全 文 ：兰 州 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ), 1 9 9 0, 2 6 ( l ) 76、 7 9
JO U RN A L O F L A N Z HO U U N IV E RS I T Y (N
a t u r a l S
e ie n e e。 )
一臀
了树兰原球茎增殖中体细胞胚发生的研究
谷祝平
(生
徐
物 系 )
涛
摘 要 以 树兰 ( E p i d e n d r u m o B石 e n i a n it m )的成熟种 子在改 良的 v a e i n 和We n t培养基上诱导
形成了原球茎 , 将原球茎 切 钊 成小块 , 放入添加有 。 . 2 m g/ L 2 . 4一 D 和 。 . 2 m g / L 6 B A 的 V ac in 和
W
e nt 液体培养基进行振荡液休培养 , 获得 了原球茎的大量增拉 . 对原球茎的增殖过程进行 了细胞
学和 组织 学观察 , 表 明在 原球茎增 殖中有大童 的体 细胞 胚发生 , 一般 由单个 的 胚性细胞经分 裂经
胚性细胞 团 , 球形胚 等阶段 , 形 成原球茎 .
关键词 胚性细胞 , 球形胚 , 体细 胞胚发生 . 树兰 , 原球茎 ,
近几年来植物组织培 养中体细胞胚发生的研究受到极大的关注并取得很大进展 . 在
很多科 、 属 的植物和一些重要的粮食 、 经济作物中 , 相继获得体细胞胚 , 以及通过这一途
径发育的再生植株 . 对于诱导体细胞胚发生的因素及发生机制进行 了有益的探讨 “ 一 “ 】 .
树兰 ( E :P’ d en d ur m O 尸 B ir en ia nu m )是一种具很高观赏价值的热带气生兰 , 由于种子
极小 , 在 自然条件下很难萌发 . 在国外兰花工业中主要靠种子培养形成原球茎繁殖 . 原
球茎的增殖成为树兰试管苗生产 中的一个关键步骤 , 在此过程中体细胞胚发生的研究在
国内外报道还很少见 .
本文将着重报道树兰原球茎增殖过程 中体细胞胚发生的细胞 学和组织学观察 , 探讨
树兰体细胞胚的来源及发育过程 , 并为树兰试管苗工业化生产技术提供一些改进 .
1 材料和方法
供试材料树兰 ( E lP’ d en dr 训 : O, B , f en f a nu m ) 的种子由美国加利福尼亚大学欧文分
校发育及细胞生物学系 Jos eP h A r id t it 教授提供 . 将己成熟的树兰种子放入 0 . 1肠 L汞溶
液 中灭菌 20 m in , 在 1 0 目的镍丝 网上用无菌水冲洗 3 次 , 然后放在 V ac in 和W e n t L以下
简称 V W )固体培养基 ( S a ja w a , S h o j i 和 S h o ji , 1 9 6 6 )上 , 在 2 5士 2℃ , 每夭 s h 1 2 0 0 1u x
日光灯照射条件下培养 . 培养 2 ~ 3 个月 , 待种子萌发形成原球茎之后 , 将原 球茎切割
为 1 . s m m 的小块 , 放入 V W液体培养基中 , 培养基添加 o . Zm g / L 2 . 4 一 D 和 。 . 2m g / L 6 B A ,
并将培养物置于平面摇床上进行 液体振荡培养 , 培养室条件与前同 .
在原球茎切割培养后的不 同时期 (第 1 , 2 , 3 , 5 , 8 , 1 , 15 d等 ) 取材 , 用卡
诺 (酒精 : 醋酸为 3 : l) 固定液固定 24 h , 用苏木精整 体染色 , 石蜡包埋 , 切片厚 度为
8协m , 在光学显微镜下对原球茎增殖过程 中体细胞胚的发生进行细胞学和组织学观察 .
2 实验结果 、
2
.
1 种子萌发和原球茎的形成
本又 ! 95 9年 5 月 2 日收 到 .
DOI : 10. 13885 /j . i ssn. 0455 -2059. 1990. 01. 015
1期 谷祝平等 :树兰原球茎增殖中体细胞胚发生 的研究 李 7
. .
、 叫
树兰的种子微如尘埃 , 呈长梭形 , 种皮上有网状种纹 (图版 工 , 1) . 培养 10 d 后逐
渐吸水膨大 , 3 d0 后开始萌发 , 45 d后肉眼可观察到在培养基上出现许多小绿点 , 在显微
镜 一 lz’ 观察 己形成原球茎 , 大多呈圆球形 (图版 工 , 2 ) , 此后原球茎的生长缓慢 , 大致在
60 d后才逐渐分化 , 开始长出茎叶 (图版 工 , 3 ) .
2
.
