全 文 ：大孔吸附树脂纯化江南卷柏总黄酮的工艺研究＊
殷丹 1, 2 ,陈科力1＊＊
(1.省部共建中药资源和中药复方教育部重点实验室 ,湖北中医学院 , 武汉 430065;2.武汉生物工程学院 ,武汉 430415)
摘要　目的:确定纯化江南卷柏总黄酮的大孔树脂及其工艺参数。方法:以总黄酮的含量为指标 , 从 3种不同型号的大孔树脂
中筛选纯化江南卷柏总黄酮的最佳树脂;以江南卷柏总黄酮的回收率为指标 ,通过单因素试验确定该树脂分离纯化的工艺条
件。结果:D101型树脂对江南卷柏总黄酮有较好的吸附和解吸附性能;其纯化江南卷柏总黄酮的较佳工艺条件为:药材量与
树脂量的比例为 1∶3,以 8 BV(8倍体积)70%乙醇洗脱 ,流速为 2 BV· h-1 ,树脂每次可重复使用 3次。 在所确定的工艺条件
下 , 江南卷柏总黄酮纯度可达 50%以上 , 回收率可达 85%以上。结论:该工艺条件可用于江南卷柏总黄酮的纯化。
关键词:江南卷柏;总黄酮;大孔吸附树脂
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2010)11-2040-04
PurificationtechnologyoftotalflavonoidsfromSelaginelamoelendorfi
Hieronwithmacroporousadsorptionresin＊
YINDan1, 2 , CHENKe-li1＊＊
(1.KeyLaboratoryofTCMResourceandFoumulationoftheMinistryofEducation, HubeiColegeofTCM,
Wuhan430065, China;2.WuhanBioengineeringInstitute, Wuhan430415, China)
Abstract　Objective:Todeterminetheoptimummacroporousresin＆theparametersoftechnologypurificatingtotal
flavonoidsfromSelaginelamoelendorfiHieronwiththeresin.Methods:Withthecontentoftotalflavonoidsfrom
SelaginelamoelendorfiHieronasindex, screenouttheoptimalresinwhichcanpurifythefrom3 diferentresins,
anddeterminthetechnologyconditionpurifyingthebysingle-factorexperiments.Results:Thetotalflavonoids
fromSelaginelamoelendorfionD101 macroporousresinshowedthebestefectionofadsorption＆ desorption.
Thepreferabletechnologyofpurifyingthetotalflavonoidswas:theratioofweightoftheherbsandresinwas1∶3 ,
elutedatavelocityof2 BV· h-1 byavolumeof8 BV· h-1 of70% alcohol.Theresincouldbereusedfor3
timesbeforetreating.Underthetechnologytherecoveryrateoftotalflavonoidswasmorethan85% andthepurity
wasmorethan50%.Conclusion:TheD101macroporousresinissuitabletopurifythetotalflavonoidsfromSela-
ginelamoelendorfiHieron.
Keywords:SelaginelamoeledorfiHieron;totalflavonoids;macroporousadsorptionresin
卷柏科植物江南卷柏 Selaginelamoelendorfi
Hieron的干燥全草是一种较常用的中草药与民族
药 ,具有清热解毒 、抗癌 、止血之功效 ,用于癌症 、肺
炎 、急性扁桃体炎 、眼结膜炎和乳腺炎等症[ 1] 。广
州白云山制药总厂用其为原料生产的江南卷柏片是
疗效显著的治疗多种出血性紫斑的中药。江南卷柏
的有效成分主要为黄酮类化合物 ,以双黄酮及其苷
