵全草含苷类生物碱、
多糖、矿物质、维生素、色素、氨基酸等多种成分，所含生
物碱可抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿
瘤细胞转移，所含多糖能增强机体的免疫能力［４－６］。临
床中具有抗炎与抗休克、抑菌抗病毒、解热镇痛和祛痰
止咳等作用。
发根农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）属根瘤菌科
（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）农杆菌属的一种革兰氏阴性土壤细菌，它
可以使植物宿主细胞组织产生毛状根瘤。在自然状态
下，发根农杆菌通过伤口侵染植物，Ｒｉ质粒上的Ｔ－ＤＮＡ
能插入植物基因组，其上所携带的基因在宿主细胞中整
合表达，使植物产生毛状根［７］。利用毛状根诱导技术已
在刺五加（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ）、北柴胡 （Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ
ｃｈｉｎｅｎｓｅ ＤＣ）和三裂叶野葛（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｐｈａｓｅｏｌｏｉｄｅｓ）等多
Ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ａｎｄ Ｂａｎｄｉｎｇ Ｐａｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｉｎ
Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ
ＬＩＮ Ｑｉｎ，Ａｂｕｄｉｒｅｈｅｍｕ·ＲＥＨＥＭＡＮ，ＲＥＮ Ｘｉａｎ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ，Ｎｉｎｇｘｉａ ７５００２１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｔｉｐ ｏｆ ｓｅｅｄ ｆｒｏｍＡｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌ，ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｎｕｍｂｅｒ，ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ａｎｄ
ｚｏｎｅ ｔｙｐｅ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｓｌｉｄｅ，Ｃ－ｂａｎｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｃｏｍｐｕｔｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｏ ｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＲＴＣ ｏｆ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ
ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ ｗａｓ ８，ａｎｄ ｔｈｅ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ｆｏｒｍｕｌａ ｗａｓ ２ｎ＝１６＝２Ｌ＋４Ｍ１＋６Ｍ２＋４Ｓ．Ｔｈｅ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ２Ｂｔｙｐｅ；ａｎｄ
Ａ．ｓＫ（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔ）＝１６．１７／２５．６３×１００％＝６３．０９％．Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｗａｓ ６９．０
μｍ３．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ Ｃ－ｂａｎｄｉｎｇ ｆｏｒｍｕｌａ ｗａｓ ２ｎ＝１６＝８ｍ＋６ｓｍ＋２ｓｍ＋ｓａｔ．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｓａｔｅｌｉｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｇｍｅｎｔ ｏｆ ｓｈｏｒｔ
