全 文 ：3.3　色谱柱的选择 实验尝试运用本工程研究中心的三根十
八烷基硅烷 键合硅胶色谱柱:AgilentHypersilODS(250 mm×
4.6 mm, 5 μm), RestekPinnacleDBC18 (250 mm×4.6 mm, 5μm)和 RestekPinnacleⅡC18(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 效果均
较好 ,能达到基线分离 , 说明此流动相具有一定的通用性。通
过比较 , 认为用 RestekPinnacleⅡC18(250 mm×4.6 mm, 5μm)
效果更好。
用本方法可同步测定亳菊提取物中的木犀草素和芹菜素。
方法具有分析时间较短 , 分离度高的特点。木犀草素和芹菜素的
保留时间分别在 11.3, 15.6 min左右;木犀草素线性范围为 3.99
～ 99.75μg/ml(r=0.999 6), 平均加样回收率为 105.9%, RSD=
1.5%;芹菜素线性范围为 4.095 ～ 102.375 μg/ml(r=0.999 6),
平均加样回收率为 103.7%, RSD=2.5%。
参考文献:
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收稿日期:2008-07-23;　修订日期:2008-12-20
基金项目:国家自然科学基金地区联合资助项目(No.30160095);
广西科技厅资助项目(桂科能 05112001-3A1);
广西高校人才小高地建设创新团队资助计划
作者简介:黄　燕(1976-),女(壮族),广西马山人 ,现任广西中医学院基
础医学院实验师 ,主要从事微生物研究工作.
＊通讯作者简介:钟振国(1956-), 男(汉族),广西陆川人 , 现任广西中医
学院基础医学院教授 , 博士学位 ,主要从事教学与中药新药的研究开发
工作.
两种 Ames试验方法
在蒲葵子提取物致突变试验中灵敏度的研究
黄　燕1 , 钟振国 1＊ ,罗　沛2
(1.广西中医学院基础医学院 ,广西 南宁　530001;
2.广西中医学院药学院 2005级硕士研究生 ,广西 南宁　530001)
摘要:目的 通过 Ames试验与彷徨试验对蒲葵子正丁醇提取物的致突变试验结果 ,比较两种试验的灵敏度。 方法 对蒲
葵子用正丁醇浸提 , 用 Ames试验方法(掺入法)与彷徨试验方法 , 对 TA100鼠伤寒沙门氏菌株进行致突变试验。结果
两种试验方法结果显示 , 蒲葵子正丁醇提取物在 5 ～ 500 μg/ml剂量范围 , 以 Ames试验方法与彷徨试验均检测出阳性结
果 , 而在 0.025 μg/ml与 0.5 μg/ml剂量下 ,彷徨试验能检测出阳性结果 ,而 Ames方法未检测出阳性结果。结论 在较低
浓度时 , 彷徨试验能检测出 Ames试验检测不出的阳性结果 , 表明彷徨试验灵敏度较 Ames试验高。
关键词:正丁醇提取物;　Ames;　彷徨试验;　灵敏度
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)07-1578-02
ASensibilityStudyofTwoAmesTestsonSuddenChangeExperimentofChineseFan-
palmExtraction
HUANGYan1 , ZHONGZhen-guo1＊ , LUOPei2
(1.FacultyofPreclinicalMedicine, GuangxiTraditionalChineseMedicalUniversity, Nanning530001, China;
2.2005 PostGraduate, FacultyofPharmacology, GuangxiTraditionalChineseMedicalUniversity, Nanning
530001, China)
Abstract:ObjectiveTocomparethesensitivityoftheFluctuationtestandAmestestforexaminationofthesuddenchange
causedbyChinesefan-palmsub-normalbutylalcoholextraction.MethodsChinesefan-palmwasextractedwiththenormal
butylalcohol, andAmestestandFluctuationtestwerecarriedouttodetectTA100 mousesalmonellatyphimurium.ResultsThe
resultsdemonstratedthattheextractintherangeof5 ～ 500μg/ml, theAmestestmethodandthefluctuationtestmethoddetected
thepositiveresult, andintherangeof0.025～ 0.5μg/ml, theFluctuationtestcouldexaminepositiveresult, buttheAmestest
couldnotchange.ConclusionInlowconcentration, theFluctuationtestcanexaminepositiveresultbutAmestestcannot, which
indicatedthattheFluctuationtesthashighersensitivitythantheAmestest.