类为主 [ 2, 3] 。研究发现 ,江南卷柏总黄酮不仅具有
抑制黄嘌呤氧化酶 [ 4]和脂氧化酶 [ 5]的活性 ,而且具
有较强的抗柯萨奇病毒 [ 6] 、单纯疱疹病毒[ 7]的作
用。目前对黄酮类成分的富集多采用大孔吸附树
脂 ,但由于卷柏类药材的总黄酮中含有大量脂溶性
成分双黄酮 ,难以完全溶解于水 ,限制了大孔吸附树
脂的应用 。冯志毅 、郑晓珂等报道 [ 8]用聚酰胺树脂
干法装柱 ,对卷柏的总黄酮进行纯化 ,获得的总黄酮
含量大于 60%,收率大于 75%,是一种可选用和参
考的较好方法 。但聚酰胺的使用成本太高 ,且不能
反复使用 。因此 ,我们仍用大孔吸附树脂对江南卷
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＊
＊＊
国家自然科学基金项目(编号:304070193);湖北省科技攻关计划项目 2006AA301B01
通讯作者　Tel:(027)68890106;E-mail:kelichen@126.com
DOI :10.16155/j.0254-1793.2010.11.033
柏总黄酮进行了纯化工艺研究 ,报道如下 。
1　仪器与材料
U-2001型紫外分光光度计 (日本 Hitachi);
BP-211D型十万分之一分析天平(西德 Sartorius)。
所用试剂均为分析纯 ,水为蒸馏水。
江南卷柏 SelaginelamoelendorfiHieron的
全草采集于湖北宜昌雾渡河 , 原植物经作者鉴
定 [ 1] 。穗花杉双黄酮对照品 [ 9] 本实验室自制 ,
HPLC测定质量分数 99.0%以上 。 D101 , AB-
8 , HPD100型大孔树脂购于国药集团化学试剂有
限公司 。
2　方法与结果
2.1　对照品溶液的制备和标准曲线的绘制
精密称取减压干燥至恒重的穗花杉双黄酮对照
品适量 ,加甲醇超声溶解并定容至 25mL量瓶中 ,制
成 0.0172 mg·mL-1对照品溶液。
分别精密移取穗花杉双黄酮对照品溶液 0,
1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 mL于 10 mL量瓶中 ,加
甲醇至刻度 。照紫外 -可见分光光度法 ,以相应试
剂为空白于 270 nm波长处测定吸收度 ,以吸收度
(A)为纵坐标 ,质量浓度(C)为横坐标绘制标准曲
线 ,得回归方程:
A=86.744C-0.0015　r=0.9994
线性范围为 0.00172 ～ 0.00602mg· mL-1。
2.2　样品溶液的制备　称取粉碎成粗粉的江南卷
柏药材 50g,加 9倍 85%乙醇回流提取 2次 ,每次 1
h,滤过 ,合并滤液后浓缩至小体积 ,用适量石油醚萃
取脱脂 ,再以少量热稀醇超声溶解 , 抽滤后定容至
125mL作为样品溶液 。从中精密吸取 0.1 mL定容
至 100 mL量瓶中 ,按照标准曲线项下方法进行含量
测定 ,测得总黄酮浓度为 5.20 mg· mL-1(药材浓度
为 0.4g· mL-1)。
2.3　大孔树脂的预处理　以 95%乙醇浸泡树脂 24
h,充分溶胀后 ,除去上浮树脂碎片和杂物 ,用湿法装
柱 ,以 95%乙醇在柱上流动清洗 ,不时检查流出液
至乙醇与水混合(1∶5)不呈白色混浊为止 ,然后以
大量蒸馏水洗去乙醇至无醇味 ,备用 。
2.4　树脂的筛选　精密称取 3种吸附树脂各 10 g,
95%乙醇湿法装柱(1.5 cm×20 cm),以大量蒸馏
水洗至无醇味。精密吸取样品溶液 20 mL,流速 1
BV·h-1上柱 ,过柱液重吸附 1次 。收集过柱液 ,以
蒸馏水洗脱至无色 ,合并 ,得液体样品 ,测其总黄酮
含量。再以 70%乙醇洗脱至无色 ,分别收集各段洗
脱液 ,得液体样品 ,测其总黄酮浓度 ,计算各部分总
黄酮含量 ,结果见表 1。由表 1可见在 3种树脂中 ,
用 D101型树脂纯化江南卷柏总黄酮 ,其吸附量和
洗脱量最高 ,故确定 D101型树脂为纯化江南卷柏
总黄酮的最佳树脂 。
表 1 3种树脂对江南卷柏总黄酮的吸附作用
Tab1 Adsorbtionactionof3 kindsofmacroporous
resinontotalflavonoids
树脂
类型(res-
intype)
上柱总黄酮量
(thecolumna-
mountoftotal
flavonoids)/mg
　过柱液与水洗
脱总黄酮量(than
liquidwatercol-
umnelutionvol-
umeoftotalfla-
vonoids)/mg
　吸附量
(adsorp-
tive ca-
