全 文 ：102 2014, Vol.35, No.14 食品科学 ※分析检测
高效液相色谱法测定紫苏中5 种有机酸和
黄酮的含量
秦红英，周光明*，彭贵龙，李俊平
（西南大学化学化工学院，发光与实时分析教育部重点实验室，重庆 400715）
摘 要：目的：建立以甲醇溶液为萃取剂，结合超声辅助萃取，利用高效液相色谱法同时分离测定紫苏中
的咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素5 种有效成分的方法。方法：采用Phenomenex C18色谱柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%冰醋酸溶液，采用梯度洗脱程序；流速1 mL/min；紫外检测波
长320 nm；柱温35 ℃。结果：该方法对咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素分别在0.001 22～61.00
（r=0.999 99）、0.001 06～53.00（r=0.999 99）、0.001 28～64.00（r=0.999 91）、0.001 20～60.00（r=0.999 94）、
0.001 12～56.00 μg/mL（r=0.999 95）范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.999 91，检出限（RSN=3）依次
是：0.101 9、0.392 6、0.355 9、0.286 2、0.202 5 ng/mL；样品回收率为95.79%～101.41%。结论：本法操作简单快
速、定量准确、灵敏度高、成本低、且对环境友好，为紫苏中咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的分
离检测提供了一个有效的方法。
关键词：黄酮；有机酸；超声辅助萃取；高效液相色谱法；紫苏
Determination of Five Organic Acids and Flavonoids in Perilla frutescens by High Performance Liquid Chromatography
QIN Hong-ying, ZHOU Guang-ming*, PENG Gui-long, LI Jun-ping
(Key Laboratory on Luminescence and Real-Time Analysis, Ministry of Education, College of Chemistry and Chemical Engineering,
Southwest University, Chongqing 400715, China)
Abstract: Objective: A simple high performance liquid chromatography (HPLC) method has been developed for the
simultaneous quantification of caffeic acid, ferulic acid, rosmarinic acid, luteolin and apigenin from Perilla frutescens using
methanol as extractant with ultrasonic-assisted extraction. Methods: The five compounds were isolated by using a Phenomenex
C18 column by gradient elution, and the mobile phase was methanol-0.1% acetic acid solution with a flow rate of 1.0 mL/min.
The UV detection wavelength was performed at 320 nm. Results: The linear ranges for caffeic acid, ferulic acid, rosmarinic
acid, luteolin and apigenin were determined to be 0.001 22–61.00, 0.001 06–53.00, 0.001 28–64.00, 0.001 20–60.00 and
0.001 12–56.00 μg/mL, respectively, and the correlation coefficients were 0.999 99, 0.999 99, 0.999 91, 0.999 94 and 0.999 95,
respectively. The limits of detection (LOD) were 0.101 9, 0.392 6, 0.355 9, 0.286 2 and 0.202 5 ng/mL, respectively. The
average recoveries of these compounds in spiked real samples were in the range of 95.79%–101.41%. Conclusion: The
proposed method is simple, precise, specific, sensitive and accurate. It provides a new and scientific means for routine quality
