全 文 ：※工艺技术 食品科学 2013, Vol.34, No.16 129
均匀试验设计优化黑莓叶黄酮的提取及组分分析
周鸣谦，刘云鹤，夏久云
(淮海工学院食品工程学院，江苏 连云港 222005)
摘 要：采用均匀试验设计优化黑莓叶黄酮的提取工艺，利用高效液相色谱(HPLC)法分析黑莓叶中黄酮的种类和
含量。结果表明：黑莓叶黄酮的最优提取工艺条件为乙醇体积分数65%、提取温度85℃、料液比1:30、提取3次，
在此条件下黄酮得率为8.091%；黑莓叶黄酮中含有芦丁、野黄芩苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、山奈酚，其含
量分别为3.519、17.342、1.276、1.566、0.928、1.160mg/g，含量最高的为野黄芩苷。研究表明黑莓叶黄酮的含量及
种类丰富，可进行进一步深入研究与开发。
关键词：黑莓叶；黄酮；提取；组分
Optimized Extraction and Composition Analysis of Flavonoids from Blackberry Leaves
ZHOU Ming-qian，LIU Yun-he，XIA Jiu-yun
(College of Food Science and Technology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)
Abstract：The uniform design method was applied to optimize the extraction of flavonoids from blackberry leaves and
the composition of flavonoids in blackberry leaf extracts was analyzed by HPLC. The optimum extraction conditions for
ethanol concentration, temperature, solid-to-solvent ratio and number of repeated extractions were 65%, 85 ℃, 1:30 and 3,
respectively. The extraction yield of flavonoids under the optimized conditions was 8.091%. The resulting blackberry leaf
extract contained 3.519 mg/g rutin, 17.342 mg/g scutellarin, 1.276 mg/g luteolin, 1.566 mg/g quercitrin, 0.928 mg/g apigenin
and 1.160 mg/g kaempferol. This study suggests that blackberry leaves contain a variety of abundant flavonoids and thus
deserves intensive research and development.
Key words：blackberry leaves；flavonoids；extraction；composition
中图分类号：S609.9；TS201.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)16-0129-05
doi:10.7506/spkx1002-6630-201316026
收稿日期：2012-08-14
作者简介：周鸣谦(1973—)，男，副教授，博士，研究方向为农产品深加工。E-mail：yunheliu@126.com
黑莓属蔷薇科(Rosaceal)悬钩子属(Rubus)，为多年生
灌木小浆果果树[1]。自1986年从美国引入我国后，其推广
栽培面积逐年扩大，黑莓产业发展迅速[2-3]。目前对于黑莓
资源的开发，主要集中在果实的加工利用方面，已开发
黑莓果酱、果汁、果酒、果醋等产品[4-7]，并对黑莓果实
中功效性成分的提取、组成及其生理活性进行了初步研
究[8-10]，但对其叶片的开发利用还未被重视。
黑莓叶中除含有蛋白质、氨基酸、纤维素、可溶性
多糖和丰富的矿质元素等多种营养成分外，有资料显示
其还含有丰富的黄酮类物质[11-12]。天然黄酮类物质具有
多种生理活性及功效，能有效清除自由基、改善血液循
环、抗菌抗病毒、降血脂及抗肿瘤等 [13-16]，是当前植物
提取物研究的热点。黑莓叶来源丰富，如能对其所含黄
酮类物质进行深入研究并加以开发，则充分利用了黑莓
资源，有助于黑莓产业的健康发展。本实验对黑莓叶中
黄酮化合物的提取工艺进行优化，并对所提黄酮组成进
行分析，为充分利用黑莓叶提供理论依据和参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑莓叶：于2011年9月采自江苏省赣榆县欢墩镇黑莓
种植基地，晾干后粉碎备用。
氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇、甲醇、
磷酸等(均为分析纯)、乙腈(色谱纯) 南京化学试剂有
限公司；标准品：没食子酸、芦丁、野黄芩苷、木犀草
素、槲皮素、芹菜素、山奈酚和异苷草素(纯度≥98%)
广州齐云生物有限公司。
1.2 仪器与设备
UV745N型紫外-可见分光光度计 上海精科食品有
限公司；型号C18(4.6mm×400mm，5μm)色谱柱、P99型
高压梯度输液泵、UU981可变波长紫外检测器、T98柱温
箱 北京温分分析仪器技术开发有限公司；5021升降恒
温水浴锅 南京金正教学仪器有限公司；蛇形回流冷凝
管 江苏盐城玻璃仪器有限公司。
130 2013, Vol.34, No.16 食品科学 ※工艺技术
1.3 方法
1.3.1 黄酮提取流程
黑莓叶粉末 → 回流提取 → 离心 → 上清液 → 合并上清液 → 抽滤 → 提取液
↓ ↑
叶渣→回流提取→离心→上清液
操作要点：每次称取黑莓叶粉末5.0g；每次回流时间
为1h；离心转速为4000r/min；回流所用乙醇的体积分数、
提取次数、料液比及提取温度均按实验设计参数安排。
1.3.2 黄酮的测定
采用铝离子络合法[17]，以芦丁为标准样品，507nm
波长处吸光度为纵坐标，芦丁的质量浓度(μg/mL)为横
坐标绘制标准曲线。芦丁标准曲线方程为y＝1.0625x－
0.0106，相关系数为0.998，将黑莓叶黄酮提取液稀释10
倍后按上述方法测定吸光度，根据芦丁标准曲线计算稀
释液中黄酮的质量浓度。黄酮得率按式(1)计算：
咘䝂ᕫ⥛/% = h100m
nρVh10-6 (1)
式中：n为提取液稀释倍数；ρ为稀释液中黄酮的质量浓
度/(μg/mL)；V为黄酮提取液体积/mL；m为黑莓叶的质量/g。
1.3.3 黄酮提取工艺条件的优化
1.3.3.1 单因素试验
用体积分数70%的乙醇在80℃条件下回流3次，料
液比为1:25(g/mL)，每组试验做3次平行。固定其他条
件，分别考察提取次数(1、2、3、4、5)、乙醇体积分数
(55%、65%、75%、85%、95%)、料液比(1:15、1:20、
1:25、1:30、1:35)、提取温度(75、80、85、90、95℃)对
黄酮得率的影响。其中考察提取温度的影响时固定料液
比为1:30，其他条件相同。
1.3.3.2 均匀试验设计
选取乙醇体积分数(X1)、提取温度(X2)、料液比(X3)和
提取次数(X4)为考察因素，以黄酮得率为评价指标，进行
均匀试验设计，优选提取工艺。
1.3.4 黄酮组成的高效液相色谱分析
1.3.4.1 色谱条件：
色谱柱：C18(4.6mm×400mm，5μm)；流动相：
A(含0.2%磷酸的乙腈)，B(超纯水)；洗脱梯度：0min
时A为5%，5min时A为28%，40min时A为50%；流速：
1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：360nm[18]；进样
量：5μL。
1.3.4.2 标准图谱的制作
根据文献[18-20]选取芦丁、野黄芩苷、木犀草素、
槲皮素、芹菜素、山奈酚和异甘草素7种标准黄酮类化合
物，混合标样的质量浓度分别为 0.082、0.075、0.087、
0.076、0.067、0.074、0.073mg/mL。将以上配制好的混
合标样按照1.3.4.1节色谱条件测定标样图谱。
1.3.4.3 样品的测定
黑莓叶黄酮提取液用0.45μm的微孔滤膜过滤，然后
按照标准样品图谱的测定条件和方法对提取液进行高效
液相色谱分析确定黄酮的种类。
利用标准样品质量浓度和对应峰面积的关系，计算
样品溶液中每种黄酮的质量浓度。黑莓叶中特定黄酮含
量按照式(2)计算：
m
cV咘䝂৿䞣/(mg/g) = (2)
式中：c为样品溶液中黄酮的质量浓度/(mg/mL)；V
为黄酮提取液的体积/mL；m为黑莓叶的质量/g。
2 结果与分析
2.1 黄酮提取工艺条件优化
2.1.1 单因素试验
2.1.1.1 提取次数对黄酮得率的影响
7
6
5
4
3
2
1
0
1 2 3 4 5
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ᘏ
咘
䝂
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⥛
/%
图 1 提取次数对黄酮得率的影响
Fig.1 Effect of the number of extraction cycles on the extraction yield
of flavonoids
由图1可知，黄酮得率随着提取次数增加而增加。
提取次数在3次以内时，黄酮得率随提取次数的增加而增
加，而超过3次后，黄酮的得率虽然有所增加，但是增加
幅度很小。过多的提取次数增大了活性成分被破坏的可
能，杂质的溶出量也随之增加，给后续操作带来不便，
增加提取成本。因此提取次数应限制在3次以内为宜。
2.1.1.2 乙醇体积分数对黄酮得率的影响
7
6
5
4
3
2
1
0
55 65 75 85 95
Э䝛ԧ⿃ߚ᭄/%
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⥛