pacity)/
mg
　70%醇洗
脱量
(elutionvol-
umeof70%
alcohol)/mg
D101 104 26.20 77.80 70.80
AB-8 104 30.16 73.84 60.55
HPD100 104 37.44 66.56 51.52
2.5　D101型树脂纯化江南卷柏总黄酮工艺参数的
考察
2.5.1　洗脱剂浓度的确定　准确称取处理好的
D101型树脂 10 g,共 4份 ,湿法装柱 , 10 mL样品
溶液以流速 1 BV· h-1上柱 ,吸附完全后 ,用蒸馏
水洗至无色 ,再分别用 10%乙醇 、30%乙醇 、50%
乙醇 、70%乙醇各 100 mL洗脱 ,分别收集各洗脱
液 ,得液体样品 ,测其总黄酮浓度 ,计算各部分总
黄酮含量及回收率 。结果见表 2。可见 ,总黄酮主
要集中于 70%乙醇洗脱液中 , 其含量达到 44.7
mg,回收率达到 85.96%。故确定洗脱剂为 70%
乙醇。
表 2 D101型树脂用不同浓度乙醇洗脱所得
总黄酮含量及回收率
Tab2 Contentandrecoveryrateoftotalflavonoidsin
eluentelutedwithdifferentconcentrationsofethanol
throughD101macroporousresin
10%乙醇洗
脱液 (10%
ethanolelu-
ate)
30%乙醇洗
脱液 (30%
ethanolelu-
ate)
50%乙醇洗
脱液(50%
ethanolelu-
ate)
70%乙醇洗
脱 液 (70%
ethanol elu-
ate)
　总黄酮含
量 (content
oftotalfla-
vone)/mg
4.7 18.6 30.2 44.7
　总黄酮回
收率(recov-
eryoftotal
flavone)/%
9.04 35.77 58.08 85.96
—2041—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(11)
2.5.2　树脂上样量的确定　准确称取 4.0, 8.0, 12.0
g已处理好的大孔树脂 ,分别湿法装柱 ,精密吸取 10
mL上柱溶液 ,以 1 BV·h-1流速上柱 ,过柱液重吸附
1次 ,经充分吸附后 ,收集吸附后过柱的样品溶液 ,测
定其中总黄酮的浓度 ,计算吸附量及吸附百分率 ,结
果见表 3。结果显示 ,树脂的比例越高 ,总吸附量越
高;但当药材量与树脂量比为 1∶3时 ,吸附百分率已
经达到 96%,因此确定药材量与树脂量比为 1∶3。
表 3 不同比例上样量对树脂吸附的影响
Tab3　AdsorptiverateofD101 resinondifferent
proportionsofsamplingquantity
10mL溶液
通过的树脂
量 (10 mL
solution
throughthe
amount of
resin)/g
　折算药材量
∶树脂量(vol-
ume discount
medicine:resin
content)/g:g
　吸附后过柱
液浓度 (over
columnconcen-
trationafterad-
sorption)/mg·
mL-1
总吸 附量
(total ad-
sorption)/mg
吸附百分
率 (adsorp-
tionpercent-
age)/%
4.0 1∶1 1.37 38.30 73.65
8.0 1∶2 1.04 41.62 80.04
12.0 1∶3 0.16 50.41 96.94
2.5.3　洗脱速率的确定　准确称取处理好的 D101
型树脂 10 g,共 4份 ,湿法装柱 , 10 mL样品溶液以
流速 1 BV· h-1上柱 ,吸附完全后 ,用蒸馏水洗至无
色 ,用 100 mL70%乙醇洗脱 ,流速分别为 1 BV·
h-1 、2 BV· h-1 、3 BV· h-1、4 BV· h-1 ,分别收集
各洗脱液 ,得液体样品 ,测其总黄酮浓度 ,计算各部
分总黄酮含量及回收率 。结果见表 4。可见 ,以 1
BV·h-1的流速洗脱时 ,总黄酮回收率最高 ,但与 2
BV·h-1洗脱相差不大 ,为提高效率 ,故选用 2BV·
h-1的流速进行洗脱。
表 4 洗脱速率对总黄酮回收率的影响
Tab4 Influenceofelutingvelocityonrecovery
rateoftotalflavonoids
流速(flowrate)/BV· h-1 1 2 3 4