control of Perilla frutescens.
Key words: organic acids; flavonoids; ultrasonic-assisted extraction; high performance liquid chromatography; Perilla frutescens
中图分类号：O652.62 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）14-0102-04
doi:10.7506/spkx1002-6630-201414020
收稿日期：2013-10-10
基金项目：国家自然科学基金面上项目（21277110）
作者简介：秦红英（1989—），女，硕士研究生，研究方向为色谱分析。E-mail：qinruobing@sina.cn
*通信作者：周光明（1964—），男，教授，博士，研究方向为色谱及其联用技术。E-mail：gmzhou@swu.edu.cn
紫苏（Perilla frutescens）为唇形科紫苏属（Perilla
frutescens (L.) Britton）植物紫苏全草，又名白苏、赤苏
等，气清香，味微辛，具有止咳平喘、解表散寒、行
气和胃、理气宽中、止痛安胎等功效，主要用于痰壅气
逆、咳嗽呕恶、风寒感冒、妊娠呕吐、胃脘疼痛、胸膈
痞闷、鱼蟹中毒等病症[1]。现代药理学研究证明，紫苏是
一种极具营养价值的保健资源[2]，主要含有黄酮类化合物、
迷迭香酸、咖啡酸、阿魏酸等多种生物活性成分[3-5]，具有
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良好的抗氧化[6-7]、抗癌[8]、抗炎[9]、抗菌[10]、抗过敏、保
肝[11-12]、降血脂[13]、调节血糖[14]等药理作用。目前虽已
有紫苏中相关活性成分的测定研究报道，如Chen等 [15]
报道了高效液相色谱法分析紫苏中的三萜类化合物的
方法，马尧等 [16]报道了紫外分光光度法测定紫苏中总
黄酮含量的方法，黄亮辉等 [17]报道了高速逆流色谱分
离纯化紫苏叶中迷迭香酸的方法；但同时分离测定紫
苏中有机酸和黄酮的方法尚未见报道，本研究采用超
声辅助萃取及高效液相色谱（high performance liquid
chromatography，HPLC）法分离同时测定了紫苏中咖
啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素5 种有效
成分。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫苏原药材（经西南大学周光明教授鉴定） 当地
药房；咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素
对照品（纯度均≥99%） 上海晶纯实业有限公司；
1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（纯度≥99%） 中国科
学院兰州化学物理研究所；甲醇、乙醇、冰醋酸（均为
分析纯） 重庆川东化工有限公司化学试剂厂；磷酸
（分析纯） 成都市科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
LC-20AT液相色谱输液泵、SPD-20A紫外检测器、
CTO-10AS柱温箱、LC-Solution色谱数据处理系统 日本
岛津公司；KH-3200B型超声波清洗器 昆山禾创超声
仪器有限公司；TGL-16G高速离心机 上海安亭科学仪
器厂；SZ-2自动双重纯化水蒸馏器 上海泸西分析仪器
厂有限公司；LIDA pH计 上海理达仪器厂；FA2004A
型分析天平 上海精天电子仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件
色谱柱为Phenomenex C 18（250 mm×4.6 mm，
5 μm）；流动相：A为体积分数0.1%冰醋酸溶液，B
为甲醇；梯度洗脱程序：0～5 min，45%～53% B；
5～10 min，53%～55% B；10～15 min，55%～60% B；
15～20 min，60%～45% B。流速1 mL/min；进样量
20 μL；检测波长320 nm；柱温35 ℃。
1.3.2 对照品溶液的配制
对照品溶液的制备：分别精密称取咖啡酸、阿魏
酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素对照品适量，甲醇溶
解，分别配制成610 μg/mL咖啡酸、530 μg/mL阿魏酸、
640 μg/mL迷迭香酸、600 μg/mL木犀草素、560 μg/mL芹
菜素的溶液对照品储备液，避光保存，待用。
混合对照品溶液：分别准确吸取3 种对照品储备液
适量，用流动相配制成一系列不同质量浓度的混合对照
品溶液，置于冰箱（4 ℃）内避光保存备用。
1.3.3 供试品溶液的制备
将紫苏于60 ℃干燥至恒质量后粉碎，过60 目筛
（0.5～1.2 mm），干燥条件下保存备用。准确称取0.1 g
紫苏粉末，加入10 mL甲醇，浸泡4 h，超声萃取30 min，
过滤取滤液，离心10 min（3 500 r/min），取上清液经
0.45 μm有机滤膜过滤，进样分析。
2 结果与分析