2 在液体培养基 中原球茎的增殖
当照原球茎切割为 1 . s m nl 见方的小块放入 V W液体培养基进行 振荡培养 , 小切块生
长十分迅速 , 3周内便可在原切块上 一长出几个小的原球 (图版 工 . 4 ) , 其生长 率 比 在 固
体培养上要高得多 , 即生长速度 快 , 鲜重增加迅速 (表 1 ) . 3) 司后便可对新形成的原球
茎进行第二次切割 , 再放入新的 V W液体培养基中培养 , 这样反 复切割 , 由一个原球茎
在一年内可以 增殖数万个原球茎 . 而在 固体培养基中 , 原球茎生长较慢 , 要达到在液休
培养基中3周的大小 , 则需要 50 ~ 6 0 d时间 .
表 1 在液体和固体 V a ic n 和W en t培养基上树兰原球茎的生长率
原球茎生 长率 ( g /周 )
培 养 基 状 态 第一周 第二周 第三周
1
.
1 4 士 0 . 14
0
.
6 8 士 O
,
0 8
2
.
0 5 士 0 . 2 1
1
.
0 5 土 0 . 1 4
1
.
6 6 土 0 . 18
1
.
3 2 士 0 . 1 1
塞签养培体液固
2
.
3 体细胞胚发生的细胞学和组织学观察
树 兰原球茎增殖 的光学显微镜观察表 明 , 当原球茎切块在液体培养葵 中培养 d2 后 ,
在原球茎薄壁组织内出现一 些细胞核大 , 染色较深 、 原生质浓厚的胚性细胞 (图版 工 ,
5 )
,
’色们能够很快进行分裂 , 形成四细胞团 (图版 工 , 6) , 有些 由表皮细胞 转化 形 成
的胚性细胞 分裂形 成线性排列的四细胞 团 (图版 工 , 7 ) . 在培养后 4 ~ s d , 形成 由数
十个细胞组成的结构 致 密的细胞 团 , 这便是 由胚性细胞分裂而成的胚性细胞团 , 这种
胚性细胞团有的发生在原球茎的表面 (图版 I , 8 ) , 但多数发 生 在 原 球茎内部 (图版
工 , 的 . 这种胚性细胞团进一步分裂形成球形胚结构 (图版 工 , 10 , 1 1) , 还有一些内部
发生的胚 性细胞团朝某一方向发展 , 其结果突出于外植体表面 , 并且 有些不参与体细胞
胚构成的细胞形成类似胚柄的附着物连在胚上 (图版 工 , 1 2 ) . 往往在外植体内部多处
产生胚性细胞 团 , 它们相互分离 , 形成多个体细胞胚 (图版 工 , 1 3 ) . 球形胚发育可形
成新的原球茎 , 并月 进一 步分化 .
3 讨 论
r
种子培养是 兰花试管苗生产和快速繁殖的一条重要途径 , 在 国外 兰花工业中受到极
大重视 . 但是这一技术还未能在所有的兰花种 、 属成功的应用 , 有些种属 (如拖鞋兰 、
构兰等 ) 的兰花种子在培养基上很难萌发 , 组织培养也十分困难 ’ 7 { . 在 这种 情 况下 ,
只要利用由极少数种子萌发所得到的原球茎 , 然后进行功割繁殖 , , 就可 以在短期内得到
大见的原球茎和试管苗 , 大大加快试管苗的繁殖速度 . 有些种属种子萌发及形成原球茎
兰州天学学报 (自然科学版 ) 2 6卷
的过程十分缓慢 , 而采用原球茎切割及液体培养的方法 , 便可加速原球茎繁殖的速度 .
原球茎是 兰花发育过程 中的一个特殊阶段 , 在种 子 萌 发 的 过 程 中 形 成 原 球 茎
` 4 ’ 7 ’ “ 〕 , 在茎尖组织培养 中也由外植体直接形成原球茎 , 这 己为很多作者所证明 L “ , “ ,
。 , “ ’ ` 。 ’ . 种子萌发产生的原球茎是由种子 的胚所形成的 , 而组织培养中由外植体产生的
原球茎是从哪里来的 ?通过何种途径发育而成 ?我们在大花蕙 兰茎尖组织织培养中己发现
原球茎是由体细胞胚所形成 的 , 并 己做了报道 ` “ ` , 在树兰原球茎增殖过程 中也得到了证
实 . L in C h in o hi ( 19 8 7 )在蝴蝶 兰花梗培养中也观察到类似于体细胞胚发生的现象 〔 ’ 0 ’ ,
因此体细胞胚 的产生可能是兰花组织培养中原球茎产生的主要来源 , 这一点有待于在更
多的兰花科,属 中加以证实 . 体细胞胚发生途径 的证实将对于在单细 ){包水平上选择兰花突
变系具有重要的理论和实践意义 .
