全 文 ：China Pharmacy 2016 Vol. 27 No. 19 中国药房 2016年第27卷第19期
＊主管药师，硕士。研究方向：药物制剂。电话：0817-2262244。
E-mail：31618187@qq.com
#通信作者：主任药师，硕士生导师。研究方向：医院药学。电
话：0817-2262246。E-mail：nclf91@163.com
近年来，在中药的提取分离工艺中，实践证明采用传统的
水提醇沉法或醇提水沉法精制中药提取液时，会造成有效成
分的大量损失，且所制成品稳定性差。采用絮凝澄清技术可
选择性除去一些无效成分，提高有效成分的保留率及成品质
量稳定性[1]。紫苏叶（Perillae folium）为唇形科植物紫苏[Peril-
la frutescens（L.）Britt.]的干燥叶（或带嫩枝），是一种药食两用
植物[2-3]，主要含有紫苏醛、柠檬烯等挥发性成分，以及紫苏苷、
木犀草素、芹菜苷和芹黄素等黄酮类化合物[4]。黄酮类化合物
具有清除人体中自由基和抗氧化作用，同时还具有调节血脂、
抗菌、强身、益寿、美容养颜等功效 [5]。笔者在前期研究基础
上，以总黄酮保留率和固形物去除率为评价指标，分别采用壳
聚糖絮凝澄清、ZTC 1+1-Ⅱ絮凝澄清、水沉法精制紫苏叶提取
液，以筛选适宜的澄清工艺，并采用正交试验优化澄清工艺参
数，旨在为紫苏叶及其相关制剂的澄清纯化工艺提供参考[6]。
1 材料
1.1 仪器
760CRT双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器
有限公司）；PHS-SB pH计（成都瑞驰分析控制仪器有限公
司）；TP-114电子分析天平（德国赛多利斯股份有限公司）；
SB-25-12DT超声波提取器（宁波新芝生物科技股份有限公
紫苏叶提取液的澄清纯化工艺优选
王柏强 1，2＊，刘 福 1，2 #，何效平 1，曾芝兰 1，罗 飞 1，2，罗巧林 1，2（1.川北医学院附属医院药剂科，四川 南充
637000；2.川北医学院药学院，四川南充 637000）
中图分类号 R284.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2016）19-2684-03
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.19.29
摘 要 目的：优选紫苏叶提取液的澄清纯化工艺。方法：比较3种澄清纯化方法即壳聚糖絮凝澄清、ZTC 1+1-Ⅱ絮凝澄清、水沉
法对紫苏叶提取液中总黄酮保留率和固形物去除率的影响，筛选出适宜的澄清纯化方法；以总黄酮保留率和固形物去除率的综合
评分为指标，分别设计单因素和正交试验考察选定的澄清纯化方法中药液浓缩比、絮凝剂加入量、絮凝温度、搅拌速度等条件的最
优值。结果：3种方法中以壳聚糖絮凝澄清法较优；最优澄清纯化工艺为药液浓缩比1 ∶ 4、壳聚糖加入量1.0 g/L、絮凝温度60℃、
搅拌速度 100 r/min、搅拌时间 4 min、静置时间 12 h；此工艺下总黄酮保留率为（85.1±0.75）％、固形物去除率为（24.6±1.33）％
（n＝5）。结论：紫苏叶提取液的纯化除杂可选用壳聚糖絮凝澄清法，优选的澄清纯化工艺条件稳定、可行。
关键词 紫苏叶提取液；壳聚糖；ZTC 1+1-Ⅱ；澄清纯化工艺；总黄酮；正交试验
Optimization of Clarification and Purification Technology of Perillae folium Extract
WANG Baiqiang1，2，LIU Fu1，2，HE Xiaoping1，ZENG Zhilan1，LUO Fei1，2，LUO Qiaolin1，2（1.Dept. of Pharmacy，
the Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Sichuan Nanchong 637000，China；2.College of Phar-
macy，North Sichuan Medical College，Sichuan Nanchong 637000）
ABSTRACT OBJECTIVE：To optimize the clarification and purification technology of Perillae folium extract. METHODS：The
effects of 3 clarification and purification methods as chitosan flocculation clarification，ZTC 1+1-Ⅱflocculation clarification，water
precipitation on retention rate of total flavonoids and removal rate of solid of Perillae folium extract were compared to screen suit-
able clarification and purification technology. With the retention rate of total flavonoids and removal rate of solid as comprehensive
evaluation index，single factor and orthogonal test were designed to investigate the optimal value of concentration proportion，the
amount of the flocculant，flocculation temperature and whisking speed in optimal clarification and purification method. RESULTS：
Among 3 methods，the chitosan flocculation clarification was the best with concentration proportion of 1 ∶ 4，chitosan of 1.0 g/L，
flocculation temperature at 60 ℃，whisking speed of 100 r/min，whisking time of 4 min，standing time of 12 h. Under the condi-
tion of optimal processing，the retention rate of total flavonoids was（85.1±0.75）％，and the removal rate of solid was（24.6±
1.33）％（n＝5）. CONCLUSIONS：Chitosan flocculation can be used to effectively remove the impurity of Perillae folium extract，
and optimized clarification and purification technology is stable and feasible.
