全 文 ：第 30卷第 6期　　　　　　　　　西 南 大 学 学 报(自然科学版)　　　　　　　　　　　2008年 6 月
Vol.30　No.6 Journal of Southw est Unive rsity (N atural Science Edi tion) Jun.　2008
文章编号:1673-9868(2008)06-0116-05
秋水仙碱诱导蔓花生多倍体研究①
郑　荷 , 　张　利 , 　周　立 , 　李　政 , 　李　凌
西南大学 园艺园林学院 , 重庆 400716
摘要:采用培养基添加法 、浸泡法以及先预培养后处理法对蔓花生(Arachis duranensis)叶片愈伤组织 、 丛生芽进
行多倍体诱导.结果表明:用 0.1%秋水仙碱进行 48 h 浸泡处理可以获得较好的诱导效果 , 其成活率和诱导率为
66.67%和 75.00%.茎 、 叶 、气孔 、 保卫细胞 、染色体等形态指标的检测证明 4倍体较 2倍体发生了显著变化.
关　键　词:蔓花生;秋水仙碱;多倍体;染色体
中图分类号:Q943 文献标识码:A
蔓花生(Arachis duranensis)又名遍地黄金 , 蝶形花科蔓花生属多年生宿根草本植物 , 原产亚洲热带及
南美洲 , 其根系发达 , 花色金黄 , 是极有开发利用前景的地被植物.目前 , 关于蔓花生的研究主要集中在园
林应用以及花生育种上[ 1-4] , 而对蔓花生倍性育种详细研究未见报道.为此本实验结合前人的研究成
果[ 5-7] , 开展了蔓花生多倍体诱导的研究工作.
1　材料与方法
1.1　材　　料
材料取自西双版纳热带经济作物研究所 , 后在西南大学园艺园林学院苗圃栽培.
1.2　方　　法
1.2.1　无菌培养体系的建立
以叶片为外植体 , 采用常规方法进行材料消毒 , 即自来水冲洗 20 min , 0.1%升汞浸泡 7 min , 无菌水
冲洗 4 ～ 5次.将材料切成 0.5 cm×0.5 cm 左右的小块 , 接种在 MS+NAA0.5 mg/ L+6-BA3.0 mg/L 培
养基上进行培养.10 d左右将部分愈伤组织接种在 MS+NAA0.1 mg/L+6-BA1.0 mg/ L 培养基上进行丛
生芽诱导.另一部分愈伤组织用于多倍体诱导.
1.2.2　培养基添加法
以 MS +NAA0.1 mg/L +6-BA1.0 mg/ L(pH 5.8 ～ 6.0)作为基本培养基 , 分别添加 0.005%,
0.01%, 0.05%的秋水仙碱.转接愈伤组织块(1.0 cm×1.0 cm 左右)分别进行 7 d和 15 d的共培养 , 然后
经无菌水冲洗后转接在无秋水仙素的基本培养基上进行培养.
1.2.3　浸 泡 法
将新生芽浸泡在经过灭菌的浓度为 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%的秋水仙素中分别浸泡 24 h , 48 h ,
① 收稿日期:2007-11-01
作者简介:郑　荷(1983-), 女 , 湖南湘西人 , 硕士研究生 , 主要从事园林植物遗传育种的研究.
通讯作者:李　凌 , 教授.
DOI :10.13718/j.cnki.xdzk.2008.06.027
72 h.然后切去下部茎段 1 mm 左右再转接在基本培养基上进行培养.
1.2.4　先预培养后处理法
先将新生芽接种于基本培养基上预培养 3 d , 再将沾有浓度为 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%秋水仙素
的无菌脱脂棉包裹在芽的顶端 , 经过 24 h , 48 h , 72 h后除去脱脂棉并经冲洗后转接在新的基本培养基上.
1.2.5　生根移栽
以 1/2M S+NAA1.0 mg/L 作为生根培养基对处理后的植株进行生根培养.待根长至 2 cm 时移栽至
珍珠岩基质中 , 覆盖薄膜.每天喷水 1次 , 培养温度 25 ～ 30 ℃, 全光照.
1.3　多倍体的鉴定
1.3.1　植株形态观察法
当移栽苗萌发 30 d后 , 用游标卡尺分别测量未处理和处理后的植株直径 , 测量位置均在距枝条基部上
方 2 cm 处.每组材料测量 10组数据进行统计.再分别取成熟叶片(顶端数第 4-5片)用游标卡尺测量 10
组叶长 、叶宽(中部);另各取 50张成熟叶片 , 每 5张一组 , 用游标卡尺测量叶厚 , 然后求平均值.
