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小叶黑柴胡茎叶总黄酮对小鼠免疫性肝损伤的影响
刘秀芳1 , 2 , 詹雪晶2 , 蔡光明2＊ , 张卓勇1 , 刘峰群2 (1.首都师范大学 , 北京　100048;2.中国人民解放军第三
O 二医院全军中药研究所 , 北京　100039)
摘要:目的　研究小叶黑柴胡茎叶总黄酮 (TFA)对免疫功能的保护作用。方法　采用碳粒廓清法比较正常组与小
叶黑柴胡给药组的碳粒廓清指数;尾静脉注射刀豆蛋白 (ConA , 20 mg · kg-1)诱发小鼠免疫肝损伤模型 , 观察血
清 ALT 和 AST , 并测定小鼠肝组织中 MDA 的含量。在光学显微镜下观察肝脏病理组织的变化。结果　与正常组
相比 , TFA 高 、 中 、 低 (300 、 150 、 75 mg· kg -1)3 个剂量组均能提高廓清指数 K 值 (P<0.05)和校正廓清指
数α值 (P<0.01);能降低小鼠免疫肝损伤模型的 A LT 和 AS T 活力和肝组织中 MDA 的含量。 TFA 能明显改善
肝组织的病理学改变。结论　TFA 能提高小鼠单核巨噬细胞系统的吞噬功能 , 使小鼠的免疫功能提高 , 对免疫性
肝损伤小鼠有一定的保护作用。
关键词:小叶黑柴胡;总黄酮;廓清指数;刀豆蛋白;免疫肝损伤
中图分类号:R965　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1672-2981 (2011)02-0089-04
doi:10.3969/ j.issn.1672-2981.2011.02.003
Effect of total flavonoids of aerial part of Bupleurum smithii Wolff
var.parvif olium on immuno hepatic injury in mice
LIU Xiu-fang 1 , 2 , ZH AN Xue-jing2 , CAI Guang-ming 2＊ , ZHANG Zhuo-yong 1 , LIU Feng-qun2 (1.Cap tial Nor-
mal University , Beij ing 100048;2.China Mi litary Institute o f Chinese Materia Medica , 302 Military Hospital of
China , Beij ing 100039)
Abstract:Objective　 To determine the effect o f total flavonoids of the aerial pa rt of Bupleurum smithii Wolff var.
parvi f olium (TFA)on immuno hepatic injury in mice.Methods　Ca rbon expurgation method w as used to compare
the carbon expurgato ry function o f the contr ol gr oup and TFA g roups in mice.ConA (Concanavalin A , 20 mg · kg
-1)in NS was injected intrape ritoneally to establish an immunized mouse model of liver damage.We observed the ser-
um level o f ALT and AST.The liver tissue MDA , and the hepatic histological change s we re observ ed by opticalmicro-
scope.Results　Compa red w ith that of the contr ol gr oup , the expurga to ry index and phagocy tic index increased(P<
0.05)in the 3 TFA g roups (300 , 150 , and 75 mg · kg -1).In the immunized mode ls , the ALT and AST activity
significantly decreased (P<0.01), M DA content in the liver wa s also low ered(P<0.01).TFA improved the hepat-
ic patholog ical changes distinctly.Conclusion　The total flavono ids o f the aerial part of B upleurum smithii Wolff var.
parvi f olium may pro tect immuno hepatic injury in mice.