Keywords:Normalbutylalcoholextraction;　Ames;　Fluctuationtest;　Sensitivity
　　鼠伤寒沙门氏菌 /哺乳动物微粒体酶试验(Ames试验), 是 利用一组组氨酸营养缺陷型菌株加入待测物在有或没有微粒体
活化系统条件下 ,发生回复突变的特征鉴定化学物质的诱变活
性 , 现已成为初步筛选化学物潜在致突变的首选方法。彷徨试验
也是一种细菌回复突变试验 ,根据营养缺陷型菌株与受试化学物
温育后在缺乏相应营养物的培养液中的生长情况判断所试化学
物的诱变活性 ,节省试验材料(辅酶 Ⅰ其需 Ames平板掺入法用
量的 20%)。实验结果表明 , Ames试验结果与动物致突变性有
90%的相符率 , 而彷徨试验对于弱的 、具有细胞毒性和低浓度的
诱变 /致突变物的检测有其优超性。因此这些方法是较好的化学
物质诱变活性评价的试验方法。
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 7期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.7　
1　材料
1.1　受试药物 蒲葵子正丁醇提取物:蒲葵子分别用 95%乙醇回流提取 ,
浓缩成浸膏后 , 用正丁醇反复浸提 , 得到提取物的浓缩部分(以下简称蒲葵
子提取物)。
1.2　实验菌株 鼠伤寒沙门氏菌变异株组氨酸缺陷型 TA100(由美国 SIG-
MA公司提供),经鉴定为合格菌株 , 置于平板备用。
1.3　阳性对照物 ① 2-氨基芴 ,美国 SIGMA公司;②叠氮钠 ,美国 SIGMA
公司。
1.4　Ames试验培养液 按文献方法 [ 1]配制 ,彷徨试验培养液按美国 SIG-
MA公司提供方法配制 ,体外活化系统(S9混合液)按标准方法经多氯联苯
诱导大鼠肝微粒体酶制备而成 [ 2] 。
2　方法
2.1　Ames试验 用标准平板掺入法 [ 1] ,在经灭菌的 45℃左右含顶层琼脂 2
ml的试管中 ,依次加入受试物 、菌液各 0.1 ml, S9混合液 0.5 ml, 充分混匀
后倒在底层培养基平板上铺平 , 37℃培养 48 h,每次试验同时设阴性 , 阳性
对照 , 每个浓度设两个平行平皿 ,每个受试物至少重复 1次 ,计数平均每毫
升回空菌落数。
2.2　彷徨试验(改进的 Ames试验)[ 3] 取含组氨酸 (2 μg/m1)的培养液 5
ml加过夜培养菌液 0.1 m1, S9混合液 0.1 ml和待测物 0.1 ml, 摇匀分装于
50支小试管中 , 同时做阴性对照 , 37℃培养 20 h, 各管加入古溴甲酚紫(5
μg/m1)的培养液 2 ml, 继续培养 3 d, 计数变色管数。
3　结果
3.1　Ames试验 凡致突变率(MR=受试物平均回变菌落数 /阴性对照回变
菌落数)大于或等于 2, 有剂量反应关系并有重复性的受试物为诱变阳
性 [ 4] , 结果见表 1。由表 1可见蒲葵子提取物对 TA100(+S9/ -S9)在 5 ～
500μg/ml剂量范围内表现出诱变阳性。进一步分析见表 2, 可以看出随着
两种化合物浓度的增加 ,致突变率均相应增高 ,经统计学处理 , 证明浓度与
致突变率间呈直线相关 ,表明蒲葵子提取物有一定的诱变活性。
3.2　仿徨试验 结果按公式 X2 =2n(t-c)2 /(t+c)(2n-t-c)(n为 50支
试管数 , t为实验组变色管数 , c为对照组变色管数), 求 P值 ,当 P<0.05
时 , 判断为致突变阳性。由表 3可以看出在 Ames试验中蒲葵子提取物在
剂量为 0.025, 0.5 μg/ml时不显示诱变活性 ,在彷徨试验中对 TA100在加
S9时表现诱变活性。而且在 5～ 500μg/ml时仍显示阳性结果。
表 1　蒲葵子提取物 Ames试验结果
受试物 浓度C/μg· ml-1