KEYWORDS Perillae folium extract；Chitosan；ZTC 1+1-Ⅱ；Clarification and purification technology；Total flavonoids；Or-
thogonal test
技术出版社，1987：130.
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（收稿日期：2016-03-14 修回日期：2016-04-08）
（编辑：刘 萍）
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司）；HH-2数显恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；
HI303磁力搅拌器（杭州汇尔仪器设备有限公司）；RE-52AA旋
转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。
1.2 药材、药品与试剂
芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号：0080-
200707，纯度：＞98％）；紫苏叶[鲜紫苏叶于2011年7月采自四
川省广安地区，经川北医学院药学院李生茂老师鉴定为唇形
科植物紫苏Perilla frutescens（L.）Britt.的叶]；纤维素酶（上海
伯奥生物科技有限公司，批号：20121227，活性：≥15 U/mg）；
壳聚糖（上海华凯科技贸易公司，批号：110413）；ZTC 1+1-Ⅱ
型天然澄清剂（包括A、B两组分，天津振天成科技有限公司，
批号：120726）；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 总黄酮含量的测定[7]
精密称取干燥至恒质量的芦丁对照品20 mg，加70％乙醇
溶解并定容至 50 ml棕色量瓶中，即得 0.40 mg/ml对照品溶
液。精密量取对照品溶液 0（空白对照）、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0
ml分别置于 25 ml量瓶中，用 70％乙醇稀释至10 ml；加5％亚
硝酸钠溶液 1 ml，摇匀，静置 6 min；加 10％硝酸铝溶液 1 ml，
摇匀，继续静置6 min；加4％氢氧化钠溶液 10 ml，然后以70％
乙醇定容至刻度，摇匀，放置 15 min。在空白对照调零后于
510 nm波长处测吸光度（A）。以A为纵坐标、对照品溶液质量
浓度（c）为横坐标进行线性回归，得回归方程：c＝2.810 3A－
0.017 2（r＝0.999 7）。结果表明，芦丁溶液检测质量浓度线性
范围为 0.2～2.4 mg/ml。精密度考察结果中吸光度的RSD＝
0.9％（n＝5）；准确度考察中平均加样回收率为99.3％（RSD＝
1.4％，n＝9）。
测定法：精密吸取提取液 0.2 ml置于 25 ml量瓶中，按上
述方法进行处理，测定吸光度，然后计算总黄酮的含量。
总黄酮保留率＝澄清处理后药液中总黄酮的量/处理前药
液中总黄酮的量×100％。
2.2 固形物去除率的测定[8]
精密量取澄清处理前、后的提取液50 ml，置于已干燥至恒
质量的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃干燥至恒质量，迅速冷却，
30 min后精密称质量，计算固形物去除率[（澄清前固形物质
量－澄清后固形物质量）/澄清前固形物质量×100％]。
2.3 紫苏叶提取液的制备
称取100 g干燥的紫苏叶粉末，加入2 000 ml 70％乙醇，浸
泡 15 min后加入配制好的纤维素酶悬浮液（使酶质量浓度达
到0.25 mg/ml），调节pH至5.0[7]，于40℃恒温水浴锅中酶解2 h，