Key words:Bupleurum smithii Wolff var. parvi f oli um Shan et Y.Li;to tal flav onoids;carbon expurg ation;con-
canavalin A;immuno hepatic injury
　　小叶黑柴胡 (B upleurum smithii Wolff v ar. parv i f oli-
um Shan et Y.Li)为伞形科 (Umbellifer-ae)柴胡属植物 ,
主要分布于我国的山西 、 青海 、 宁夏等地 , 并作柴胡药用 ,
在宁夏为商品柴胡的主流品种[ 1-2] 。柴胡作为保肝抗炎的中
草药 , 可用于治疗急性黄疸 、 重症瘀胆型肝炎 、 胆囊炎等疾
病[ 3] 。以往对小叶黑柴胡的研究多集中于根及根茎部分[ 4] ,
而地上部分 (茎叶)的研究尚未见文献报道。本课题组对其
地上部分初提物进行药效学研究 , 发现有很好的利胆退黄及
抗炎作用。周伟等[ 5]研究发现其茎叶部分的主要化学成分以
黄酮类成分为主。 文献报道黄酮类化合物具有多种药理活
性[ 6] , 本文主要研究小叶黑柴胡茎叶总黄酮 (TFA)对小鼠
免疫功能的影响 , 为阐明小叶黑柴胡的药用价值提供依据。
1　材料
1.1　试药与仪器
　　基金项目:北京市政府专项基金 (编号:0853279)。
作者简介:刘秀芳 , 女 , 硕士 , 主要从事药物分析研究 , Tel:(010) 66933324 , E-mail:l xf04510317@163.com　　＊通讯作者:蔡光
明 , 男 , 研究员 , 主要从事药物分析和中药化学 , Tel:(010) 66933323;E-m ail:cgm1004@vip.sina.com
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　　护肝片 (黑龙江省五常葵花药业有限公司 , 由柴胡 、 茵
陈 、 板蓝根 、 五味子 、 猪胆粉 、 绿豆组方 , 糖衣片基片重
0.35 g · 片-1 , 薄 膜 衣 片 重 0.36 g · 片-1 , 批 号:
20080631);左旋咪唑 (山东仁和堂药业 , 批号:080702 ,
规格:0.025 g·片-1)。小叶黑柴胡原药材 (青海省西宁市
湟中县 , 由本所肖小河研究员鉴定为小叶黑柴胡 B upleurum
smithii Wolff va r.parv i f olium , 属于伞形科柴胡属植物 ,
标本存放于解放军 302 医院全军中药研究所标本室)
印度墨汁 (北京 Solarbio 公司);刀豆蛋白 (ConA , 美
国 Sigma公司);丙氨酸氨基转换酶 (ALT)试剂盒 、 天门
冬氨酸氨基转换酶 (AS T)试剂盒 (北京北化精细化学品有
限公司临床 诊断试剂分厂);丙二 醛 (MDA , 批 号:
20080905)、 考马斯亮蓝试剂盒 (批号:20081104)(南京建
成生物工程研究所);总胆红素 (TBIL)测定试剂盒 (批
号:100310030 , 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司);其
余试剂皆为分析纯。
BS120全自动生化仪 (深圳迈瑞生物医疗电子股份有限
公司);安捷伦-8453 紫外分光光度计 (美国惠普公司);
TGL-16C 离心机 (上海安亭科学仪器厂)。
1.2　动物
SPF 级昆明种小鼠 , 18 ～ 22 g [ 中国人民解放军军事医
学科学 院实验动物中心 , 编号:0038013 , 许可证号:
SCXK- (军), 2007-004] 。
1.3　TFA 的制备
小叶黑柴胡原药材用 85%乙醇浸泡 1 h , 提取 3 次 , 提
取时间 1 h·次-1 , 将提取液过滤 , 于 60 ℃, -0.08 MPa
减压浓缩至相对密度为 1.0 ～ 1.1 , 加入水稀释至 2 倍体积 ,
放置 , 产生沉淀 , 过滤 , 收集滤液 , 即为粗提物。粗提物上
D-101型大孔吸附树脂柱 , TFA 的比上柱量为 3.89 mg ·
mL-1 , 比吸附量为 3.31 mg · mL-1 , 水洗脱 , 以 Molisch
反应为阴性判定水洗脱终点;70%乙醇洗脱 , 收集洗脱液 ,
TLC 检测芦丁不再出现来判定终点 , 70 ℃真空干燥 , 得到
原料药粉。以芦丁为对照品 , 利用紫外分光光度法[7]测定原
料药粉中总黄酮的含量为 62%, 根据山西省中药材标准
(1987 年版)[ 8] 小叶黑柴胡原药材用量 (3 ～ 9 g), 确定 TFA