2.1 色谱条件的选择
为选择最佳的检测条件，本实验比较了CH 3OH-
H2O、CH3OH-CH3COOH、CH3CN-CH3COOH，CH3CN-
H3PO4体系对5 种目标分析物的分离效果。当流动相为
CH3OH-H2O体系时，调节流动相比例，咖啡酸、阿魏
酸、迷迭香酸3 种组分峰不能完全分离，且木犀草素、芹
菜素2 种组分峰拖尾严重。当流动相为CH3OH-CH3COOH
时，在合适的梯度条件下，5 种目标物出峰时间适宜，分
离度良好，且峰形对称性好。在以CH3CN-CH3COOH、
CH3CN-H3PO4为流动相时，不断改变梯度条件，5 种
组分峰峰形和分离度均未有较大改善，且CH3CN毒性
远大于甲醇，而H3PO4易损坏色谱柱，故选择CH3OH-
CH3COOH体系为流动相。在色谱柱允许的pH值范围
内，考察了醋酸比例对峰形的影响，当醋酸比例为0.1%
时，峰形最佳，分离度均大于2.0（图1），故最终选择
CH3OH-0.1% CH3COOH体系为流动相。ᰦ䰤/min0 2 24 463 51 8 10 12 14 16 18
1.咖啡酸；2.阿魏酸；3.迷迭香酸；4.木犀草素；5.芹菜素。
图 1 混合对照品溶液HPLC图
Fig.1 Chromatogram of standard solution mixture
2.2 提取溶剂的选择
为了选择合适的提取剂提高萃取率，本实验分别采
用离子液体[BMIm]PF6、[OMIm]PF6、[HMIm]PF6以及甲
醇、乙醇溶液为提取剂，在相同萃取条件下比较对目标
分析物的提取效果。结果表明，以乙醇和离子液体为萃
取剂时，5 种目标分析物的提取率下降，且离子液体会
影响HPLC分析时的分离度；当以甲醇溶液作为提取剂
时，咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的
提取率均明显提高。故本实验最终采用甲醇溶液作为萃
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取剂。此外，本实验还考察了不同浸泡时间对提取效果
的影响，通过浸泡不同时间后提取分析比较，表明浸泡
4 h提取效果最佳。
2.3 固液比的选择
为了得到最佳的提取效果，本实验考察不同的固液
比对提取率的影响。固液比分别为1∶20、1∶30、1∶50、
1∶80、1∶100（g/mL）时，当固液比为1∶80（g/mL）
时5 种目标分析物的提取率显著提高，因此，本实验以
1∶80（g/mL）为最佳固液比（图2）。ᰦ䰤/min0 2 24 463 51 8 10 12 14 16 18
1.咖啡酸；2.阿魏酸；3.迷迭香酸；4.木犀草素；5.芹菜素。
图 2 紫苏供试品溶液HPLC图
Fig.2 Chromatogram of Perilla frutescens sample
2.4 线性关系的考察
分别精密量取1.3.2节混合对照品溶液，用甲醇稀释
至不同质量浓度。从低质量浓度到高质量浓度，依次进
样，每个质量浓度进样3 次，每次20 μL，按1.3.1节色谱
条件进行HPLC分析，以峰面积（Y）为纵坐标，对照品
质量浓度（X）为横坐标，进行线性回归。回归方程、相
关系数和线性范围见表1。
表 1 线性关系实验结果（n=3）
Table 1 Regression equations, linear ranges and LODs (n = 3)
化合物 线性方程 线性范围/（μg/mL） 相关系数 检出限/（ng/mL）
咖啡酸 Y=1 914.44＋89 140.08X 0.001 22～61.00 0.999 99 0.101 9
阿魏酸 Y=4 168.34＋129 965.55X 0.001 06～53.00 0.999 99 0.392 6
迷迭香酸 Y=－6 028.91＋46 751.78X 0.001 28～64.00 0.999 91 0.355 9
木犀草素
芹菜素
Y=－4 512.09＋48 773.83X
Y=－16 393.45＋99 704.68X
0.001 20～60.00
0.001 12～56.00
0.999 94
0.999 95
0.286 2
0.202 5
2.5 精密度实验
精密吸取咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素
和芹菜素的质量浓度分别为12.2、10.6、12.8、12.0、
11.2 μg/mL的对照品混合液20 μL，按照1.3.1节色谱条
件进行HPLC分析。重复进样6 次，测定各个对照品
的峰面积，结果咖啡酸峰面积相对标准偏差（relative
standard deviation，RSD）为1.05%，阿魏酸峰面积RSD
为1.32%，迷迭香酸峰面积RSD为1.84%，木犀草素峰面
积RSD为1.72%，芹菜素峰面积RSD为1.33%，表明仪器
精密度良好。
2.6 稳定性实验
精密吸取1.3.3节供试品溶液20 μL，在避光条件
下，于0、4、8、12、16、20、24、48 h分别进样，测定
咖啡酸的峰面积RSD为0.97%，阿魏酸的峰面积RSD为
1.72%，迷迭香酸的峰面积RSD为1.68%，木犀草素的峰
面积RSD为1.79%，芹菜素的峰面积RSD为1.29%，表明
该方法稳定性良好。
2.7 重复性实验
精密称取同一批紫苏样品6 份，按照1.3.3节方法制
备，1.3.1节色谱条件测定。结果咖啡酸峰面积RSD为
1.34%，阿魏酸峰面积RSD为2.25%，迷迭香酸峰面积
