全 文 ：高，达到 13． 46%，小于 25 岁的孕妇人群次之为
12. 07%，而 30 岁以上孕妇人群阳性率最低仅为
2. 56%，这与 HEV主要感染青壮年人群相符［1，2］。妊
娠晚期孕妇感染 HEV危害最为严重，HEV 可以通过
从母体传播给胎儿，造成母子极高的病死率［10］。研
究表明孕妇在妊娠晚期具有较高的 HEV IgG 抗体阳
性率［7 ～ 9］。本次调查发现，妊娠晚期孕妇阳性率为
10%与妊娠中期(10． 75%)持平，没有明显升高。但
是我们在妊娠早期孕妇中仅检测到 1 份 HEV IgG 阳
性病例，阳性率为 6． 25%，这可能与本次调查中妊娠
早期血清样本数较少有关。昆明市孕妇人群散发存
在 HEV感染，应进一步进行 HEV RNA 检测，若确诊
为急性 HEV感染，需进行及时有效的治疗，力争减少
HEV感染对孕妇和胎儿造成的损失。
参考文献
1 Radha Krishna Y，Saraswat VA，Das K，et al． Clinical features and
predictors of outcome in acute hepatictis A and hepatitis E virus hepa-
titis on cirrhosis［J］． Liver Int，2009，29(3) :392 － 398
2 Mamun － Al － Mahtab，Rahman S，Khan M，et al． HEV infection as
an aetiologic factor for acute hepatitis:experience from a tertiary hospi-
tal in Bangladesh［J］． J Health Popul Nutr，2009，27(1) :14 － 19
3 Aggarwal R． Clinical presentation of hepatitis E［J］． Virus Res，
2011，161(1) :15 － 22
4 Boccia D，Guthmann JP，Klovstad H，et al． High mortality associated
with an outbreak of hepatitis E among displaced persons in Daffur，Su-
dan［J］． Clin Infect Dis，2006，42(12) :1679 － 1684
5 周乙华，庄辉． 中国戊型肝炎流行病学研究进展［J］． 中华流行
病学杂志，2010，31(2) :1414 － 1416
6 屈勇刚，朱光泽，孙中锋，等．戊型肝炎流行病学研究进展［J］． 传
染病信息，2007，20(2) :86 － 89
7 Adjei AA，Tettey Y，Aviyase JT，et al． Hepatitis E virus infection is
highly prevalent among pregnant women in Accra，Ghana［J］． Virol
J，2009，6(1) :108
8 Caron M，Kazanji M． Hepatitis E virus is highly prevalent among
pregnant women in Gabon，central Africa，with different patterns be-
tween rural and urban areas［J］． Virol J，2008，5:158
9 Kuniholm MH，Purcell RH，McQuillan GM，et al． Epidemiology of
hepatitis E virus in the United States:results from the Third National
Health and Nutrition Examination Survey，1988 － 1994［J］． J Infect
Dis，2009，200(1) :48 － 56
10 Navaneethan U，Al Mohajer M，Shata MT． Hepatitis E and pregnan-
cy:understanding the pathogenesis［J］． Liver Int，2008，28(9) :1190
－ 1199 (收稿:2012 － 03 － 10)
(修回:2012 － 03 － 27)
基金项目:浙江省中医药管理局课题(2008CB023)
作者单位:310053 杭州，浙江高等医学专科学校(王索安、仇容、沈健、陈健、刘丹丹) ;甘肃省医学科学研究院(王小琦、张晓文) ;浙江理工大
学生命科学院(徐涛)
祁连圆柏提取物诱导人肝癌细胞 Bel － 7402 凋亡的
作用及筛选研究
王索安 王小琦 徐 涛 仇 容 沈 健 陈 健 刘丹丹 张晓文
摘 要 目的 探讨祁连圆柏提取物体外对人肝癌细胞 Bel － 7402 体外增殖抑制、凋亡作用机制并进行有效组分筛选研