1.3.2　叶片气孔及茎表皮气孔特征观察
分别取成熟叶片 , 放入固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)中固定 7 d , 取出后在 1 mo l/L 盐酸中处理 2 ～
4 h , 用镊子在载玻片上轻轻挤压使叶肉游离而得到表皮 , I2-KI染色后加盖玻片 , 在 Leica DM 1000光学显
微镜下观察保卫细胞长度 、宽度 、保卫细胞中叶绿体数目以及每一视野(10×20)中气孔数目.
1.3.3　染色体记数
处理芽长势恢复后 , 取根尖采用去壁低渗 —火焰干燥法[ 8] 进行染色体制片.最后在 Leica DM1000光
学显微镜下观察记数.
2　结论与分析
2.1　蔓花生植株形态观察结果
在培养过程中发现 , 经过秋水仙素处理的材料较 2倍体材料的叶片颜色深 , 在茎直径 、叶厚 、叶长 、叶
宽以及叶形指数方面有较大差异(表 1).
表 1　蔓花生 2 倍体与 4 倍体茎 、叶以及叶形指数差异显著性比较
倍性 直径/mm平均值 显著性 显著性
叶厚/mm
平均值 显著性 显著性
叶长/mm
平均值 显著性 显著性
叶宽/mm
平均值 显著性 显著性
叶形指数
平均值 显著性 显著性
2X 1.35 a A 0.25 a A 9.80 a A 6.04 a A 1.64 a A
4X 2.83 b B 0.31 b B 11.79 b B 8.21 b B 1.43 b B
　　经过秋水仙素处理的材料表现出典型的器官巨大性(图 1), 其直径 、叶厚 、叶长 、叶宽以及叶形指数方
面均在 5%水平上有显著差异 , 在 1%水平上有极显著差异.
图 1　蔓花生 2 倍体与 4 倍体形态比较
2.2　染色体记数的结果
经过秋水仙素处理形态发生显著变化的材料和正常 2倍体材料用改良的去壁低渗火焰干燥法进行染色
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图 2　蔓花生 2 倍体与 4 倍体染色体数目比较
体观察 , 发现2倍体的染色体数目为2n=2X =20 , 经
过加倍处理后得到的材料细胞染色体数目为 2n=4X
=40(图 2).
2.3　不同处理方法对多倍体诱导效果的影响
2.3.1　培养基添加法的诱导效果比较
将秋水仙素直接添加到培养基中进行处理成活率
较低 , 最高仅为 40.00%.随着秋水仙素浓度的升高 ,
诱导率有所增加 , 但成活率很低.从实验结果可以看
出 , 秋水仙素0.01%, 处理 15 d可以获得较理想的成
活率和加倍频率(表 2).
表 2　培养基添加法对蔓花生成活率与加倍频率的影响
浓度
/ %
处理天数
/ d 接种芽数 成活数
成活率
/ % 加倍个数
加倍频率
/ %
0.005 7 30 12 40.00 1 8.33
15 30 10 33.33 2 20.00
0.01 7 30 7 23.33 2 28.57
15 30 6 20.00 4 66.67
0.05 7 30 2 6.67 1 50.00
15 30 0 0.00 - -
2.3.2　浸泡法的诱导效果比较
采用先将带芽茎段在无菌秋水仙碱溶液中浸泡后再转接的方式进行处理 , 其成活率 、诱导频率都较
高.秋水仙素浓度0.2%以上时 , 成活率可达 50%以上 , 诱导频率在35%以上.从实验结果可以看出 , 秋水
仙素 0.1%处理 48 h可以获得较理想的成活率和加倍频率(表 3).从长势来看 , 经过浸泡处理的茎段生长
明显减慢 , 新生枝条多扭曲畸形.