ａｒｍ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ３，ｗｈｉｃｈ ｗｏｕｌｄ ｌａｙ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ ａｎｄ
Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ；ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ；ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｃ－ｂａｎｄｉｎｇ
７０１
·生物技术· 北方园艺２０１５（０４）：１０７～１１１
种药用植物中获得成功［８－１０］。龙葵是传统的药用植物之
一，目前国内有关于少花龙葵 （Ｓ．ｐｈｏｔｅｉｎｏｃａｒｐｕｍ）和褐
脉少花龙葵（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍＬ．ｖａｒ ｐａｕｃｉｆｌｏｒｕｍＬｉｏｕ）
的毛状根诱导的研究报道［１１－１２］，但是关于龙葵毛状根诱
导的最佳条件尚鲜见研究报道。现以黑龙江省龙葵为
试材，对影响龙葵毛状根诱导的多种因素进行了比较系
统的研究，旨在为龙葵的毛状根的进一步研究提供参
考，为今后利用龙葵毛状根生产龙葵碱等药物奠定研究
基础。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
龙葵种子采于黑龙江省佳木斯大学校园，３种发根
农杆菌菌株Ａ４、Ｃ５８Ｃ１和 Ａ１４７６为佳木斯大学生命科
学学院实验室保存。
菌种活化培养基：ＹＥＢ培养基；预培养培养基：ＭＳ，
ｐＨ ５．８；共培养培养基：ＭＳ＋乙酰丁香酮（ＡＳ，２００ｍｇ／Ｌ）；
除菌培养基：ＭＳ＋４００ｍｇ／Ｌ头孢噻肟钠＋１００ｍｇ／Ｌ羧
苄青霉素，ｐＨ ５．８；毛状根继代培养基：ＭＳ，ｐＨ ５．８。
１．２ 试验方法
１．２．１ 外植体的获得 龙葵种子常规灭菌，于温室内种
植于灭菌蛭石中，获得龙葵幼苗，取其幼叶、嫩茎和叶柄
作为外植体。
１．２．２ 菌种的活化 发根农杆菌 Ａ４、Ｃ５８Ｃ１和Ａ１４７６
用接种环接种于ＹＥＢ液体培养基内，２８℃、１６０ｒ／ｍｉｎ振
荡培养２４ｈ，用于外植体侵染。
１．２．３ 外植体的转化方法 取龙葵苗的幼叶、嫩茎和叶
柄作为外植体，经常规灭菌后切成边长为５～１０ｍｍ的
小方块，接种于ＭＳ培养基预培养２ｄ，之后将外植体浸
入到活化好的菌液中，５ｍｉｎ后取出，用无菌滤纸吸干多
余菌液再放回到ＭＳ培养基上。共培养２ｄ后移至除菌
培养基进行除菌培养，每隔５ｄ转接１次，经反复除菌至
培养基看不到农杆菌菌落时再转入 ＭＳ培养基进行继
代培养。
１．２．４ 各试验条件梯度的设置 试验所用发根农杆菌
种类为Ａ４、Ｃ５８Ｃ１和Ａ１４７６；外植体选用幼叶、嫩茎和叶
柄；预培养时间设置为０、１、２、３、４ｄ；菌液浓度ＯＤ６００的值
设置为０．３、０．６、０．９、１．２；侵染时间设置为５、１０、１５ｍｉｎ；
共培养时间设置为０、１、２、３、４ｄ。
１．２．５ 龙葵毛状根ＰＣＲ的检测 取龙葵无菌毛状根
２００ｍｇ，用ＣＡＴＢ［１３］法提取毛状根总ＤＮＡ，纯化后作为
ＰＣＲ的扩增模板，用ＣＡＴＢ 法提取未转化龙葵根总
ＤＮＡ作阴性对照，用纯化质粒ＤＮＡ的提取方法［１４］提取
农杆菌质粒作阳性对照。采用Ｓｌｉｇｈｔｏｎ等［１５］发表的
ｒｏｌＢ引物：Ｐ１：５′－ＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＡＧＡＴＴＴ－３′，
Ｐ２：５′－ＧＡＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＴＡＣＣＴＣＴＣ－３′；ｒｏｌＣ引物：Ｐ１：
５′－ＣＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＡＣＴＣＧＴＣ－３′，Ｐ２：５′－ＴＧＣＴ－
ＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＧＧＴＡＣＡ－３′（引物由苏州金唯智生物科
技有限公司合成）。ＰＣＲ反应总体系为５０μＬ。向
０．２ｍＬ的硅化离心管中加入模板 ＤＮＡ １μＬ、Ｈ２Ｏ
３４．６μＬ、ｂｕｆｅｒ ５μＬ、ＭｇＣｌ２３μＬ和ｄＮＴＰ １μＬ，引物
Ｐ１、Ｐ２分别放入２．５μＬ、５单位的Ｔａｑ酶０．４μＬ。ＰＣＲ
扩增的反应参数为：９４℃起始变性３ｍｉｎ，进行３５个循
环，每个循环包括９４℃变性１ｍｉｎ，５３．５℃退火１ｍｉｎ和
７２℃延伸反应１ｍｉｎ，最后７２℃延伸反应１０ｍｉｎ，扩增产
物用０．９％的琼脂糖凝胶电泳和ＥｔＢｒ染色进行分析。
２ 结果与分析
２．１ 不同外植体对龙葵毛状根诱导率的影响
表１表明，叶片的毛状根诱导率最高，为５１．７％，生