究。方法 采用硅胶柱层析法提取祁连圆柏有效抗瘤组分，分光光度法测定含量。用克隆形成实验、台盼蓝拒染法及 MTT显色
法检测祁连圆柏提取物对 Bel － 7402 细胞增殖的影响，流式细胞术检测其诱导细胞凋亡的细胞周期阻滞状况及凋亡率，免疫组
化观察对 Bcl － 2 与 Bax蛋白的表达水平，光镜、电镜观察凋亡细胞的组织形态和超微结构变化。结果 祁连圆柏提取物对 Bel －
7402细胞增殖有明显的抑制作用，其中 C液 －组分 － 3 细胞的半数抑制浓度为 2． 47μg /ml。流式细胞检测结果 G0 /G1 期细胞增
多，G2 /M期细胞减少，其中 10 ～ 50μg /ml的祁连圆柏 C液 －组分 － 3 在 G1 期细胞前出现典型“凋亡峰”;免疫组化 SP法检测实
验组细胞 BCL － 2 基因蛋白表达降低，Bax基因蛋白表达增加。光镜与电镜下均见凋亡细胞明显增多。结论 祁连圆柏 C 液 －
组分 － 3 具有显著的抑制 Bel － 7402 细胞增殖以及诱导该细胞系凋亡的作用，其诱导 Bel － 7402 细胞凋亡的作用与其上调 Bax、
下调 Bcl － 2 蛋白的表达，激活 Bax凋亡基因蛋白及 G0 /G1 期阻滞有关，是其重要的抗肿瘤作用机制。
关键词 祁连圆柏提取物 抗肿瘤 细胞凋亡
Investigation on Induction Apoptosis Effect on Human Hepatoma Cell Line Bel －7402 and Screening Study of Antitumor Active Compounds
of Juniperus przewalskii． Wang Suoan，Wang Xiaoqi，Xu Tao，Qiu Rong，Shen Jian，Chen Jian，Liu Dandan，Zhang Xiaowen． Zhejiang
·76·
医学研究杂志 2012 年 11 月 第 41 卷 第 11 期 ·论 著·
College of Medicine，Zhejiang 310053，China
Abstract Objective To investigate the effect of anti － proliferative and induction apoptosis on human hepatocellular carcinoma Bel
－ 7402 cells of Juniperus przewalskii in vitro and screen the active components． Methods The antitumor active components were extrac-
ted by silica gel column chromatography，and contents were measured by spectrophotometer． The effects of proliferation of Bel － 7402 cells
were analyzed by clone formation assay，trypan － blue and MTT method． The morphological features of cell apoptosis were observed under
light and electrical microscopies． The cell cycle and apoptosis index were detected by flow cytometry (FCM)and the expression of Bax and
Bcl － 2 were tested by immunohistochemical S － P method． Results Juniperus przewalskii significantly inhibited the proliferation of Bel －
7402 cells，which increased cell numbers at the G0 /G1 phase but decreased cell number at the G2 /M phase cells are also found clearly in
histogram following 10，20，50μg /ml C solution s effective component － Group 3 of juniperus przewalskii，which the cell half inhibitory
concentration (IC50)was 2． 47μg /ml and immunohistochemical S － P expression of Bax protein was up － regulated and Bcl － 2 protein was
