全 文 ：从图 2可以看出 , 这 3种金属元素对拮抗链霉菌No.24 菌
株发酵产物活性的影响随着浓度的不同而不同 , 同图 1 一样 ,
不管其浓度如何 , 其发酵产物的活性都没有不加金属元素的
发酵产物的活性好 ,这可能是这 3 种金属元素本身对No.24 菌
株的细胞生长有阻碍作用 ,使得细胞生长缓慢 ,从而抑制了其
代谢和活性产物的合成。
2.3　Mg2+、Ca2+及两种离子的同时添加对西农 No.24 菌株发
酵产物的生物量及生物活性的影响
Mg2+和 Ca2+对拮抗链霉菌No.24 菌株发酵产物的活性具
有明显的促进效果 ,在培养基中同时添加这两种金属离子 , 发
酵产量是否会进一步提高? 本节初步探讨了不同 Mg2+和
Ca2+配比对菌株发酵产物活性的影响。结果表明它们的作用
是互相叠加的。同时添加这两种金属离子比单独添加其中任
一种的活性要好 ,且生物量增加 , 结果见表 2。
表 2　Mg2+、Ca2+的添加对No.24菌株发酵产物生物活性的影响
Table 2　Effects of Mg2+ and Ca2+ on the bioactivity of fermentation products
of the strain
Metal
irons
Concentration
(mol L)
Biomass
(g L)
Diameter of
inhibi tion zone(mm)
Mg2+
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
10.08
11.23
11.3
9.85
7.46
30
34
35
27
20
Ca2+
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
9.16
10.11
10.67
8.73
7.24
27
32
35
24
19
Mg2++Ca2+
Mg2+0.001+Ca2+0.004
Mg2+0.002+Ca2+0.003
Mg2+0.003+Ca2+0.002
Mg2+0.004+Ca2+0.001
11.06
13.51
10.29
8.74
35
40
33
24
　　从表 2中可以看出 ,Mg2+和 Ca2+的单独添加对拮抗链霉
菌No.24 菌株的生长及活性都有较大的促进作用 , 且在浓度
为0.003mol L时 ,其生物量和抑菌圈直径都达到了最大值 , 分
别为11.3g L、10.67g L和 35mm。而同时添加这两种金属离子
时 ,其生物量和活性提高更大 , 且在浓度为 Mg2+0.002+Ca2+
0.003mol L时 , 其生物量和抑菌圈直径分别为 13.51g L、40mm ,
与对照相比 ,分别提高到了 162.18%和 181.82%。
3　讨论
3.1　金属离子作为微生物生长和代谢产物合成的重要影响
因子 ,在微生物生理研究 、酶类性质研究及蛋白质 、氨基酸 、核
苷酸 、维生素等发酵调控的研究中已有许多的报道 , 但有关其
对抗生素发酵的影响报导很少[11 , 12] , 本文研究了 13 种金属元
素的添加对 No.24 菌株的生长及其发酵产物杀菌活性的影
响 , 其中有 10种金属元素对其都有不同程度的促进作用 , 尤
其是 Mg2+和 Ca2+的添加对该菌株的促进作用最大 , 这说明金
属元素的添加能够刺激菌株的菌丝迅速生长并代谢更多代谢
产物。
3.2　微生物抗生素的合成是多基因调控的数量性状 , 镁离子
和钙离子对西农 No.24 菌株代谢产物的合成有强烈的刺激作
用 , 使其发酵的生物量和生物活性大大提高 , 这可能是这两种
离子能够作用于此抗生素合成的几个位点 ,同时Mg2+和 Ca2+
还可能刺激了该菌的呼吸作用 , 加快了此菌的生长 , 降低了菌
株对自身所产抗生素的反馈抑制作用[ 13-15] 。但其详细机理还
有待进一步的研究。
参考文献:
[ 1] 姜怡 ,杜冠华 ,孙秋.放线菌生物活性物质的高通量筛选[ J] .云南
大学学报 , 2004 , 26(4):364-366.