根最早；茎段诱导率次之，为３６．７％；叶柄诱导率最低，
为３．３％。试验发现叶片诱导的毛状根粗壮密集、多分
支，而茎段和叶柄诱导的毛状根纤细分支少（图１），且二
者生根较叶片晚。试验结果表明，龙葵外植体的类型对
毛状根的诱导率存在着一定的影响。
表１ 不同外植体对毛状根诱导率的影响
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｎｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔ
外植体类型
Ｅｘｐｌａｎｔｓ ｔｙｐｅ
接种数
Ｔｏｔａｌ Ｎｏ．
ｐｌａｎｔｓ／个
最早生根天数
Ｔｈｅ ｅａｒｌｉｓｔ
ｒｏｏｔｄ ｔｉｍｅ／ｄ
生根数
Ｒｏｏｔｉｎｇ
ｎｕｍｂｅｒ／个
诱导率
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｒａｔｅ／％
叶片Ｌｅａｆ ６０ ５ ３１ ５１．７
茎段Ｓｔｅｍ ｓｅｇｍｅｎｔ ６０ ８ ２２ ３６．７
叶柄Ｐｅｔｉｏｌｅ ６０ ８ ２ ３．３
２．２ 不同发根农杆菌对龙葵毛状根诱导率的影响
表２表明，侵染１周后，被３种农杆菌侵染的叶片
均能诱导出毛状根（图２），Ａ４和Ｃ５８Ｃ１菌株对龙葵叶片
的诱导率分别为５４％和５６％，而Ａ１４７６的诱导率则为
４８％，低于前二者，最早生根天数三者差别不大。结果
显示，３种发根农杆菌菌株对龙葵叶片毛状根的诱导率
存在着一定的影响。
表２ 不同发根农杆菌对毛状根诱导率的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔ
农杆菌类型
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ｔｙｐｅ
接种数
Ｔｏｔａｌ Ｎｏ．ｐｌａｎｔｓ／个
最早生根天数
Ｔｈｅ ｅａｒｌｉｓｔ ｒｏｏｔｄ ｔｉｍｅ／ｄ
生根数
Ｒｏｏｔｉｎｇ ｎｕｍｂｅｒ／个
诱导率
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ／％
Ａ４ ５０ ７ ２７ ５４
Ｃ５８Ｃ１ ５０ ６ ２８ ５６
Ａ１４７６ ５０ ７ ２４ ４８
８０１
北方园艺２０１５（０４）：１０７～１１１ ·生物技术·
注：ａ．茎段诱导；ｂ．叶片诱导；ｃ．叶柄诱导。
Ｎｏｔｅ：ａ．ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｍｓ；ｂ．ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅａｖｅｓ；ｃ．ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｔｉｏｌｅ．
图１ 不同外植体的毛状根诱导
Ｆｉｇ．１ Ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｌａｎｔｓ
注：ａ．Ｃ５８Ｃ１；ｂ．Ａ４；ｃ．Ａ１４７６。
Ｎｏｔｅ：ａ．Ｃ５８Ｃ１；ｂ．Ａ４；ｃ．Ａ１４７６．
图２ 不同发根农杆菌诱导产生的毛状根
Ｆｉｇ．２ Ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｉｆｅｒｅｎｔ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ
２．３ 不同侵染时间对龙葵毛状根诱导率的影响
表３表明，侵染时间对龙葵毛状根诱导率的影响较
大，侵染时间５ｍｉｎ时叶片的毛状根诱导率为５６％，诱
导率最高；侵染１０ｍｉｎ及１５ｍｉｎ的叶片毛状根诱导率
分别为１６％和１０％，诱导率与侵染５ｍｉｎ的差别较大，
最早生根天数三者差别不大。随着侵染时间的增长，诱
表３ 不同侵染时间对毛状根诱导率的影响
Ｔａｂｌｅ ３ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ
ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ
侵染时间
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ／ｍｉｎ
接种数
Ｔｏｔａｌ Ｎｏ．
ｐｌａｎｔｓ／个
最早生根天数
Ｔｈｅ ｅａｒｌｉｓｔ
ｒｏｏｔｄ ｔｉｍｅ／ｄ
生根数
Ｒｏｏｔｉｎｇ
ｎｕｍｂｅｒ／个
诱导率
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｒａｔｅ／％
５ ５０ ７ ２８ ５６
１０ ５０ ７ ８ １６
１５ ５０ ６ ５ １０
导率逐步降低，试验中还观察到侵染１５ｍｉｎ时外植体半