significantly down － regulated in experimental cell groups． Conclusion The antitumor active compounds of the C － solution － Group 3 of
Juniperus przewalskii can significantly inhibit the proliferation of Bel － 7402 cells． The mechanisms include increasing the expression of
Bax，decreasing the expression of Bcl － 2，the activation of apoptosis gene protein Bax，G0 /G1 phase retardant，which plays the important
role in anti － tumor effect of Juniperus przewalskii on Bel － 7402 cell．
Key words Juniperus przewalskii;Antitumor activity;Cell apoptosis
原发性肝癌是发病率很高的消化道恶性肿瘤，
起病隐匿、临床就诊者多属中晚期，手术切除率低，因
此寻找有效的抗肿瘤天然药物是目前抗肿瘤药物发
展的重要方向［1］。祁连圆(juniperus przewalskii，JP)
系柏科植物、是常用中藏药，既往体外研究资料表明
JP醇提物对人的乳腺癌，肺癌，口腔上皮癌具有杀伤
作用，但抗肿瘤机制不明［2］。本课题组以往研究表
明 JP醇提浸膏对人胃癌 SGC － 7901 细胞有明显的
增殖抑制和诱导凋亡的作用［3］。本实验以体外培养
Bel － 7402 细胞为研究对象，采用硅胶层析法观察不
同浓度 JP提出物 C 液 －组分 1、2、3、4、5、6 对 Bel －
7402 细胞生长抑制及凋亡作用，并探讨其药物作用
机制。
材料与方法
1．材料:(1)药品及细胞系:祁连圆柏，青海大学医学院惠
赠。人肝癌细胞株 Bel － 7402 细胞，兰州军区总医院药局实
验室惠赠。培养液:RPMI － 1640［Sigma 公司产品，用前加双
抗、青霉素(100U /ml)、链霉素(100μg /ml) ］。小牛血清:杭州
四季青生物工程公司产品，56℃水浴，－ 20℃保存。0． 25%胰
酶、0． 02% EDTA、Hanks 液、3． 7% NaHCO3 等试剂自配。CO2
培养箱(NATURE，USA)。(2)药物制备:取 JP2000g，以 50%
乙醇浸渍后渗漉，得到 50%乙醇渗漉液和残渣。用 50%乙醇
渗漉液减压浓缩至浸膏，得 50% 醇提浸膏。同上方法取
JP2000g，以 95%乙醇浸渍后渗漉，得 95%乙醇提总浸膏。将
总浸膏分散于 1000ml水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇
萃取。另取 JP2000g 水煎后乙酸乙酯、正丁醇萃取。将以上
提取 6 部分减压除去有机溶剂，50℃真空干燥，回收溶剂得以
上相应 6 种提取物。取各提取物适量，用生理盐水配成所需
浓度，脂溶物以二甲亚砜(DMSO)助溶，DMSO 最终浓度 ＜
0. 05%。过滤除菌，4℃保存备用。(3)JP 提取物抗肿瘤活性
筛选:1)药物剂量的设制:选择 JP20． 0μg /ml 剂量浓度，取已
配制的 A液(50%醇提浸膏)、B 液(醇提石油醚萃取)、C 液
(醇提乙酸乙萃取)、D液酯(醇提正丁醇萃取)、E 液(水煎乙
酸乙酯萃取)、F液(水煎正丁醇萃取)相应剂量的药液进行药
理活性筛选。2)硅胶层析法:取 200 目硅胶(70 倍上样量) ;
装柱，用洗脱剂冲洗致平衡。溶剂洗脱系统利用薄层层析选
择，先后选用石油醚脱脂 －甲醇:水(1∶ 1) ;乙酸乙酯 －丙酮;
氯仿 －甲醇。点样结果发现氯仿 －甲醇(1∶ 1)作洗脱系统展
开最好。过柱和收集。选用氯仿 －甲醇(1∶ 1)洗脱，经硅胶柱
层析法分离出 6 个色带，分别收集各色带，命名为 JP提取物 C
液组分 1、2、3、4、5 和组分 6。3)检测:用专用喷显剂，结合紫
外灯下观察。送谱，收集的产品旋干，在送谱前通常需要重
结晶。(4)BCL － 2 及 Bax鼠抗人单克隆抗体、过氧化物酶标
记的链霉卵白素染色试剂盒购自北京中山生物技术有限公
司。
2．方法:(1)细胞复苏及转代:常规方法复苏细胞，倒置显
微镜下观察培养瓶内细胞长满单层后弃掉培养液。加入适量
0． 25%胰酶液(覆盖瓶底) ，置 37℃环境中消化 1 ～ 2min。加
入适量的 Hanks 液轻轻洗一遍后加入含 15% 小牛血清的
1640 液 5ml 吹打制成细胞悬液，按 2 × 105 个 /毫升浓度接种
培养。(2)细胞增殖抑制试验(MTT 还原法) :取培养细胞以
2 × 105 个 /毫升的密度分别接种于 96 孔板，其中 2 孔只加
RPMI1640 培养液，每孔 100μl，作空白对照;其余每孔各加细