[ 2] 文宏津 ,郝伟月 ,龚炳永.SIPI-96-886-菌株活性代谢产物的研
究[ J] .中国抗生素杂志, 2002 , 27(11):644-645.
[ 3]刘光烨 ,林洋.胶胨状芽孢杆菌拮抗菌株活性物质形成条件及其性
质初步研究[ J] .微生物学通报 , 2003 ,30(1):22-26.
[ 4] 肖悦 ,刘天佳 ,黄正蔚 ,等.天然药物对黏性放线菌生长和产酸影响
的体外研究[ J] .华西医大学报 , 2002 ,33(2):253-255.
[ 5] 董春娟 ,李亚新 ,吕炳南.微量金属元素对甲烷菌的激活作用[ J] .
太原理工大学学报 ,2002 , 33(5):495-498.
[ 6]龙建友 ,姬志勤 ,师宝君 ,等.No.24菌株发酵产物对反枝苋的除草
活性初步研究[ J] .农药学学报 , 2004 ,6(1):89-92.
[ 7]Wessjohann L.Epothilones , promising natural products with taxol-like ac-
tivity[ J] .Angew Chem Int Ed Engl., 1997, 36:715.
[ 8] Alain L.Servin.Antagonistic activities of lactobaci lli and bifidobacteria
against microbial pathogens[ J] .FEMS Microbiology Reviews , 2004 , 28:405
-440.
[ 9] 林壁润 ,杨丽梅 ,江学斌 ,等.管碟法测定抗生素 2507的技术条件
探讨[ J] .广东农业科学, 1998 , 30(2):38-40.
[ 10] 慕立义.植物化学保护研究方法[M ] .北京:中国农业出版社 ,
1991:158-159.
[ 11] 李淑彬 ,周仁超 ,钟英长.金属离子对黄柄曲霉生长和抗真菌抗生
素合成的影响[ J] .微生物学通报 , 2002 ,29(3):20-24.
[ 12] 李越中.药物微生物技术[M] .北京:化学工业出版社 , 2004:63-
76.
[ 13] 董顺福 ,刘洁 ,董宏博 ,等.11种中药金属元素含量测定及聚类分
析研究[ J] .光谱学与光谱分析 , 2006, 26(11):2150-2153.
[ 14] 潘云锋 ,李文哲.微量金属元素对牛粪厌氧发酵产气特性的影响
[ J] .江苏环境科技 , 2006 ,19(4):4-6.
[ 15] 曲明清 ,邢增涛 ,程继红.养料中重金属元素对杏鲍菇子实体产量
和质量的影响[ J] .食用菌学报 , 2006 ,13(2):53-56.
异叶青兰总黄酮提取工艺的研究
余江柳 ,艾来提·苏里坦＊(新疆大学化学化工学院 ,新疆 乌鲁木齐 830046)
摘要:目的:采用分光光度法 ,以芦丁为标准品测定异叶青兰中的总黄酮含量。方法:在提取过程中通过单因素实验分析了
乙醇浓度 、回流温度 、回流时间及料液比等四个主要因素对提取率的影响。在单因素实验的基础上通过正交设计法进行实验 , 优
化异叶青兰黄酮提取工艺条件。结果:异叶青兰的最佳提取工艺条件为乙醇体积浓度为 70% 左右 , 料液比为 1∶40 ,回流温度为
50℃,提取时间为 2.5h。根据实验测得的异叶青兰花的总黄酮含量为 27.4110mg g。结论:该实验结果可靠 , 方法简便 , 最佳条件
适合批量生产中该药材的提取。
关键词:异叶青兰;总黄酮;提取工艺
中图分类号:Q503　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2007)05-0079-03
Studies on the Extraction Technological Conditions of Total
Flavonoids in Dracocephalum heterophyllum
YU Jiang-liu , Hayrat Sulitan＊
第 17卷第 5 期:79
2007 年 10 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.17 , No.5:79
Oct.2007
(College of Chemistry and Chemical Engineering , Xinjiang University , Urumqi 830046 , China)
Abstract:Objective:Flavonoids in Dracocephalum heterophyllum was investigated by spectrometric method with rutin as standard material.Meth-
ods:During the extracting process , four main factors including concentration of extracting solution , temperature , time and solid-liquid ratio are
studied by using single factor analysis method.Results:The optimal extracting conditions are obtained by orthogonal analysis as follows:methanol
concentration 70%, solid-liquid ratio 1∶40 , refluxing temperature 50℃ and extracting duration 2.5hours.Total flavonoids in Dracocephalum
heterophyllum was 27.4110mg g.Conclusion:The method is simple , convenient and can be applied to extract Dracocephalum heterophyllum in
large scale.