数以上表现失去生命力，从而丧失诱发毛状根的能力。
２．４ 预培养时间对龙葵毛状根诱导率的影响
表４表明，不进行预培养的叶片诱导率最低，为
３６％；随着预培养天数的延长诱导率逐渐升高，预培养２ｄ
表４ 不同预培养时间对毛状根诱导率的影响
Ｔａｂｌｅ ４ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｐｒｅ－ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ
ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ
预培养天数
Ｐｒｅ－ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ／ｄ
接种数
Ｔｏｔａｌ Ｎｏ．
ｐｌａｎｔｓ／个
最早生根天数
Ｔｈｅ ｅａｒｌｉｓｔ ｒｏｏｔｄ
ｔｉｍｅ／ｄ
生根数
Ｒｏｏｔｉｎｇ
ｎｕｍｂｅｒ／个
诱导率
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｒａｔｅ／％
０ ５０ ６ １８ ３６
１ ５０ ７ ２３ ４６
２ ５０ ６ ２６ ５２
３ ５０ ６ ２１ ４２
４ ５０ ７ １９ ３８
９０１
·生物技术· 北方园艺２０１５（０４）：１０７～１１１
时的诱导率最高为５２％。２ｄ以后的诱导率又逐渐下
降，叶片开始变黄，生命力下降，预培养３、４ｄ的龙葵幼
叶诱导率分别为４２％和３８％。结果表明，预培养时间过
长或过短都不利于毛状根的诱导。
２．５ 菌液浓度对龙葵毛状根诱导率的影响
表５表明，不同菌液浓度对毛状根诱导率影响较
大，ＯＤ６００＝０．６时诱导率为５８％，诱导率最高；ＯＤ６００为
０．３、０．９、１．２时诱导率分别为１０％、１０％、４％。低浓度
的菌液侵染不易成功，诱导率较低，ＯＤ６００高于０．６以后，
随着菌液浓度的增大诱导率急剧下降，说明过高或过低
的菌液浓度都不利于毛状根的诱导。
表５ 不同菌液浓度对毛状根诱导率的影响
Ｔａｂｌｅ ５ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ
菌液浓度ＯＤ６００值
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ
接种数
Ｔｏｔａｌ Ｎｏ．
ｐｌａｎｔｓ／个
最早生根天数
Ｔｈｅ ｅａｒｌｉｓｔ ｒｏｏｔｄ
ｔｉｍｅ／ｄ
生根数
Ｒｏｏｔｉｎｇ
ｎｕｍｂｅｒ／个
诱导率
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｒａｔｅ／％
０．３ ５０ ７ ５ １０
０．６ ５０ ７ ２９ ５８
０．９ ５０ ６ ５ １０
１．２ ５０ ６ ２ ４
２．６ 共培养时间对龙葵毛状根诱导率的影响
由表６可知，不同的共培养时间对龙葵毛状根诱导
率有影响。共培养０～２ｄ时间内随共培养天数增加毛
状根诱导率逐步增大，共培养２ｄ时毛状根诱导率最高，
为４６％；随着共培养时间的延长诱导率逐步下降，共培
养３、４ｄ的诱导率分别是２４％和１８％，各试验组最早生
根天数差别不大。试验中发现共培养时间长时，一部分
外植体会逐步变黄死亡。
表６ 不同共培养时间对毛状根诱导率的影响
Ｔａｂｌｅ ６ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏ－ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ
ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ
共培养时间
Ｃｏ－ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ／ｄ
接种数
Ｔｏｔａｌ Ｎｏ．
ｐｌａｎｔｓ／个
最早生根天数
Ｔｈｅ ｅａｒｌｉｓｔ ｒｏｏｔｄ
ｔｉｍｅ／ｄ
生根数
Ｒｏｏｔｉｎｇ
ｎｕｍｂｅｒ／个
诱导率
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｒａｔｅ／％
０ ５０ ６ １８ ３６
１ ５０ ６ １９ ３８
２ ５０ ７ ２３ ４６
３ ５０ ６ １２ ２４
４ ５０ ７ ９ １８
２．７ 龙葵毛状根ＰＣＲ的检测结果
通过对龙葵毛状根进行ＰＣＲ检测，从转化获得的
龙葵毛状根中检测出了预期的与农杆菌ＤＮＡ中相同的
ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣ基因条带，而未转化的龙葵实生根则没有扩增
出条带，说明发根农杆菌的ＲＩ质粒ＤＮＡ已经整合到了
龙葵的毛状根基因中（图３）。
３ 讨论与结论
该试验以黑龙江的龙葵为试验材料，利用３种不同