胞悬液 90μl。给药组:JP 提取物 C 液 －组分 3、设 5 个浓度
(1. 0、5． 0、10． 0、20． 0、50． 0μg /ml) ，每孔加药 10μl;5 － FU组:
每孔加 5 － FU(10μg /ml)10μl;对照组加等量 PBS 液;溶剂对
照组加等量 DMSO。每组设 4 个重复孔。置 5% CO2 孵育箱
中 37℃，饱和湿度条件培养 48h 后，加 MTT，每孔 10μl，孵育
4h。移入 0． 5ml离心管，1000r /min离心 5min，弃去上清液，每
孔加 DMSO 100μl，置入 SHZ － 82 型气浴恒温振荡器(常州医
疗器件厂生产)37℃振荡 10min，用酶联免疫检测仪在 490nm
·86·
·论 著· J Med Res，Nov 2012，Vol． 41 No． 11
处测其 OD值，计算细胞生长抑制率(IR)。抑制率计算公式:
抑制率 =(1 －试验组 OD 值)× 100% /对照组 OD 值。(3)台
盼蓝拒染法实验:取细胞浓度为 1 × 105 个 /ml，接种于 96 孔
培养板，90 微升 /孔，培养 24h 后，给药组分别加入 JP 提取物
C液 －组分 － 3、50． 0、20． 0、10． 0、5． 0 和 1μg /ml，10 微升 /孔，
对照组加 PBS 液，10 微升 /孔，阳性对照组加 5 － FU(10μg /
ml) ，10 微升 /孔，各设 4 个重复孔。置 5% CO2 孵育箱中
37℃，饱和湿度条件培养，分别于培养 12、18、24 和 48h 后各
取 1 板，加 0． 4%台盼蓝 10 微升 /孔，用血球计数板在光镜下
计活细胞数，取平均值，以时间为横坐标，活细胞数为纵坐标
作图。(4)克隆形成实验:药物琼脂的制备:观察 JP 提取物 C
液 －组分 3 对 Bel － 7402 细胞分裂的抑制作用 －称取琼脂粉
10g，放入 250ml锥形瓶中加 PBS 液 200ml，高压灭菌。取 5ml
琼脂放入烧杯，待冷至 50℃时加入 45ml RPMI1640 培养液
(37℃)混匀，加入 16 孔板(1ml) ，加药 20 微升 /孔，混匀，室温
冷却凝固。取 HL － 60 细胞培养液(细胞 1 × 103 个 /毫升)
47ml加入烧杯，加琼脂 3ml(50℃)混匀后加入有低层琼脂的
16 孔板(1 毫升 /孔) ，琼脂凝固后在细胞孵箱中培养 7 天，倒
置显微镜计数 50 个细胞以上的克隆。计算公式:克隆形成抑
制率(%)=(对照组克隆形成数 －实验组克隆形成数 /对照
组克隆形成数)× 100%。
3．流式细胞术检测:碘化丙啶(PI) (Sigma 公司产品)。
流式细胞仪(Coulter epics XL 美国 Coulter 公司)。收集实验
组和对照组细胞各约 1 × 105 个，用 PBS 洗涤后离心 3 次。用
70%冰乙醇在 － 20℃冰箱固定 24h，离心去乙醇，PBS 洗涤
(5min × 2 次)、离心(1000r /min)3min，弃上清液。加入 Rnase
A(50μg /ml)37℃温育 30min 后，加 10μl PI(50μg /ml)置 4℃
暗处作用 20min。采用 Coulter epics XL 流式细胞仪进行细胞
周期分析，检测计算细胞亚二倍体的百分率。计算细胞增殖
指数(PI) :细胞增殖指数(PI)=
G2 /M + S
G0 /G1 + G2 /M + S
。
4．免疫组织化学染色:(1)细胞爬片制作:取对数生长期
细胞，调整细胞密度接种在置有载波片 24 孔的培养皿，实验
组加入 20μg /ml JP 提取物 C 液 － 组分 － 3，对照组加等量
1640 培养液，常规培养，于加药后 48h 终止培养，取出爬有细
胞的玻片，0． 01mol /L PBS洗涤 3 次，以 95%乙醇固定 20min，
染色步骤严格按 SP 免疫组化染色法试剂盒说明书操作，以
PBS代替一抗作阴性对照，检测鼠抗人单克隆抗体 Bcl － 2、
Bax表达水平。染色结果的判断:免疫组化结果用 NYD －1000
型图像分析仪处理，随机选取 10 个高倍视野的肿瘤细胞共
1000 个，计算每 100 个细胞中的阳性细胞数。
5．分光光度仪检测:连续波长分光光度仪(molecular de-
vices)美国分子仪器，SPECTRA． max plus． JP提取物 C 液 －组
分 1、2、3、4、5 和 6 添加甲醇稀释至 400 倍后、用紫外分光光度
法检测 OD290，空白对照选用甲醇。
6．光镜、电镜观察细胞形态:光镜观察:倒置相差显微镜:
(Olympus CKX，Japan) ，培养瓶中接种 1 × 105 个细胞，培养
24h，生长良好者，用不同浓度(1． 0、5． 0、10、20、50μg /ml)JP
提取物分别处理 24、48、72h，每 12h观察并照相记录用药组和
对照组细胞的形态变化。透射电镜观察细胞超微结构:EM －
400投射电镜，Philip公司生产。收集各组离心细胞团块各约