Key words:Dracocephalum heterophyllum;total flavonoids;extraction technology
收稿日期:2007-05-22;修回日期:2007-07-10
作者简介:余江柳(1977-),女 ,硕士生 ,从事天然药物化学研究;＊通
讯作者(Corresponding author):艾来提·苏里坦(1959-),男 ,博士 ,副教
授 ,从事天然药物化学研究 , E-mail:ayrat1959@yahoo.com.cn。
　　异叶青兰(Dracocephalum heterophyllum)系唇形科青兰属多
年生草本植物 ,主要分布于辽宁 、内蒙古 、新疆 、山西 、西藏等
地。其主要用于治疗黄疸性发烧 、肝热 、热性病头痛 、眼翳 、口
腔溃疡 、支气管炎 、高血压等多种病症[ 1] 。据文献报道[ 2] 该植
物所含黄酮类化合物有黄酮醇和二氢黄酮醇 , 但迄今有关异
叶青兰黄酮类化合物的含量及其提取工艺等方面的研究尚未
见报道。本文对异叶青兰所含黄酮类化合物的含量及最佳提
取工艺进行初步研究 ,为异叶青兰资源的开发提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
异叶青兰花:采自新疆和田。
1.1.2　试剂
芦丁(中国药品生物制品检定所)、无水乙醇 、亚硝酸钠 、
硝酸铝及氢氧化钠均为国产分析纯 ,天津市化学试剂三厂产。
1.1.3　仪器
723-可见分光光度计 , 上海精密科学仪器有限公司;电热
恒温水浴锅 ,京泰克仪器有限公司;UV-2450 紫外分光光度
计 ,日本岛津公司;分析天平 ,北京赛多利天平有限公司。
1.2　实验方法
1.2.1　芦丁标准溶液的配制
准确称取芦丁标准样品 20.3mg用 70%乙醇溶解 ,并完全
移入 100mL容量瓶中 , 用 70%乙醇定容 , 配制成 0.203mg mL
的标准液待用。
1.2.2　最大吸收波长的选择
取上述芦丁标准溶液 2.0mL于 20mL具塞试管 ,分别移取
70%乙醇至 10mL , 加入 5%的 NaNO2 溶液 0.6mL, 摇匀放置
6min后加入 10%的Al(NO3)3 溶液 0.6mL, 摇匀放置 6min 后再
加入 4%的 NaOH 溶液 5mL, 混匀并用 70%乙醇稀释至刻度 ,
15min后在 200～ 800nm 波长范围内扫描 ,溶液在 502nm 有最大
吸收峰 ,故确定 502nm 为检测波长。
1.2.3　工作曲线的建立
分别移取上述芦丁标准溶液 0、1.0、2.0 、3.0、4.0、5.0 、
6.0、7.0mL于 8 只 20mL 具塞试管中 ,以下方法同 1.2.2 , 在波
长502nm处比色测定 , 试剂为空白参比。以芦丁浓度为横坐
标 ,吸光度为纵坐标绘制标准曲线 , 如图 1。
根据图 1 所得结果用最小二乘法作线形回归 , 得到芦丁
浓度 Y 与吸光度 X 关系曲线的回归方程:Y =11.648X +
0.0231 , 相关系数 r=0.9993 ,所以本实验芦丁浓度与吸光度有
良好的相关性。
1.2.4　样品液的制备和测定
准确称取 1g粉碎过目的异叶青兰花 , 用 70%的乙醇浸泡
并进行回流提取 , 将提取液抽滤后所得滤液置于 100mL 容量
瓶中 , 用 70%乙醇定容至刻度 , 摇匀。取此样品液 5mL 于
20mL具塞试管中 ,以下方法同 1.2.2 测定吸光度 , 计算提取物
中黄酮化合物含量。
图 1　芦丁标准浓度-吸光度
Figure 1　Standard rutin concentration absorbance