、尸
图 版 说 明 I
少去养后 3 d的树兰种子 . x 25
培养4 d5 后 由种子萌发形成 的
原球茎 . X 25
由原球茎 分化 形 成 的 小 植
瑞求. X l o
培养后 3 周 在原球茎切 块 上
形成的新原球荃 X 30
培养 Zd后 在原球茎组织 中 出
现的核 大而染 色较 深 、 原 生
质 浓厚 的胚性 细胞 . x 10
J咨养后 3 d形成 的四细胞胚 性
细 胞 团 . X l。 。
培养后 3 d由表皮细胞经线性
分裂形 成的四细胞 团 . x 1 0
培养后 s d在原球茎表面 形 成
的胚性细胞 团 X S。
塔养到 s d在原球茎 内部形成
的月右性细胞 团 . X S。
一 个球形胚期的体 细 胞 胚 .
X 2 5
在原球茎表 面 形成的球 形 胚
结构 . X 4 0
具有胚柄 附 若物 的球形 胚 结
构 . 欠 5 0
在原球茎内部形 成多个 体 细
胞 胚 . X 2 5
安五英参加部分实验工作 , 特此致谢 .
参 考 文 献
1 姚敦义 , 张慧娟 . 植物体细胞胚研究进展 . 山东师范大学自然科学学报 , 工9 8 6
1 ( 2 )
:
5 4~ 6 5
1
79谷祝平等 : 树兰原球茎增殖 中体细胞胚发生的研究
臼. 2
3
4
5
6
7
8
9
尹 r
10
谷祝平 , 郑国锡 . 红豆草组织培养中体细胞胚的形成及其胚胎学观察 . 实验生物学
报 , 19 5 7 , 2 0 ( 1 ) : 2 3~ 2 9
谷祝平 , 颜廷进 . 大花蕙兰茎尖组织培养及其形态学建成的研究 . 实验生物学报 ,
1 9 8 9
,
2 2 ( 2 )
: x 4 g ~ 25 5
田梅生 , 王伏雄等 . 四季兰种子离体萌发和器官建成的研究 . 植物学报 , 1 9 8 5 , 27
( 5 )
: 4 5 5一 4 5 9
王熊 , 包慈华等 . 建 兰和秋兰原球茎的发 生及 其 无性 系的建立 . 植物生理学报 ,
19 5 2
,
7 ( 2)
: 2 0 3~ 2 0 7
周月坤 , 孙安慈等 . 兰花苗端和茎节的离体培养 . 植物学 集 刊 , 19 8 3 , 1 : 1 19 ~ 12 4
A r d i t t i J
.
O r e h i d S e e d g e r m i n a t i o n a n d S e e d l i n g e u l t u r e a m a n u a l
.
I n
:
o r e h i d B i o l o g y ( 五 ) I t h a e a , N e w Y o r k . C o r n e l l U n i v e r s i t y P r e s s , 19 8 2 ,
2 4 3~ 3 6 9
G o v i n d a p p a D A
.
I n v i t : 0 s e e d g e r m i n a t i o n a n d d e v e l o p m e n t a l m o r p h o l o g y
o f s e e d l i
n g s i n D e n d r o b i u m l a w i a n u m
.
P h y t o m o r p h o l o g y
,
19 5 0
,
5 0 ( i )
:
,
7 8 ~ 8 4
G u Z h u p i n g
.
T h e e f f e e t s o f B A
,
2
.
4 一 D a n d I A A o n s h o o t 一 t i p e u l t u r o f
C y m b id i u m
.
]
J i n d l
e y a n a
,
1 9 5 7
,
2 ( 2 )
: 5 8一 9 0
L i n e h i n e h
.
H i s t o l o g i e a l o b s e r v a t i o n s o n i n v i t r o f o r m a t i o n o f p r o t o e o r m
一
l i k e b o d i e s f r o m f l o w e r s t a l k i n t e r n o d e s o f P h a l a e n o p s i s
.
L i n d l e y a n a
,
1 9 8 7
,
2 ( 1 )
: 5 8 ~ 6 5
S t u d y o n S o m a t i e E m b r y o g e n e s i s i n t h e P r o t o e o r m
C u l t u r e o f E p id e n d r u m o
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B r i e n i a n u m
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.
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.
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,
t h e p r o t o e o r m p r o p a g a t i o n 15 t h e n
p u t i n t o p r a e t i e e b y t il i s w a y
.
H i s t o l o g i e a l o b s e r v a t i o n i n d i e a t e s t h a t i n
p r o t o e o r m s u b e u l t u r e t h e s o m a t i e e m b r y o s o r i g i n a t i n g f r o m s i n g l e e m b r y o
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, a n d d e v e l o p e i n t o n e w p r o t o e o r m s
.
K e y w o r d s e m b r y o g e n i e e e l l
,
g l o b u l a r e m b r y o
, s o m a t i e e m b r y o g e n e s i s
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E P i d e n d r u m o
产
B r i e n i a n u m
,
P r o t o e o r m
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