每隔 30 min搅拌 1次。待酶解完成后于 60 ℃超声（功率 600
W，频率25 kHz）提取30 min，抽滤，滤液浓缩至适量，即得。
2.4 澄清纯化方法的筛选
以总黄酮保留率和固形物去除率为评价指标，分别采用
壳聚糖絮凝澄清、ZTC 1+1-Ⅱ絮凝澄清、水沉法对紫苏叶提取
液进行澄清处理以筛选出最优的澄清纯化方法。
2.4.1 水沉法 量取药液浓缩比为 1 ∶ 4的样液 50 ml，置于锥
形瓶中，搅拌下加入 4倍量的纯化水，继续搅拌 5 min，静置 24
h后过滤，滤液浓缩定容至50 ml，测定各指标。
2.4.2 壳聚糖絮凝澄清法 取药液浓缩比为 1 ∶ 4的样液 50
ml，置于100 ml锥形瓶中，恒温60℃下，按1.0 g/L（即每1 L样
液中含壳聚糖 1.0 g）的用量加入 1％壳聚糖溶液（称取壳聚糖
粉末1 g，加入1％醋酸溶液100 ml，待溶胀后用磁力搅拌器搅
拌使之完全溶解，即得[9]），于100 r/min速度下搅拌4 min，静置
12 h，过滤，收集滤液定容至50 ml，测定各指标。
2.4.3 ZTC 1+1-Ⅱ絮凝澄清法 取药液浓缩比为 1 ∶ 4的样液
50 ml，置于100 ml锥形瓶中，恒温80℃下，100 r/min速度搅拌
下加入4％药液体积的A组分黏胶液（浓度为1％），每隔0.5 h
左右搅拌1次；2 h后，于80℃同法加入2％药液体积的B组分
黏胶液（浓度为1％），保温10 min，0.5 h后再搅拌1次；静置6 h
过滤，收集滤液定容至50 ml，测定各指标。
2.4.4 结果 不同澄清方法对紫苏叶提取液澄清纯化效果的
影响见表1。
表1 不同澄清方法的澄清纯化效果（x±s，n＝3，％）
Tab 1 The clarification and purification effects of different
clarification methods（x±s，n＝3，％）
方法
水沉法
壳聚糖絮凝澄清法
ZTC 1+1-Ⅱ絮凝澄清法
总黄酮保留率
80.4±1.01
85.1±0.75＊
84.2±0.91＊
固形物去除率
21.3±0.62
24.6±1.33＊
23.4±1.07＊
注：与水沉法比较，＊P＜0.05
Note：vs. water precipition method，＊P＜0.05
对上述3种澄清方法的数据结果采用SPSS 17.0软件进行
处理，组间比较采用 t检验。结果显示，与水沉法比较，壳聚糖
絮凝澄清法、ZTC 1+1-Ⅱ絮凝澄清法在总黄酮保留率及固形
物去除率上差异均有统计学意义（P＜0.05）；后 2种方法间紫
苏叶提取液澄清纯化效果差异无统计学意义（P＞0.05）。由于
ZTC 1+1-Ⅱ絮凝澄清法处理过程相比壳聚糖絮凝澄清法稍显
烦琐，故本文以下试验选用壳聚糖絮凝澄清法进行进一步的
考察。
2.5 壳聚糖絮凝澄清纯化工艺考察
2.5.1 单因素试验 （1）药液浓缩比的考察。取药液浓缩比
为1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 8（g/ml）的样液各50 ml，分别置于100
ml锥形瓶中，水浴加热，恒温 60 ℃下，按 1.0 g/L的用量加入
1％壳聚糖溶液，于 100 r/min速度下搅拌 4 min，静置 12 h，过
滤，收集滤液并定容至50 ml，测定各指标。结果，各比例下总
黄酮保留率分别为 79.4％、81.5％、84.7％、85.1％、85.3％，固
形物去除率分别为 24.8％、23.6％、24.1％、22.5％、20.4％。由
此可见，药液浓缩比对絮凝效果影响较大，药液浓缩比太高或
太低均不利于药液的絮凝沉淀，前者澄清后总黄酮保留率较
低，后者固形物去除率较低，并且药液体积量大会增加后续处
理成本。综合考虑，选择药液浓缩比为1 ∶4左右较合适。
（2）絮凝剂加入量的考察。取药液浓缩比为 1 ∶ 4的样液