3 个用药剂量 (300 、 150 、 75 mg· kg -1)。
2　方法
2.1　对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响[ 9]
昆明种小鼠 60 只 , 随机分正常组 , 阳性药左旋米唑组 ,
护肝片组 , TFA 高 、 中 、 低 (300、 150 、 75 mg · kg -1)3
个剂量组 , 每组 10 只 , 给药组按 0.1 mL/10 g 灌胃给药 ,
1 次· d-1 。正常组同法给予蒸馏水。连续 7 d。末次给药后
称取体重 , 按 0.1 mL/ 10 g 尾静脉注射印度墨汁稀释液 , 于
注射后 1 、 5 min用玻璃毛细吸管眼眶静脉丛取血 20 μL , 溶
于 3 mL 0.1%NaHCO 3 溶液中 , 摇匀 , 在波长 650 nm 下测
定吸光度 (A)。将小鼠颈椎脱臼处死 , 分别称取肝 、 脾重
量。按公式计算廓清指数 K 和吞噬指数α, A1 为注射后 1
min (t1)取血所测的吸光度 , A2 为注射后 5 min (t2)取血
所测的吸光度。
廓清指数 K=(lg A1 -lgA2)/ (t2 -t1)
吞噬指数α= 体重肝重+脾重
3
K
2.2　对 ConA 所致免疫性肝损伤小鼠的影响[ 10]
昆明种小鼠 60 只 , 随机分为正常组 , 模型组 , 阳性药
护肝片组 , TFA 高 、 中 、 低 (300 、 150、 75 mg · kg -1)剂
量组。给药组按 0.1 m L/ 10 g 的剂量的灌胃给药 , 1 次 ·
d -1 。正常组和模型组同法给予蒸馏水。首次给药 4 h 后 ,
模型组和给药组按 20 mg · kg -1体重尾静脉注射 ConA 。第
5 日 , 末次给药 4 h 后 , 除正常组外 , 各组动物再次尾静脉
注射 ConA , 20 mg · kg -1 。禁食不禁水 8 h 后摘眼球取血 ,
处死 , 分离小鼠血清。用全自动生化仪测血清 ALT 、 AS T、
TBIL的活力。取小鼠肝脏右叶 0.3 g 左右 , 按重量体积比
1∶9加生理盐水制成 10%的组织匀浆液 , 按照试剂盒说明
检测 MDA 的含量。
2.3　统计学处理
采用 SPSS 11.5 分析应用软件处理分析数据 , 应用方差
分析方法进行组间比较 , P<0.05 被认为具有统计学差异。
2.4　病理学观察
取相同部位肝组织 , 用 10%甲醛溶液固定 , 常规脱水 ,
石蜡包埋 , 5 μm 切片 , HE 染色 , 封片 , 光镜下观察肝组
织的病理变化。
3　结果
3.1　对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响
TFA 3 个剂量组的吸光度值 (A)随时间推移有规则的
减少 , 吸光度值降低较快 , 提示碳粒在血液中消失速度快。
TFA 高 、 中剂量组的α值与正常组相比提高明显 (P <
0.05), 3 个剂量组的 K 值与正常组相比有显著提高 (P <
0.01)。提示 TFA 能提高单核巨噬细胞系统的吞噬功能 , 使
小鼠的免疫功能提高 , 结果见表 1。
表 1　TFA 对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响
Tab 1　Effect of TFA on carbon expurgatory function in mice
组别 (group) 剂量 (d ose) A (1 min) A (5 min) α值 K 值
正常组 -- 0.203±0.026 0.160±0.025 5.58±1.03 0.023±0.004
护肝片组 50 mg· kg -1 0.200±0.016 0.152±0.023 6.97±1.38＊ 0.03±0.015
左旋咪唑组 720 mg· kg -1 0.203±0.008 0.153±0.243 5.84±1.24 0.028±0.01
低剂量组 75 mg· kg -1 0.182±0.021 0.123±0.027 6.11±0.81 0.043±0.016＊＊
中剂量组 150 mg· kg -1 0.177±0.038 0.131±0.029 6.6±0.86＊ 0.033±0.004＊＊
高剂量组 300 mg· kg -1 0.198±0.033 0.145±0.031 6.75±0.83＊ 0.036±0.005＊＊
　　注:与正常组比较 , ＊＊P<0.01 , ＊P<0.05。
　　note:Compare wi th the normal g rou p , ＊＊P<0.01 , ＊P<0.05.