的发根农杆菌（Ａ４、Ｃ５８Ｃ１、Ａ１４７６）对龙葵的不同外植体
注：２，３，４，６，７和８为转化植株；１，５，９为阴性对照；１０为阳性对照；
Ｍ：ＤＮＡ分子量标准。
Ｎｏｔｅ：２，３，４，６，７ａｎｄ ８ａｒｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ；１，５，９ａｒｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎ－
ｔｒｏｌ；１０ｉｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ ２ ０００）．
图３ 龙葵毛状根ＰＣＲ结果
Ｆｉｇ．３ ＰＣＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ ｏｆ
Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍＬ．
进行侵染得到毛状根。发根农杆菌能够诱导龙葵外植
体产生毛状根，而非诱导的外植体不产生根，表明龙葵
对发根农杆菌敏感。
选择合适的外植体是建立诱导体系的首要任务。
以往研究表明，子叶、茎、叶及果实是使用较多的外植
体，不同的植物最适外植体也存在较明显的差异［１６］。该
研究选取了龙葵幼苗的幼叶、嫩茎和叶柄３种外植体作
为转化材料。试验结果表明，用叶片作为感染材料诱导
率最高，叶柄的诱导率最低，茎段位于二者之间。试验
中观察到，叶片作为外植体得到的毛状根数量多而且根
系粗壮发达分支多，而茎段和叶柄得到的毛状根非常纤
细并且数量少。可能是因为幼嫩的叶片处于分裂期对
农杆菌更敏感所致［１７］。
不同的植物对不同发根农杆菌的敏感程度有所不
同［１８］。该试验选取了Ｃ５８Ｃ１、Ａ１４７６、Ａ４ ３种发根农杆
菌作为侵染菌种，试验表明３种发根农杆菌均能使龙葵
幼叶诱导出毛状根，其中Ｃ５８Ｃ１、Ａ４诱导率较高。原因
可能是因为龙葵本身为草本双子叶植物，对普通农杆菌
都比较敏感，所以普通的发根农杆菌均能侵染龙葵致使
其发根［１９］。
试验结果表明，预培养时间对诱导率也有一定的影
响，龙葵毛状根诱导预培养时间在２ｄ时诱导率较高。
研究观察到侵染时间也是影响诱导率的一个方面，侵染
时间过短容易导致侵染不成功，侵染时间过长会使附着
在外植体上的农杆菌过多，农杆菌大量增殖导致叶片死
亡，该试验在龙葵的研究中较佳的侵染时间是５ｍｉｎ。
菌液浓度对诱导效果表现一定的影响，过高或过低的菌
液浓度都不利于毛状根的诱导。附着在外植体的菌液
浓度过高会使叶片丧失活性，不易除菌，过低又起不到
感染的目的，试验表明ＯＤ６００＝０．６时诱导效果较好，高
于０．６后诱导效率急剧降低。
０１１
北方园艺２０１５（０４）：１０７～１１１ ·生物技术·
共培养时间的长短也是影响龙葵毛状根诱导率的
一个因素。共培养时间短不易于农杆菌将发根基因诱
导到外植体基因中，共培养时间过长又会导致农杆菌大
量繁殖，给以后的除菌带来困难，农杆菌除不净就会使
外植体失活，直接影响诱导率，较适宜的共培养时间为
２ｄ。
试验还表明，植株叶龄对诱导率也有一定的影响，
过嫩或过老的叶片诱导毛状根效果均不佳，过嫩的很容
易受农杆菌的侵染导致死亡。此外，在龙葵毛状根离体
培养过程观察到，在ＭＳ液体培养基中生长要比在固体
ＭＳ中生长要快。在龙葵的毛状根继代培养中，毛状根
生长快，性状稳定，关于龙葵毛状根的扩大培养以及次
生代谢物的提取有待进一步的研究。
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ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｐｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｗａｓ ２ｄａｙｓ．Ｉｔ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｓｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈａｉｒｙ
ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ａｌｋａｌｏｉｄ ｏｆ Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｈｉｃｈ ｕｓｅｄ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ；ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
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