50 ml，置于 100 ml锥形瓶中，平行操作 6份，水浴加热，恒温
60℃下，分别按0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/L的用量加入1％壳
聚糖溶液，于 100 r/min速度下搅拌 4 min，静置 12 h，过滤，收
集滤液定容至50 ml，测定各指标。结果，总黄酮保留率分别为
87.4％、86.6％、85.9％、85.4％、83.0％、82.5％，固形物去除率
分别为8.5％、15.3％、20.7％、24.6％、23.2％、22.7％。可见，絮
凝剂加入量对澄清效果也有显著性影响。絮凝剂加入量较少
时，絮凝剂不足以将所有胶体颗粒充分絮凝，导致固形物去除
率低；随着絮凝剂加入量的逐渐增加，固形物去除率增大，样
液的澄清度更好；当絮凝剂加入量升高至1.0 g/L后，澄清效果
下降，总黄酮保留率呈下降趋势。综合考虑，选择絮凝剂加入
量为1.0 g/L。
（3）絮凝温度、搅拌速度、搅拌时间、静置时间的考察。①
絮凝温度。取药液浓缩比为1 ∶4的样液适量，选择絮凝温度分
别为20、40、60、80℃，其余操作同“2.5.1”（1）项，结果总黄酮保
留率分别为78.4％、83.6％、85.1％、84.4％，固形物去除率分别
为 21.5％、23.9％、24.7％、23.6％。②搅拌速度。搅拌速度分
别为50、100、150、200 r/min，其余操作同“2.5.1”（1）项下，结果
总黄酮保留率分别为80.4％、84.2％、83.5％、81.6％，固形物去
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除率分别为 21.6％、23.8％、22.2％、20.4％。③搅拌时间。搅
拌时间分别为2、4、6、8 min，其余操作同“2.5.1”（1）项下，结果
总黄酮保留率分别为82.7％、84.4％、84.2％、83.8％，固形物去
除率分别为 22.5％、24.9％、24.3％、23.8％。④静置时间。静
置时间分别为6、12、18、24 h，其余操作同“2.5.1”（1）项下，结果
总黄酮保留率分别为83.7％、84.5％、84.3％、83.9％，固形物去
除率分别为23.0％、24.3％、24.5％、24.8％。
上述结果显示，絮凝温度、搅拌速度对纯化效果影响较
大。温度过低，胶体粒子与絮凝澄清剂粒子碰撞的几率较小，
从而使絮凝不充分；絮凝温度过高，易使絮凝分子老化，影响
絮凝作用，导致体系澄明度下降；同时，温度过高，也不利于一
些热敏感物质的保护。搅拌时间和静置时间相对影响较小。
适宜的搅拌时间，有利于澄清剂的絮凝而达到较好的澄清效
果；搅拌时间过短，可使絮凝粒子与体系中微粒的接触几率减
小，从而使絮凝不完全；搅拌时间过长，又易破坏已形成的絮
体，降低絮凝效果。综合考虑，选择絮凝温度为60℃、搅拌速
度为100 r/min、搅拌时间为4 min、静置时间为12 h。
2.5.2 正交试验 根据单因素试验结果，以总黄酮保留率（X1）
和固形物去除率（X2）的综合评分[10]作为评价指标[以总黄酮保
留率（X1）和固形物去除率（X2）为指标，二者权重分别设定为
0.7、0.3，综合评分＝（X1/X1max×0.7+X2/X2max×0.3）×100]，选择絮凝
剂加入量、药液浓缩比、絮凝温度、搅拌速度为考察因素，采用
L9（34）正交试验设计进行考察。因素与水平见表 2，试验安排
与结果见表3，方差分析结果见表4。
表2 因素与水平
Tab 2 Factors and levels
水平
1
2
3
因素
A（絮凝剂加入量），g/L
0.8
1.0
1.2
B（药液浓缩比），g/ml
1 ∶2
1 ∶4
1 ∶6
C（絮凝温度），℃
40
60
80
D（搅拌速度），r/min
50
100
150
表3 正交试验安排与结果
Tab 3 Design and results of orthogonal test