总黄酮含量(contentoftotalflavone)/mg 45.3 45.0 39.4 36.6
总黄酮回收率(recoveryoftotalflavone)/% 87.12 86.54 75.77 70.38
2.5.4　洗脱液体积的确定 　准确称取处理好的
D101型树脂 10 g,湿法装柱 , 10 mL样品溶液以流
速 1 BV· h-1上柱 ,吸附完全后 ,用蒸馏水洗至无色
后 ,用 100 mL70%乙醇以 2BV·h-1的速度洗脱 ,
按树脂床体积收集洗脱液(10mL),得液体样品 ,测
其总黄酮浓度 。结果见表 5。结果显示 ,第 8份洗
脱液中总黄酮已经很少 ,可认为树脂柱上吸附的总
黄酮已经洗脱完全 ,故确定洗脱剂用量为 8 BV。
表 5 洗脱剂用量的确定
Tab5 Determinationofeluentvolume
序号
(ordernumber)
/10mL/流分
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
浓度
(concentration)
/mg·mL-1
0.09 0.51 0.88 1.47 0.81 0.46 0.23 0.02 0.02 0.02
2.5.5　树脂重复使用次数考察 　按上述确定的
吸附洗脱条件 ,取样品溶液过柱 , 在同一根柱上
重复操作 4次 ,分别计算 4次的总黄酮的纯度和
回收率 。结果见表 6。可见 , 树脂重复使用 3次
后 ,对总黄酮的吸附已明显下降 , 需要再生后才
能继续使用 ,故树脂的连续重复使用次数不得超
过 3次 。
表 6 树脂使用的次数对总黄酮回收率的影响
Tab6 Influenceoftimesofresinbeingusedon
recoveryrateoftotalflavonoids
使用次数
(frequencyofuse)
总黄酮纯度
(purityoftotalflavonoids)/%
总黄酮回收率
(recoveryoftotalflavone)/%
1 51.6 87.8
2 50.2 86.4
3 49.3 85.3
4 40.1 78.8
3　小结和讨论
3.1　由于江南卷柏醇提液中含有大量叶绿素等脂
溶性杂质 ,为防止其对大孔树脂的毒害 ,故先以石油
醚脱脂 ,再制备成样品溶液过柱。
3.2　我们的前期研究发现 ,江南卷柏总黄酮主要含
穗花杉双黄酮 ,含量约占 80%以上 [ 9] 。故总黄酮的
含量测定选择穗花杉双黄酮作为对照品 。
3.3 江南卷柏总黄酮中含有大量脂溶性成分双黄
酮 ,难以完全溶解于水 ,因此按照常规先溶于水再上
样于大孔吸附树脂上的方法是不可取的 。本方法用
稀醇溶液溶解粗提取物 ,再上样 ,回收率可达 85%,
证明是可行的 。
3.2　通过对影响大孔树脂吸附及解吸的各种因
素进行研究 ,最后确定了大孔树脂分离江南卷柏
总黄酮的工艺为:选用 D101大孔树脂 ;药材量与
树脂量的比例为 1∶3;以 8 BV70%乙醇洗脱 ,流
速为 2 BV· h-1;树脂可连续使用 3次 (使用后可
再生再用)。用该工艺所得总黄酮产品的含量可
达 50%,回收率可达 85%,且具有较好的重现
性 。
—2042— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(11)
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(本文于 2010年 2月 1日收到)
《药物分析杂志 》继续被评为 2010年度中国科协精品科技期刊示范项目
　　按照 《中国科协精品科技期刊工程项目管理办法(试行)》的有关规定 ,中国药品生物制品检定所
(以下简称中检所)《药物分析杂志 》参与了 2009年度精品科技期刊示范项目和英文版期刊国际推广项
目总结验收及 2010年度精品科技期刊新增示范项目评审工作。根据中国科协学函 [ 2010] 59号文的评
审结果 , 《药物分析杂志 》继续成为 2010年度精品科技期刊示范项目 C类项目。在这次评选中 ,中国科
协所属全国学会主办 960余种科技期刊中 ,有 92种期刊被列为 2010年度精品科技期刊示范项目 ,其中
A类项目 7项 、B类项目 40项 、C类项目 45项 ,各类项目资助额度分别为每项 25、15、5万元 /年 。中国
科协从 2006年开始评选精品期刊项目至今 ,中检所 《药物分析杂志 》已连续 5年被评为中国科学精品
期刊示范项目(C类)。
—2043—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(11)