TA100(+S9)
x MR 结果
TA100(-S9)
x MR 结果
蒲葵子提取物 500 295 3.43 + 335 4.29 +
50 221 2.56 + 274 3.51 +
5 185 2.15 + 228 2.92 +
0.5 82 0.95 - 108 1.38 -
0.025 91 1.06 - 102 1.31 -
阴性对照 - 86 - 78 -
阳性对照 + 1256 14.60 +++ 985 12.63 +++
表 2　Ames试验阳性结果剂量 -反应关系比较
受试物 受试菌株 直线回归方程 Y 相关系数
蒲葵子提取物 TA100(-S9) 0.183 5X+245.06 0.94
TA100(+S9) 0.198 8X+196.89 0.97
表 3　蒲葵子提取物彷徨试验结果
受试物 浓度C/μg· ml-1
TA100(+S9)
变色管数 结果
TA100(-S9)
变色管数 结果
蒲葵子提取物 500 20 + 36 +
50 14 + 28 +
5 12 + 32 +
0.5 17 + 25 +
0.025 14 + 22 +
阴性对照 - 3 - 5 -
阳性对照 + 38 + 42 +
　　比较两种试验结果可知:在 Ames试验只有在较
高浓度时呈现阳性反应。而彷徨试验可以在比其低数
十倍甚至数百倍浓度时呈现阳性结果 , 说明彷徨试验
的灵敏度高于 Ames试验 , 而且两者可以相互补充。
4　讨论
Green等(1976)发明的彷徨试验(Fluctuationtest)
是 Ames试验的一种改良法。它用液体培养基代替固
体培养基 , 以观察培养管浊度或 pH指示剂颜色的变
化代替菌落计数 , 用试管代替培养皿。 通过直观地对
各试管中液体颜色变化的计数 , 再利用公式对组间进
行 χ2检验 , 其结果判定简单 、直观 、明确 、可靠。其检
测效力已被许多研究者所证实。 1978年 Gatehouse将
其改进为彷徨试验方法 , 通过文献了解到该方法与常
用的筛选致突变物试验 Ames试验(掺入法)比较 , 有
如下的优点:①有较高的敏感性 ,可以检测出诱变性较
弱的致突变物 , 从而避免因方法灵敏性较差而造成的
假阴性结果。 ②样品 、试剂消耗量少 ,可同时进行数个
样品的检测。彷徨试验所用菌株为 TA100, 该菌株可
用来检测点突变和移码突变 [ 5] , 该菌株在无外源性组
氨酸供给的情况下不能生长繁殖 , 但当发生回复突变
时则可在无外源性组氨酸供给的情况下生长繁殖 。由
于一些外源性化学物需经体内代谢活化才具有诱变活
性或经代谢而解毒 , 为了模拟哺乳动物对外源性物质
的体内代谢活化过程 , 提高测试的准确性 , 通常在 A-
mes试验中添加哺乳动物肝微粒体酶制剂(S9)作为外
源性物质代谢活化系统 [ 6] 。彷徨试验能够灵敏 、迅速
地检测到基因的突变情况 , 是基因突变检测的主要方
法之一。
据文献报道 , 应用 Ames试验平扳掺入法严重不
足之点是被测化学物 、S9液 、组氨酸加进顶层后可能
扩散到底层去 , 它们的浓度有随时间延长而下降的趋
势 , 从而影响实验结果 , 如要提高测试物浓度 , 其毒性
可能威胁细菌的生存 。而彷徨试验克服了这一缺陷 ,
由于其自发突变率和诱发突变率均从相当数量的细胞
中显示出来 , 且又为液体诱变 , 故敏感性高于平皿试
验 ,对某些阳性诱变物的检出浓度比 Ames试验低 100
倍。本次实验也证明了彷徨试验的高灵敏特点 , 因而
适于检测低水平及很弱的诱变剂。 但此法操作费时 ,
一般可作为 Ames试验的补充方法。这两种方法对人
和动物的体液监测 , 环境致突变因素的研究及流行病
学调查中潜在致癌物的检测具有十分重要的作用。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.7 时珍国医国药 2009年第 20卷第 7期