/%
图 2 乙醇体积分数对黄酮得率的影响
Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of flavonoids
由图2可知，乙醇体积分数从55%到75%，黄酮得
率逐渐增加，并在75%时达到最大；当乙醇体积分数再
※工艺技术 食品科学 2013, Vol.34, No.16 131
增加时，黄酮得率增加不明显，并且脂溶性物质溶出增
多，尤其是叶绿素几乎完全溶出，给黄酮的提纯去杂带
来较大的麻烦。从成本、提取率和后续脱色除杂等工序
的角度考虑，乙醇体积分数应控制在65%～85%。
2.1.1.3 料液比对黄酮得率的影响
7
8
6
5
4
3
2
1
0
1:15 1:20 1:25 1:30 1:35
᭭⎆↨(g/mL)
ᘏ
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䝂
ᕫ
⥛
/%
图 3 料液比对黄酮得率的影响
Fig.3 Effect of solid-to-solvent ratio on the extraction yield of flavonoids
由图3可知，随着提取液用量增加，黄酮得率增加较
为明显；当料液比小于1:30后，黄酮得率趋于稳定。从
黄酮得率和减少溶剂用量等方面综合考虑，料液比不宜
过大，定在1:25～1:35范围内较为适宜。
2.1.1.4 提取温度对黄酮得率的影响
7
8
6
5
4
3
2
1
0
75 80 85 90 95
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ᕫ
⥛
/%
图 4 提取温度对黄酮得率的影响
Fig.4 Effect of temperature on the extraction yield of flavonoids
由图4可知，在75～85℃，随着提取温度的升高黄酮
得率明显增加，85℃时达到最高；超过85℃后，由于部
分种类黄酮化合物受热发生分解和氧化，黄酮的得率不
但没增加反而明显下降。从提高黄酮的得率和降低生产
成本等方面考虑，回流提取温度应控制在80～90℃的范
围内。
2.1.2 均匀试验设计
根据表 1的安排进行试验，测得各处理条件下
的黄酮得率。采用D P S数据处理系统进行二次多项
式逐步回归，排除不显著项，保留显著项，建立了
黄酮得率 ( Y )与乙醇体积分数 ( X 1)、提取温度 ( X 2)、
料液比 ( X 3 )、提取次数 ( X 4 )之间的回归方程： Y＝
5.91424296－0.03454695806X1＋0.003479061159X32－
0.0015335173506X1X3＋0.016557354486X2X4，回归方程决
定系数R2＝0.9963。
该模型的决定系数接近于1，表明实测值与模型有
很好的一致性。对回归方程的的各因素进行显著性检验
(表2)结果表明：方程中的各项X1(P＝0.0009＜0.05)，
X1X3(P＝0.0016＜0.05)，X32(P＝0.0203＜0. 05)和X2X4
(P＝0.0101＜0.05)4项均有显著性，表明本研究所选乙醇
体积分数、提取温度、料液比和提取次数4个因素对试验
结果均有显著的影响。从模型还可知，黄酮提取得率主
要与一次项X1、交互项X1X3负相关，而与二次项X3及交互
项X2X4负相关。
通过所建立的回归方程对黄酮得率进行预测，如表3
所示，第1组的预测值(8.2798%)最大，残差较小，其对应
的最优提取工艺条件为：乙醇体积分数65%、提取温度
85℃、料液比1:30、提取3次。
表 1 均匀试验安排结果
Table 1 Uniform design arrangement and results
试验
号
因素 总黄酮
得率/%X1乙醇体积分数/% X2提取温度/℃ X3料液比 X4提取次数
1 1(65) 2(85) 3(1:30) 6(3) 8.030
2 2(70) 4(80) 6(1:30) 5(2) 6.058
3 3(75) 6(90) 2(1:25) 4(1) 4.112
4 4(80) 1(80) 5(1:25) 3(3) 6.231
5 5(85) 3(90) 1(1:20) 2(2) 4.745
6 6(90) 5(85) 4(1:20) 1(1) 2.842
表 2 各因素显著性检验
Table 2 Statistical significance of the linear, quadratic and interactive terms
项 X1 X1X3 X32 X2X4
T值 3.2824 4.0154 5.7680 5.9205
P值 0.0009 0.0016 0.0203 0.0101
表 3 残差分析
Table 3 Residual analysis
试验号 观测值/% 预测值/% 残差
1 8.0300 8.2798 －0.24980
2 6.0580 5.9601 0.09790
3 4.1120 4.1124 －0.00045
4 6.2310 6.1316 0.09937
5 4.7450 4.7927 －0.04772