表 3　浸泡法对蔓花生成活率与加倍频率的影响
浓度
/ %
处理天数
/ h 接种数 成活数
成活率
/ % 加倍个数
加倍频率
/ %
0.01
24 30 28 93.33 2 7.14
48 30 26 86.67 4 15.38
72 30 25 83.33 6 24.00
0.05
24 30 26 86.67 5 19.23
48 30 24 80.00 5 20.83
72 30 20 66.67 6 30.00
0.10
24 30 24 80.00 9 37.50
48 30 20 66.67 15 75.00
72 30 16 53.33 9 56.25
0.20
24 30 22 73.33 8 36.36
48 30 18 60.00 8 44.44
72 30 15 50.00 7 46.67
2.3.3　先预培养后处理法结果比较
在先预培养后处理的诱导中发现 , 处理后的芽生长先出现一段时间的停滞 , 随后继续生长 , 但是其生
长速度明显较未处理缓慢.从表 4中可以看出 , 处理后的成活率比培养基添加法和浸泡法的成活率高.即
使在 0.2%的浓度下 , 成活率也能够保持在 70.00%以上 , 但诱导率最高只能达到 48.15%.
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表 4　先预培养后处理法对蔓花生成活率与加倍频率的影响
浓度
/ %
处理时间
/ h 接种数 成活数
成活率
/ % 加倍个数
加倍频率
/ %
0.01
24 30 30 100.00 1 3.33
48 30 28 93.33 1 3.57
72 30 28 93.33 2 7.14
0.05
24 30 30 100.00 1 3.33
48 30 27 90.00 3 11.11
72 30 26 86.67 3 11.54
0.10
24 30 30 100.00 2 6.67
48 30 27 90.00 4 14.81
72 30 26 86.67 6 23.08
0.20
24 30 28 93.33 7 25.00
48 30 27 90.00 13 48.15
72 30 22 73.33 6 27.27
　　通过对以上 3种诱导处理方法进行比较 , 发现用 0.1%的秋水仙碱进行 48 h浸泡处理的诱导效果最
佳 , 其成活率和诱导率分别达到 60%和 70%.
2.4　叶片气孔特征观察结果
通过观察发现蔓花生 4倍体保卫细胞长度 、宽度以及叶绿体数目均较 2倍体增加 , 每一视野中气孔数
目明显减少(表 5).其中保卫细胞的平均长度增加了 62.40%, 平均宽度增加了 47.65%, 叶绿体平均数目
增加了 260.78%(图 3), 每个视野中平均气孔数目减少了 51.36%.
表 5　2 倍体与 4 倍体蔓花生保卫细胞与气孔差异显著性比较
倍性 保卫细胞长度/μm平均值 显著性 显著性
保卫细胞宽度/μm
平均值 显著性 显著性
叶绿体数目/个
平均值 显著性 显著性
气孔数目 10×20/个
平均值 显著性 显著性
2X 18.35 a A 13.85 a A 23.20 a A 62.30 a A
4X 29.80 b B 20.45 b B 83.70 b B 30.30 b B
图 3　气孔比较
2.5　生根移栽成活率
植株在1/2M S+NAA1.0 mg/L 培养基上的生根
率为 86.67%, 移栽成活率可达到 80.00%.
3　讨　　论
采用组织培养与秋水仙碱处理相结合诱导出了蔓
花生 4倍体.在 3种方法中 , 以 0.1%的秋水仙碱进
行 48 h浸泡处理的效果最佳 , 其成活率和诱导率分
别达到 60%和 70%.
在检测中发现 , 与 2倍体相比 , 4倍体蔓花生在形态上表现为茎增粗 、叶片增大 、叶形指数变小 、气孔
和保卫细胞增大 、叶绿体数目增加以及单位面积内气孔数量减少等特点.染色体记数表明蔓花生 2倍体为
2n=2X =20 , 4倍体为 2n=4X =40.
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Polyploidy Induction in Arachis duranensis with Colchicine
ZHENG 　He , 　ZHANG 　Li , 　ZHOU 　Li , 　LI　Zheng , 　LI　Ling
School of Horticulture and Landscape Architecture , Southwest Universi ty , Chongqing 400716 , China
Abstract:Embryogenic calli and caespitose buds o f Arachis duranensis were used as explants to induce
po lyploidy in the specie s by means of mixing culture w ith colchicine , immersing stem segment and step-
generation , and pret rea tment in combination w ith subsequent co lchicine sprinkling.The treatment of stem
segment imme rsion in 0.1% colchicine solut ion fo r 48 h gave satisfactory induction results , the survival
rate and po lyploidy induction rate being 66.67% and 75.00%, respect ively .Compared wi th the diploids ,
remarkable changes we re found to have occurred in the morpho logical indicato rs o f stem , leaf and guard
cell and in the phy sio logical indexes of chromosome in thei r tet raploid counterparts.
Key words:Arachis duranensis;co lchicine;po lyploid;chromosome
责任编辑　胡　杨　　　　
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