总黄酮含量的测定:以芦丁为标样 , 采用亚硝酸钠-硝酸
铝比色法 , 在可见光 502nm 处测定其吸光值 , 通过标准曲线方
程计算提取液中总黄酮含量。
2　结果与分析
2.1　单因素实验
2.1.1　乙醇浓度对提取的影响
分别用浓度为 50%、60%、70%、80%、90%的乙醇按物料
比 1:40 ,提取温度为 60℃,提取时间为 2h 的条件下进行测定 ,
测定提取液的总黄酮含量 , 确定最佳提取浓度 ,结果见图 2。
图 2　乙醇浓度对提取的影响
Figure 2　Effect of alcohol concentrat ion on extraction
从图 2 可以看出:乙醇浓度增加到 60%以后黄酮含量逐
渐降低 , 并在 50%～ 70%有一个拐点 , 在 60%时的总黄酮含量
最高。可能是由于随着乙醇浓度增大 , 黄酮类化合物溶解度
减少 ,同时一些醇溶性杂质 、色素 、亲酯性强的成分溶出量增
加 ,这些成分与黄酮类化合物竞争同乙醇:水分子结合 , 从而
导致黄酮类化合物的提取量下降[ 3] 。故选取乙醇浓度在 60%
较好。
2.1.2　提取时间对提取的影响
在乙醇浓度 60%、料液比 1∶40、温度 60℃的条件下 ,每隔
0.5h计算一次提取液的总黄酮含量 ,结果见图 3。
由图 3 可知 ,当回流时间为 2.5h 时 ,提取效果最好。但若
时间继续延长 , 总黄酮含量反而降低。这可能是回流时间太
长 , 部分乙醇挥发而导致沸点逐渐增大 ,从而破坏某些黄酮类
80　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17 卷第 5期
化合物[ 3] 。
图 3　提取时间对提取的影响
Figure 3　Effect of time on extraction
2.1.3　料液比对提取的影响
用60%乙醇溶液按回流温度 60℃, 提取时间2.5h ,料液比
(g mL)分别为 1∶20 、1∶30、1∶40、1∶50 、1∶60 进行提取 , 结果见
图 4。
图 4　料液比对提取的影响
Figure 4　Effect of solid-liquid ratio extract ion
从图 4 可知随着料液比的增加 , 提取量出现了 2 个波峰 ,
其中最大的是料液比在 1∶50 时的值 , 因此选择料液比 1∶50 较
合适。
2.1.4　回流温度对提取的影响
将样品分别在 40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下保温2.5h ,乙
醇浓度为 60%, 料液比为 1∶50 。结果见图 5。从图 5 可知:
40℃到 80℃总黄酮出现了拐点 , 而 60℃时总黄酮含量较高。
图 5　回流温度对提取的影响
Figure 5　Effect of temperature on extraction
2.2　正交性实验
通过单因素实验对上述不同提取工艺参数进行了初步的
筛选 , 为了分析参数影响主次因素 , 得到最佳的提取工艺 , 进
行正交实验。参照单因素实验结果 , 以影响黄酮化合物提取
率的乙醇浓度 、回流时间 、料液比 、回流温度为四个影响因素 ,
三个水平 L9(34)进行正交实验 ,优选最佳提取工艺。因素水
平 L9(34)见表1 ,正交实验结果见表 2。
通过数理统计的极差分析法进行分析可知 , 级差最大的
表 1　因素水平表 L9(34)
Table 1　Factor standard
水平 A乙醇浓度(%)
B料液比
(g mL)
C回流温度
(℃)