1 × 107 个，PBS 清洗 10min × 2 遍。2． 5%戊二醛 4℃前固定
2h，PBS漂洗 15min × 3 遍。常规方法切片(50 ～ 100nm)、柠檬
酸铅染色。
7．统计学方法:实验数据用均数 ±标准差(x ± s)表示，采
用方差分析，两两比较采用 Dunnett － t 检验。应用 SPSS 13． 0
统计软件包进行分析，以 P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
结 果
1． MTT法:(1)前期实验结果表明，JP 提取物 A
液 ～ F液、以 C液(醇提乙酸乙酯萃取)对 Bel － 7402
细胞的抑制作用最强，见表 1。因此选用 C 液(醇提
乙酸乙酯萃取)做为硅胶层析法中的上样。(2)JP提
取物 C液 －组分 1、2、3、4、5、6(醇提乙酸乙酯萃取)
在体外 48h 可明显抑制 Bel － 7402 细胞的增殖，以
10μg /ml以上浓度作用更为明显，且呈现明显的剂量
依赖性的特点(图 1)。以药物不同浓度的对数和抑
制率作图，按 Y = ax + b方程式求出 JP不同提取物对
HL －60 细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为 C 液 －
组分 1、2、3、4、5、6 依次为 43． 59、14． 57、2． 47、72． 56、
106． 91 及 144． 9μg /ml，结果表明 JP提取物 C液 －组
分 － 3 效果最好。(3)给予 5 － FU和 50． 0、20． 0、10、
5． 0、1． 0μg /ml JP 提取物 C 液 －组分 3，培养 48h 后
测得对 Bel － 7402 细胞的抑制率分别为 61． 9% 和
81． 5%、73． 5%、63． 3%、59． 3%、39． 9%，呈现剂量 －
效应关系(表 2)。
表 1 JP提取物 A液 ～ F液 20μg /ml对 BEL －7402 细胞的抑制作用(x ± s，n = 4)
项目 A液 B液 C液 D液 E液 F液 对照
OD 0． 282 ± 0． 05 0． 252 ± 0． 06 0． 202 ± 0． 021* 0． 363 ± 0． 08 0． 314 ± 0． 06 0． 402 ± 0． 10 0． 463 ± 0． 12
IR(%) 39． 1 ± 5． 2 45． 6 ± 5． 4 56． 3 ± 8． 1 21． 6 ± 3． 3 32． 2 ± 4． 5 13． 1 ± 1． 8
2．台盼蓝拒染法:分别给予 5 － FU 和 JP 提取物
C液 －组分 3，50． 0、20． 0、1． 0、5． 0、1． 0μg /ml 后培
养 12、24 和 48h，0． 4% 台盼蓝染色后计活细胞数
结果可见活细胞数随药物浓度的增加和作用时间的
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医学研究杂志 2012 年 11 月 第 41 卷 第 11 期 ·论 著·
图 1 JP不同浓度及不同提取物 C液 －组分
－1，2，3，4，5，6 对 Bel －7402 细胞抑制作用
JP不同浓度及不同提取物 C液 －组分 1、2、3、4、5、6 为 A、B、C、
D、E、F
延长而减少;抑制率至 48h 时分别达到 69． 5% 和
84. 7%、68． 5%、63． 1%、59． 0%、42． 3%(表 3)。
3．克隆形成实验:计数结果可见 Bel － 7402 细胞
在含有 5 － FU 和 JP 提取物 C 液 －组分 3，在 50． 0、
20． 0、1． 0、5． 0、1． 0μg /ml的培养基中培养 7 天，克隆
形成数随药物浓度的增加而减少，抑制作用增强。5
－ FU 组 51． 0%，抑制作用与药物剂量呈正相关。抑
制率分别为 86． 9%、63． 9%、57． 6%、48． 7%、
32. 7%，计算出对 Bel － 7402 细胞的半数抑制浓度
(IC50)为 4． 57μg /ml。
表 2 JP提取物 C液组分 3(醇提乙酸乙酯萃取)对 Bel －7402 细胞的抑制作用(x ± s，n = 4)
项目 1μg /ml 5μg /ml 10μg /ml 20μg /ml 50μg /ml 5 － FU 对照
OD 0． 295 ± 0． 08* 0． 20 ± 0． 03* 0． 18 ± 0． 02＊＊ 0． 13 ± 0． 04＊＊ 0． 091 ± 0． 01＊＊ 0． 187 ± 0． 017＊＊ 0． 491 ± 0． 13
IR(%) 39． 9 ± 4． 3 59． 3 ± 7． 3 63． 3 ± 8． 1 73． 5 ± 7． 9 81． 5 ± 8． 5 61． 9 ± 8． 3
与对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01