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3.2　对 ConA 所致小鼠免疫性肝损伤的影响
与正常组相比较 , 模型组血清中 ALT 、 AST 、 TBIL 和
肝组织中 MDA 含量明显升高 (P<0.01), 表明实验造模成
功。 TFA 3 个剂量组均能显著降低 ConA 诱导的免疫肝损伤
小鼠血清中的 ALT 和 AS T 的活性 (P <0.01), 降低肝组
织中 MDA 含量 (P<0.01), 降低 TBIL 含量 , 但是只有高
剂量组 、 护肝片组与模型组之间有统计学意义 (P <0.05),
且高剂量组与护肝片组间无明显差别。提示其对小鼠的免疫
性肝损伤有一定的保护作用 , 且以高剂量为佳 , 结果见表
2。
表 2　TFA 对免疫性肝损伤小鼠影响
Tab 2　Effect of TFA on immunohepatic injury in mice
组别 (group) 剂量 (d ose) MDA/ nmol·mgprot ALT/ U · L -1 AST/U · L -1 TBIL/μm ol· L -1
正常组 -- 9.56±4.60 25.0±4.6 105.8±17.7 60.91±31.31
模型组 20 mg· kg -1 20.67±13.72 310.5±194## 485.3±187.3## 139.58±23.57##
护肝片组 50 mg· kg -1 12.29±3.75＊＊ 27.8±1.22＊＊ 95.7±1.67＊＊ 107.45±55.89＊
低剂量组 75 mg· kg -1 8.97±4.40＊＊ 48.1±12.2＊＊ 169.9±52.8＊＊ 131.51±26.20
中剂量组 150 mg· kg -1 10.17±3.52＊＊ 36.8±13.8＊＊ 138.2±39.3＊＊ 103.25±41.33
高剂量组 300 mg· kg -1 11.63±3.34＊＊ 31.4±5.61＊＊ 116.1±18.1＊＊ 86.32±22.53＊
　　注:与正常组相比 , ##P<0.01;与模型组相比 , ＊＊P<0.01 , ＊P<0.05。
　　note:Compared wi th the normal g rou p , ##P<0.01;compared w ith the model g rou p , ＊＊P<0.01 , ＊P<0.05.
3.3　肝脏组织病理观察
光镜下可见 , 正常组小鼠肝细胞及肝小叶形态正常 , 中
央静脉周围肝窦呈放射状发散 , 肝窦内有 Kupffer 细胞散
在 , 汇管区清楚。模型组汇管区轻度炎症 , 伴成纤维细胞和
胶原纤维轻微增多;肝细胞点状变性坏死。护肝片组中央静
脉周围肝细胞变性 , 小灶性坏死 , 少许炎细胞浸润 , 较模型
组有好转。 TFA 75 mg· kg -1剂量组与 TFA 150 mg · kg -1
剂量组可见少量炎症细胞围管性浸润及肝窦淤血 , 肝细胞变
性和凋亡较模型组有不同程度的改善。 TFA 300 mg · kg -1
剂量组肝细胞出现轻度细胞水肿 , 与模型组相比有肝细胞再
生 , 无明显坏死现象 , 肝损伤程度明显减轻 , 见图 1。
图 1　各组小鼠组织切片 (HE×200)
Fig 1　Staining of liver t iss ues
A.正常组 (n orm al group);B.模型组 (model group);C.阳性药护肝片组 (posit ive group);D.T FA 高剂量组 (300 mg· kg -1)(high-
d ose);E.T FA 中剂量组 (150 mg· kg -1)(mid-dose);F.TFA 低剂量组 (75 mg· kg -1)(low-dose)
4　讨论
4.1　TFA 提高小鼠单核巨噬细胞系统吞噬能力
单核巨噬细胞系统 (网状内皮系统)是机体最重要的防
御系统 , 它具有强大而迅速吞噬廓清异体颗粒或某些可溶性
异物的能力 , 并能迅速清除体内自身产生的某些有害物质。
当静脉注入特定大小的惰性碳后 , 它即可被肝 、 脾内的巨噬
细胞及整个单核巨噬细胞系统的其他巨噬细胞迅速吞噬而从
血液中廓清。因此 , 可借助测定血液中碳粒的消失速度来反
映单核巨噬细胞系统吞噬异物的能力[ 11-12] 。本实验通过比
较给药组与正常对照组的血液吸光度值 (A 值)、 吞噬指数
(α值)和廓清指数 (K 值), 结果表明给药组血液中碳粒清
除速度快 , 提示 TFA 能提高小鼠单核巨噬细胞系统吞噬功
能 , 增强小鼠的非特异性免疫力。