D提取时间
(h)
1 50 1∶30 50 2
2 60 1∶40 60 2.5
3 70 1∶50 70 3
表 2　正交实验结果
Table 2　Orthographic experiment results
实验 水平(Standard) 总黄酮含量
(Test) A B C D (Content of flavonoids)
1 A1 B1 C1 D1 13.5458
2 A1 B2 C2 D2 27.4110
3 A1 B3 C3 D3 13.6144
4 A2 B1 C2 D3 12.1386
5 A2 B2 C3 D1 25.6607
6 A2 B3 C1 D2 25.3862
7 A3 B1 C3 D2 24.6654
8 A3 B2 C1 D3 25.5578
9 A3 B3 C2 D1 21.9198
R1 54.5712 50.3498 64.4898 61.1263
R2 63.1855 78.6295 61.4696 77.4626
R3 72.1430 60.9204 63.9405 51.3108
K 1 18.1904 16.7833 21.4966 20.3754
K 2 21.0618 26.2098 20.4899 25.8209
K 3 24.0477 20.3068 21.3135 17.1036
R 5.8573 9.4265 1.0067 8.7173
为 B 因素 ,其次为 D因素 , 再其次是 A 因素和 C 因素 , 说明在
异叶青兰的乙醇回流提取中 , 对黄酮含量影响最大的为料液
比 , 其次分别是提取时间 、乙醇浓度和回流温度。故 B 因素和
D因素选 2 , A因素选 3 , C 因素选 1。因此乙醇回流提取异叶
青兰的最佳的提取工艺为:乙醇浓度为 70%左右 , 提取时间为
2.5h ,料液比在1∶40 左右 ,回流温度为 50℃,即 A3B2C1D2 。
3　结论
通过以上的单因素实验及正交实验详细探讨了异叶青兰
花优化提取工艺 , 结果为:乙醇浓度 70%,提取时间 2.5h ,料液
比 1∶40 ,回流温度 50℃。根据实验测得的异叶青兰化的总黄
酮含量为 27.4110mg g。为减少操作误差 , 在每次实验中应注
意其它因素如药材粉碎度 , 润湿程度 , 记时方法及其它操作应
在相同的条件下测定。本研究建立的分光光度法用于测定异
叶青兰黄酮 ,方法简便 ,实验结果可靠 ,最佳条件适合批量生
产中该药材的提取。
参考文献:
[ 1]中国科学院西北高原生物研究所.青海经济植物志[M] .西宁:青海
人民出版社 , 1987:484.
[ 2] 张德 ,韩海洪 ,李有忠.藏药异叶青兰的黄酮成分[ J] .青海师范大学
学报 , 1997 ,(3):47-50.
[ 3] 李众飞.黄瓜藤中黄酮的提取工艺研究[ J] .内蒙古农业科技 ,
2005,(1):20-21.
[ 4] 张志信 ,宋关斌 ,张仕秀.正交实验法优选三七茎叶中总黄酮的提
取工艺[ J] .生物技术 ,2006 , 16(5):65-67.
[ 5]朱笃 ,陈飞彪 ,夏剑辉 ,等.金鸡菊总黄酮的提取及含量测定[ J] .食
品科学 , 2005 , 26(9):314-316.
[ 6] 李彩侠 ,张 彬 , 吴亚卿.荷叶中黄酮类化合物的提取工艺研究
[ J] .上海理工大学学报, 2006, 28(1):5-8.
[ 7] 何为 ,陈际达.优化实验设计法及其在化学中的应用[ M] .成都:电
子科技大学出版社 ,1994.
812007 年 10 月　　　　　　　　　　　　　　　　　异叶青兰总黄酮提取工艺的研究