表 3 JP提取物 C液 －组分 3、对 Bel －7402 细胞的毒性不良反应 －台盼蓝法［x ± s(4 × 104 cell /ml) ，n = 4］
项目 50μg /ml 20μg /ml 10μg /ml 5μg /ml 1μg /ml 5 － FU 对照 IC50(μg /ml)
12h 25． 0 ± 5． 9* 26． 23 ± 2． 5* 31． 5 ± 3． 7* 33． 2 ± 6． 8* 44． 2 ± 3． 8* 33． 4 ± 6． 8* 84． 5 ± 13
IR(%) 69． 1 65． 8 62． 3 56． 3 48． 6 60． 9 1． 32
24h 13． 1 ± 3． 5* 26． 0 ± 11* 29． 9 ± 14* 35． 3 ± 10． 7* 39． 8 ± 5． 0* 23 ± 1． 5* 68． 9 ± 8． 3
IR(%) 79． 8 62． 9 53． 7 48． 3 43． 8 69． 6 3． 60
48h 8． 3 ± 3． 3* 19． 6 ± 3． 5* 23． 5 ± 4． 8* 26． 3 ± 5． 9* 38． 1 ± 7． 5* 27 ± 3． 9* 73． 3． ± 10
IR(%) 84． 7 68． 5 63． 1 59 42． 3 69． 5 2． 4
与对照组比较，* P ＜ 0． 01
4．流式细胞术检测结果:FCM 检测结果见表 4。
结果表明不同浓度的 JP 提取物 C 液 －组分 3 对 Bel
－ 7402 细胞具有显著的细胞周期阻滞作用，药物作
用 48h后，随药物浓度的增加、细胞增殖指数(PI)降
低，G2 /M期细胞明显减少，Bel － 7402 细胞主要被阻
滞在 G0 /G1 期(表 4)。Bel － 7402 细胞经不同浓度的
JP提取物 C液 －组分 3、48h 诱导后在 FCM 检测的
含量图中，在 G1 期细胞前出现亚二倍体峰，既凋亡
峰，表明细胞 DNA 降解，渗漏导致 DNA 染色能力下
降，凋亡峰随药物剂量增加而升高(表 4、图 2)。
表 4 JP提取物 C液 －组分 －3对 Bel －7402细胞周期的影响
组别
细胞分裂周期
G0 /G1 S G2 /M
细胞凋亡
率(%)
细胞增
殖指数
对照组 36． 6 44． 5 18． 9 0． 63
50． 0μg /ml 48 41． 1 10． 9 23． 3 0． 52
20． 0μg /ml 63． 6 27． 1 9． 3 21． 0 0． 36
10． 0μg /ml 65． 5 21． 2 13． 3 16． 1 0． 34
5． 0μg /ml 64． 6 31． 1 4． 3 8． 9 0． 35
1． 0μg /ml 54． 1 38． 7 7． 2 4． 9 0． 46
图 2 FCM检测结果
A．对照组;B．实验组(经 JP提取物 C液组分 3、50μg /ml 48h处理) ;C．实验组(经 JP提取物 C液 －组分 3、20μg /ml 48h处理)
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·论 著· J Med Res，Nov 2012，Vol． 41 No． 11
5．免疫组织化学检测结果:免疫组化检测结果见
表 5。Bcl － 2 阳性信号位于胞质内，呈棕黄色细颗粒
状。Bax蛋白阳性染色呈棕黄色细颗粒状，大多弥漫
分布于细胞质中，可见少量在核膜及胞膜表达，呈弥
漫分布。经 JP提取物 C液 －组分 － 3 诱导后对照组
与实验组相比 Bcl － 2 明显下调、Bax 明显上调，差异
具有统计学意义(P ＜ 0． 01)。
表 5 48h Bcl －2、Bax免疫组化检测结果(x ± s)
组别 复孔数 Bcl － 2 Bax
对照组 6 23． 54 ± 2． 27 9． 67 ± 0． 8
20μg /ml 6 12． 36 ± 1． 89* 24． 66 ± 2． 35*
50μg /ml 6 8． 93 ± 1． 06* 32． 16 ± 4． 32*
与对照组比较，* P ＜ 0． 01
6．细胞组织形态学观察:倒置显微镜下观察细胞
的形态学变化可见对照组 Bel － 7402 细胞生长良好，
细胞呈圆形，细胞膜边缘光滑，细胞大小形态一致;实
验组 Bel － 7402 细胞经 JP提取物 C 液 －组分 3 诱导
12h后以 20μg /ml以上浓度作用更为明显，且呈现明
显的剂量依赖性和作用时间的特点。见有少数细胞
皱缩、变圆变小、胞质内出现颗粒、细胞膜完整;24h
后此类细胞进一步增多、部分细胞呈圆形、细胞核与
胞质分辨不清、细胞间隙增大、细胞数目减少;48h 后
细胞数目已显著减少、少量细胞脱落、细胞皱缩、而悬
浮于培养液中、大部分细胞裂解成圆形小体、呈小体
积、碎裂状态。另有部分细胞体积增大、呈圆形或椭
圆形细胞内见颗粒出现。
透射电镜观察，用 20μg /mlJP提取物 C液 －组分
3 诱导 Bel － 7402 细胞 48h 后有凋亡细胞出现，其特
征是胞质浓缩、核固缩，染色质浓缩致密、并凝集成