6 2.8420 2.8036 0.03831
2.2 最优提取条件的验证
采用乙醇体积分数65%，提取温度85℃，料液比
1:30，提取3次，3次验证实验，总黄酮的平均得率为
8.091%，结果重复性良好，证明所得黄酮的最优提取工
艺可行。
2.3 黄酮的高效液相色谱分析
由图5A可知，7种标准样品芦丁、野黄芩苷、木犀
草素、槲皮素、芹菜素、山奈酚和异苷草素在实验色谱
条件下的保留时间分别为：13.848、14.992、23.957、
24.515、29.290、30.848、34.732min，各标准样品均可分
离开来。
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1
2
34 5
6
7
48
44
40
36
32
28
24
20
12
16
8
4
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
⬉
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/ m
V
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A
a
b
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70
60
50
40
30
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0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
⬉
य़
/ m
V
ᯊ䯈/min
B
1～7分别为芦丁、野黄芩苷、木犀草素、
槲皮素、芹菜素、山奈酚、异苷草素。
图 5 混合标准样品(A)和样品(B)的HPLC图谱
Fig.5 HPLC chromatograms of mixed standards of flavonoids and
blackberry leaf extract
将图5A与图5B进行对比，根据出峰时间的先后确定
黑莓叶中黄酮的种类。图5B中共有9个明显的成分峰，
分析结果见表4，其中峰b、c、f、g、h、i可依次确定
为芦丁、野黄芩苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、山奈
酚，其含量分别为3.519、17.342、1.276、1.566、0.928、
1.160mg/g，其中野黄芩苷含量最高；其余3个成分峰在
该实验条件下未能确定。
由于HPLC分析时采用的是梯度洗脱，因此在标样图
谱和样品图谱中都出现了不同程度的基线漂移；此外在
提取物中可能含有强吸附的物质，所以在样品图谱中基
线漂移更为明显。
表 4 黑莓叶黄酮的组成
Table 4 Flavonoid composition of blackberry leaves
序号 出峰时间/min 黄酮种类 含量/(mg/g)
a 11.957 －
b 13.957 芦丁 3.519
c 15.090 野黄芩苷 17.342
d 19.090 －
e 22.323 －
f 23.923 木犀草素 1.276
g 24.423 槲皮素 1.566
h 29.290 芹菜素 0.928
i 30.723 山奈酚 1.160
注：－.未确定。
3 讨论与结论
3.1 黑莓叶黄酮的提取工艺
本实验通过均匀试验设计优化黑莓叶黄酮的提取工
艺，结果表明在乙醇体积分数65%、提取温度85℃、料
液比1:30、提取3次的条件下，黄酮的得率达到8.091%，
研究中所建回归模型能很好地预测黑莓叶中黄酮的提取
工艺。
3.2 黑莓叶黄酮的高效液相色谱分析
通过高效液相色谱对黑莓叶黄酮进行分析，在实验
条件下可以确定黑莓叶黄酮含有芦丁、野黄芩苷、木犀
草素、槲皮素、芹菜素、山奈酚，其含量分别为3.519、
17.342、1.276、1.566、0.928、1.160mg/g，其中野黄芩
苷含量最高。
通过与黑莓叶黄酮相关的研究文献比较，发现不
同文献所示的黑莓叶黄酮存在较大差异。植物中黄酮
物质的积累受到生长地域、栽培条件等的影响[21-22]，也
与其生长周期有着密切联系 [23]。在本实验的研究过程
中，还发现不同时期同一地点采收的黑莓叶中的黄酮
含量也存在不同。从黑莓栽培的角度考虑，其果实的
采收期一般在7～8月，采收期之前果实的形成与发育
需要其叶片进行光合作用来提供养料，此时进行叶片
的采摘不利于果实的生产，而采收期过后，叶片所生
产出来的营养物质只有部分被积累下来供树体生长，
随气温降低其叶片自然脱落，如在这一阶段对于黑莓
叶进行采摘利用将是最经济可行的。同时，黑莓当年
挂过果的枝条来年将不会结果，在冬季还进行剪枝，
去掉多余的枝条。因此对不同时期黑莓叶中的黄酮含
量进行跟踪研究具有重要的生产指导作用。本研究仅
选取了部分黄酮物质进行分析，初步确定黑莓叶黄酮
主要包括9种组分，其中6个组分已确定，3个组分未能
定出，此外是否还含有其他黄酮类物质，值得在下一
步的研究工作中继续深入探讨。
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