4.2　TFA提高机体免疫力
刀豆蛋白 (ConA)是一种被广泛应用可活化 T 细胞的
有丝分裂原 , ConA 静脉注射小鼠体内后 , 大部分在肝脏内
聚集 , 通过活化 T 淋巴细胞而致免疫性肝损伤。肝损伤病
理过程与 ConA 剂量 、 指标检测时间有一定关系。静脉注射
后 6 h , 脾指数达峰值 , 10 h 下降明显;静脉注射后 10 h ,
AST 、 ALT 、 肝指数同时达到峰值[ 13] 。本实验于静脉注射
ConA 8 h 后取血 , TFA 高 、 中 、 低 3 个剂量组均能显著降
低血浆中 ALT 和 AST 的活性 (P <0.01), 结果证实了
TFA 降酶效果好 , 对小鼠的免疫性肝损伤有一定的保护作
用。由 ConA 诱导的小鼠免疫肝损伤模型 , 能发生严重的脂
质过氧化反应 , 且 MDA 的含量随时间的增加成明显上升趋
势[ 14-15] 。本实验检测了小鼠肝组织中 M DA 的含量 , 与正常
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组相比 , 模型组中小鼠 MDA 的含量升高 , 给药组与模型组
相比较 , 均能显著降低肝损伤小鼠组织中 MDA 的含量。提
示 TFA 具有较强的抗氧化作用 。尾静脉注射 ConA 可引起
小鼠急性肝损伤 , 其肝脏病理表现在肝细胞炎症浸润 、 灶性
坏死 、 纤维细胞增多等 , 病理切片结果可以看出 TFA 对损
伤的肝细胞有很好的修复作用。
以上实验结果表明 TFA 能提高机体免疫力 , 原因可能
与提高机体的非特异性免疫力和抗脂质过氧化 、 修复损伤肝
细胞有关 , 真正作用机制有待进一步研究。但其保肝作用显
著 , 有望开发成新的保肝类中药。
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(收稿日期:2010-11-10;修回日期:2010-12-15)
桑叶化学成分研究
杨永玉 , 曾光尧 , 谭健兵 , 李鑫 , 冯绪强 , 王雅静 , 周应军＊ (中南大学药学院 , 长沙　410013)
摘要:目的　研究桑科植物桑叶的化学成分。方法　利用色谱法对桑叶 95%乙醇提取物中的化学成分进行分离。
根据理化性质和波谱数据对分离得到的化合物进行结构鉴定。结果　从桑叶中分离得到 8 个化合物 , 分别是 8-异戊
烯基-7 , 2′-二羟基-4′-甲氧基黄烷 (1)、 bro simine B (2)、 7-羟基香豆素 (3)、 moracin C (4)、 isobavachalcone
(5)、 邻苯二甲酸丁二酯 (6)、 3 , 4-二羟基苯甲酸 (7)、 morachalcone B (8)。结论　其中化合物 (2)是首次从该
植物中分离得到。
关键词:桑叶;化学成分;brosimine B
中图分类号:R284.2　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1672-2981 (2011)02-0092-04
doi:10.3969/ j.issn.1672-2981.2011.02.004
Chemical constituents fromMorus alba L.
YANG Yong-yu , ZENG Guang-yao , TAN Jian-bing , LI Xin , FENG Xu-qiang , WANG Ya-jing , ZHOU Ying-jun＊
(S chool of Pharmaceutical S ciences , Central South Univ ersity , Changsha 410013)
Abstract:Objective　 To de te rmine the chemical constituents of Morus alba L..Methods　The chemical constituents
　　基金项目:国家科技十一五重大专项-重大新药创制项目 (项目编号:2009ZX09102-110)。
作者简介:杨永玉 , 男 , 硕士研究生 , 主要从事天然药物化学成分研究 , Tel:15116281315 , E-mai l:120265884@qq.com　　＊通讯作
者:周应军 , 男 , 硕士生导师 , 主要从事天然产物活性成分研究 , Tel:13319588828 , E-mail:yingjunzhou@hotmai l.com
C ent ral S outh Ph arm acy.February 2011 , Vol.9 No.2　中南药学 2011年 2月第 9卷第 2期