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
R
因素
A
1
1
1
2
2
2
3
3
3
92.800
95.767
93.333
2.967
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
92.767
95.067
94.067
2.300
C
1
2
3
2
3
1
3
1
2
93.867
94.133
93.900
0.266
D
1
2
3
3
1
2
2
3
1
93.467
94.400
94.033
0.933
指标
X1，％
79.2
84.5
84.1
82.6
84.0
84.4
75.4
80.8
81.3
X2，％
23.4
22.5
21.4
24.4
24.6
24.2
27.6
25.3
23.7
综合评分
91.0
94.5
92.9
94.8
96.3
96.2
92.5
94.4
93.1
表4 方差分析结果
Tab 4 Results of variance analysis
误差来源
A
B
D
C（误差）
偏差平方和
15.007
7.980
1.327
0.127
自由度
2
2
2
2
均方
7.503
3.990
0.663
0.063
F
118.165
62.835
10.449
P
＜0.05
＜0.05
注：F0.05（2，2）＝19.00
Note：F0.05（2，2）＝19.00
由表3直观分析可知，各因素对壳聚糖絮凝澄清工艺的影
响大小顺序为A＞B＞D＞C；方差分析结果表明因素A、B对
澄清纯化工艺有显著影响（P＜0.05），因素C、D对澄清工艺无
显著影响。综合考虑，确定最优壳聚糖絮凝澄清工艺为
A2B2C2D2，即壳聚糖加入量为1.0 g/L、药液浓缩比为1 ∶ 4、絮凝
温度为60℃、搅拌速度为100 r/min。按优选的工艺条件进行
5次验证试验：取药液浓缩比为 1 ∶ 4的药液 50 ml，置于 100 ml
锥形瓶中，水浴加热恒温至60℃，按1.0 g/L的用量加入1％壳
聚糖溶液，于 100 r/min速度下搅拌 4 min，静置 12 h，过滤，收
集滤液定容至50 ml，测定各指标。结果总黄酮保留率平均值
为（85.1±0.75）％，固形物去除率平均值为（24.6±1.33）％，表
明该澄清工艺条件稳定、可行。
3 讨论
中药提取液的精制传统上多采用醇提水沉法或水提醇沉
法，一般操作是在提取液中加入高浓度乙醇或水，静置24 h甚
至数天以去除杂质；有的还需反复多次沉淀，方能保证除杂完
全。此工艺操作烦琐且工期长，有效成分损失较大。而壳聚
糖、ZTC 1+1-Ⅱ等絮凝剂可通过“吸附架桥”和“电中和”作用
除去原液中较大的悬浮颗粒，利用天然胶体保护作用使样液
尽快澄清的同时较多地保留样液中的成分。
在采用水沉法除杂时，总黄酮保留率低，药液中杂质沉淀
速度慢，费时较长。壳聚糖与ZTC 1+1-Ⅱ絮凝澄清法不仅使
有效成分保留率高，而且澄清速度非常快，澄清液无乳光。就
紫苏叶提取液而言，采用壳聚糖澄清剂或ZTC 1+1-Ⅱ澄清剂
精制提取液，二者对紫苏叶提取液澄清效果无明显差异。与
水沉法相比，二者总黄酮保留率及固形物去除率明显更高。
由于ZTC 1+1-Ⅱ澄清剂包含A、B两种组分，操作工艺比壳聚
糖澄清剂稍显复杂，故根据工艺优化及综合评分，笔者选择壳
聚糖絮凝澄清法为紫苏叶提取液的澄清除杂方法。试验结果
表明，壳聚糖澄清剂可用于紫苏叶提取液的纯化除杂，在有效
成分保留及去除固形物上显示了较好的效果。
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（收稿日期：2015-11-04 修回日期：2016-01-20）
（编辑：刘 萍）
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