块、聚集于核膜下呈边聚的状态，某些细胞核形态不
规则，核发生碎裂，染色质呈高度浓缩的致密核，同时
可见凋亡早期个别细胞内线粒体变大、嵴增多，空泡
化、呈基质性肿胀、基质变淡、双层膜结构不清、嵴断
裂、减少、缩短、消失，详见图 3。
讨 论
筛选抗瘤活性成分作用明显、不良反应小、药源
广泛的天然药物是当今抗肿瘤药物发展的方向［4］。
本课题组研究表明，50% JP 醇提浸膏对人胃癌 SGC
－7901 细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡的作
用［3］。本实验以体外培养 Bel － 7402 细胞为研究对
象，药物筛选首先选择 JP、20． 0μg /ml剂量浓度，取已
配制的 A液 ～ F液六种相应剂量的 JP不同提取物进
图 3 细胞超微结构观察结果(× 10000)
A．实验组 JP提取物 C 液组分 3 诱导处理 48h;B． 对照组:未经
加药处理 48h
行药理活性筛选，采用 MTT 显色法，结果表明，JP 提
取物 A液 ～ F液、以 C液对 Bel － 7402 细胞的抑制作
用最好，用 C液浓缩后、经硅胶柱层析法分离到 6 个
色带，分别收集各色带，命名为 JP提取物 C液 －组分
1、2、3、4、5 和组分 6。各组分、分别用甲醇稀释至
400 倍后、用紫外分光光度法测 OD290nm 吸光度值，
空白对照选用甲醇，经化学反应预实验表明主要为黄
酮与二萜类化合物，从而为下一步分离单体做好了前
期工作。已有不少关于黄酮与二萜类化合物对于源
自实体瘤及血液的恶瘤细胞具有明显的抑制增殖和
诱导凋亡作用的研究报道［5，6］。实验结果表明，JP 提
取物 C液 －组分 1、2、3、4、5、6 在体外可明显抑制 Bel
－ 7402 细胞的增殖，以 10μg /ml 以上浓度作用更为
明显，且呈现明显的剂量与时间依赖性的特点。本实
验采用克隆形成法、台盼蓝拒染法及 MTT 显色法相
互验证，结果表明 JP提取物 C液 －组分 3 效果最好，
按体外抑瘤实验药物疗效的评价的标准即合成化合
物或植物提取物纯品的半数抑制浓度 IC50 ＜ 10μg /
ml，或植物粗提物的 IC50 ＜ 20μg /ml，并且有细胞毒性
的剂量依赖关系，其最高抑制效应达 80%以上，说明
本化合物具有良好的抗肝癌细胞增殖抑制作用［7］。
肿瘤细胞的无限增殖是因为监测细胞内基因缺
陷、检测点功能丧失及细胞周期紊乱，因此通过改变
细胞周期阻止肿瘤细胞的无限增殖及诱导瘤细胞凋
亡，对调控肿瘤细胞生长具有重要作用，也是筛选抗
瘤药物的重要观察指标［8，9］。本实验结果显示，以
10μg /ml JP提取物 C 液 －组分 3 作用于 Bel － 7402
细胞后，随着作用时间的延长，凋亡细胞(亚 G1 期细
胞)逐渐增多，细胞主要被阻滞在 Go /G1 期，G2 /M 期
细胞减少。实验组随不同浓度的药物作用后、Bel －
7402 细胞的增殖指数(PI)明显降低。电镜见凋亡细
胞特征呈胞质浓缩、核固缩，染色质浓缩深然并凝集
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医学研究杂志 2012 年 11 月 第 41 卷 第 11 期 ·论 著·
成块、聚集于核膜下呈边聚的状态。对细胞凋亡起重
要调控作用的 Bcl － 2 家族的两个重要成员免疫组化
检测表明，不同浓度的药物作用 48h，随着药物浓度
的增加，Bax基因蛋白的表达水平增加，使 Bcl － 2 与
Bax的比值下调。同源二聚体 Bax、Bax 和异源二聚
体 Bax、Bcl － 2 增多，而 Bcl － 2、Bcl － 2 下降，从而引
起细胞凋亡发生。经 JP诱导后凋亡相关基因 Bax 表
达增强，结果提示 JP C 液 －组分 － 3 具有显著抑制
Bel － 7402 细胞增殖及侵袭性、并可诱导该细胞系凋
亡而发挥抗肿瘤作用。通过上调 Bax 基因蛋白的表
达、下调 BCL － 2 基因蛋白的表达、激活 Bax 凋亡基
因蛋白及 G0 /G1 期阻滞可能是诱导 Bel － 7402 细胞
凋亡的主要机制［10］。
参考文献
1 Moriai R，Tsuji N，Moriai M，et al． Survivin plays as a resistant factor
against tamoxifen － induced apoptosis in human breast cancercells
［J］． Breast Cancer Res Treat，2009，117(2) :261 － 271
2 宗玉英，党合群，骆桂法． 110 种植物藏药进行体外筛选的实验研
究［J］．药学实践杂志，2000，18(5) :290 － 291
3 王索安，陈增良，徐涛，等．祁连圆柏对人胃癌细胞 SGC － 7901 细
胞周期和凋亡的实验研究［J］．中国中医药科技，2010，17(3) :208
－ 210