RSD为1.18%，木犀草素峰面积RSD为1.96%，芹菜素峰
面积RSD为2.48%，表明该方法重复性良好。
2.8 回收率实验
精密称取已知含量的同一批紫苏样品0.1 g 9 份，分
成3 组，每组按照低、中、高3 个标准准确加入对照品混
合液，按1.3.3节方法制备，1.3.1节色谱条件测定。咖啡
酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的回收率测
定结果，见表2。
表 2 回收率实验结果
Table 2 Recoveries of five compounds in spiked samples
化合物 样品含量/μg 加入量/μg 测得量/μg 回收率/%
咖啡酸
35.32 24.40 59.43 98.80
35.32 35.67 70.97 99.94
35.32 26.84 61.39 97.14
阿魏酸
6.42 5.30 11.55 96.85
6.42 6.36 12.52 95.85
6.42 7.42 13.78 99.20
迷迭香酸
48.91 44.80 93.48 99.49
48.91 49.28 98.29 100.20
48.91 47.36 94.45 96.16
木犀草素
35.73
35.73
35.73
24.00
35.20
37.40
58.72
70.40
73.66
95.79
98.49
101.41
芹菜素
14.96
14.96
14.96
11.20
15.12
13.44
26.04
29.63
28.08
98.96
97.03
97.64
2.9 样品含量的测定
取同一批紫苏样品3 份，按照1.3.3节方法制备，
1.3.1节色谱条件测定，样品含量测定结果见表3。记录紫
苏样品色谱图，见图2。
表 3 样品含量测定结果 （n = 3）
Table 3 Results of determination of samples (n = 3)
化合物 样品1 样品2 样品3含量/（μg/0.1 g） RSD/% 含量/（μg/0.1 g） RSD/% 含量/（μg/0.1 g） RSD/%
咖啡酸 36.57 0.99 34.46 1.72 35.5 1.52
阿魏酸 5.37 1.26 6.02 1.34 6.97 1.16
迷迭香酸 49.21 1.03 48.77 1.56 47.17 2.14
木犀草素 34.36 0.97 34.98 1.25 36.18 1.14
芹菜素 15.11 2.09 15.69 0.94 16.24 1.36
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3 结 论
3.1 本实验采用分析纯的甲醇作为流动相，与使用色谱
纯的甲醇作流动相的文献报道相比，目标分析物峰形良
好，且无杂质干扰峰，大大降低了实验研究成本。
3.2 为了选择合适的流动相体系，本实验选择了
CH3OH-H2O、CH3OH-CH3COOH、CH3CN-CH3COOH、
CH3CN-H3PO4 4 种流动相体系对5 种目标分析物的分离
效果进行比较。在不断调节流动相比例的前提下，以
CH3OH-H2O为流动相时，咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸
3 种组分峰不能完全分离，且木犀草素、芹菜素2 种组分
峰拖尾严重；而其他3 种流动相体系在合适的梯度条件
下，5 种目标分析物分析时间短，且分离度均达到2.0以
上，但乙腈比甲醇的毒性和成本更高，而磷酸对色谱柱
的损害较大，故最终选择CH3OH-CH3COOH作流动相。
黄亮辉等[18]在对不同采收期的紫苏叶和白苏叶中迷迭香
酸的含量研究中，采用了甲醇-0.1%磷酸水溶液作流动
相，迷迭香酸出峰时间在25 min左右，而本实验中5 种目
标分析物的出峰时间均在16 min以内。
3.3 由于目标分析物易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂及
溶解性能良好的离子液体，本实验分别采用离子液体
[BMIm]PF6、[OMIm]PF6、[HMIm]PF6以及甲醇、乙醇溶
液为提取剂，在相同萃取条件下比较对目标分析物的提
取效果，与以甲醇作萃取剂相比，以离子液体为萃取剂
时，5 种目标分析物的提取率明显降低，且离子液体黏度
太大不利于色谱分析；以乙醇作萃取剂，虽然能够降低
毒性，但5 种目标分析物的总提取率显著低于甲醇，故
最终采用甲醇作萃取剂。与荣维燕等[19]用乙醇超声辅助
提取紫苏叶黄酮的研究相比，本实验中总黄酮提取率更
高，并有效提取了紫苏中的有机酸。
3.4 相关紫苏中有机酸和黄酮的文献报道不一，如张
蕾蕾等[20]采用微波法提取测定紫苏中的黄酮，亦有采用
HPLC测定紫苏中有机酸的含量[21]，但鲜有关于紫苏中咖
啡酸、阿魏酸、芹菜素的报道，且尚未有对于紫苏中黄
酮和有机酸的同时分离测定。本实验建立了以甲醇溶液
为萃取剂，结合超声辅助萃取，利用HPLC同时分离测定
紫苏中的咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜
素5 种有效成分的方法。在优化的最佳实验条件下，5 种
目标成分萃取率高，分离完全。该方法操作简便、检出
限低、定量准确，为紫苏的有效成分的质量评价和控制
提供了科学依据。
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