4 Wang S，Penchala S，Prabhu S，et al． Molecular basis of traditional
chinese medicine in cancer Chemoprevention［J］． Curr Drug Discor
Technol Technol，2010，7(1) :67 － 75
5 Granado—Serrano AB，Martin MA，Bravo L，et al． Quercetin induces
apoptosis via esspace activation，regulation of Bcl － 2，and inhibition of
P1 － 3 － kinase Akt and ERK pathways in a human hepatoma cell line
(HepG2) ［J］． J Nutr，2006，136(11) :2715 － 2721
6 Chen S，Gao j，Halicka HD，et al． The cytostatic and cytotoxic effects of
oridonin (Rubescenin) ，a diterpennoid from Rabdosia rubescens，on
tumor cells of different lineage［J］． Int J Oncol，2005，26(3) :579 －
588
7 司徒镇强，吴军正． 细胞培养［M］． 2 版． 西安:世界图书出版社，
2007:165
8 Boukes GJ，Daniels BB，AIbrecht CF，et al． CelI survivaI or apoptosis:
rooperols role as anticancer agent［J］． OncoI Res，2010:18(8) :365，
376
9 Liu JJ，Zhang Y，Guang WB，et al． Ponicidin inhibits monocytic leuke-
mia cell growth by induction of apoptosis［J］． Int J Mol Sci，2008，9
(11) :2265 － 2277
10 Sun B，Geng S，Huang X，et al． Coleusin factor exerts cytotoxic activity
by inducing G0 /G1cell cycle arrest and apoptosis in human gastric
cancer BGC － 823 cells［J］． Cancer Lett，2011，301(1) :95 － 105
(收稿:2011 － 11 － 27)
(修回:2012 － 02 － 16)
基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11541410)
作者单位:161006 齐齐哈尔医学院第二附属医院(乔洪旺) ;齐齐哈尔医学院组胚教研室(廉洁) ;齐齐哈尔医学院解剖教研室(姚立杰)
通讯作者:姚立杰，电子信箱:yljqhw@ 163． com
肌肉瘤小鼠模型建立及其血管内皮
生长因子 C、D的表达
乔洪旺 廉 洁 姚立杰
摘 要 目的 建立横纹肌肉瘤模型，研究肌肉瘤淋巴道转移机制，为临床肌肉瘤治疗提供理论依据。方法 取清洁级昆
明系小鼠 30 只，用 S180 小鼠癌性腹腔积液，体外培养 S － 180 肉瘤细胞系，待细胞在培养瓶内长满单层后，收集细胞，制成 5 ×
107 /ml的细胞悬液。利用稳定 4 ～ 5 代的瘤细胞，在小鼠臀部相同部位肌层种植，建立肌纤维肉瘤的原位瘤种植模型，观察肿瘤
的生长情况。1 周后处死小鼠，切取瘤体，检测肿瘤体积、重量及开胸、腹观察肿瘤转移情况及不同时期肿瘤血管、淋巴管生长与
肿瘤生长转移的关系。取肿瘤组织包埋制备切片，应用免疫组化、Western blotting 等方法检测血管内皮生长因子 C、D(VEGF －
C、VEGF － D)蛋白质表达。结果 横纹肌肉瘤组织中心区和边缘区均存在淋巴管，数量随肿瘤的生长明显增加，这预示着横纹
肌肉瘤组织中存在淋巴管的增生和新生，其可能与 VEGF － C 和 VEGF － D 的诱导密切相关。结论 横纹肌肉瘤组织(淋巴管)
中 VEGF － C和 VEGF － D的表达增高，VEGF － C和 VEGF － D是重要的促淋巴管形成因子，从而促进横纹肌肉瘤的淋巴道转移。
关键词 VEGF － C VEGF － D 横纹肌肉瘤
Myosarcoma Animal Modeling and Expression of Vascular Endothelial Growth Factor － C and D． Qiao Hongwang，Lian Jie，Yao Lijie．
QiqiHar Medical University，Heilongjiang 161006，China
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