全 文 ：收稿日期:2015-02-06
基金项目:四川省教育厅理科重点项目(12ZA026，15ZA0263)
作者简介:代晶(1979-)，女，博士，讲师，研究方向:药物分析与药代动力学研究;Tel:028-62308639，E-mail:daijing320@ 126. com。
HPLC-UV-ELSD同时测定灰毡毛忍冬中 9 种成分的含量
代 晶，罗 玲，王佳慧，石明芯，付世曦，蔡月袖
(成都医学院药学院，四川 成都 610083)
摘要 目的:建立 HPLC-UV-ELSD同时测定灰毡毛忍冬中 9 种成分(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、
3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙)的含量。方
法:采用 Shiseido C18色谱柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)，以 0. 2%甲酸-乙腈为流动相进行梯度洗脱，体积流量为 1. 0
mL /min，柱温为 35 ℃，检测波长为 326、350 nm。ELSD漂移管温度为 100 ℃，载气(氮气)流速为 3 L /min。结果:上
述成分在考察范围内，进样量与各自峰面积之间线性关系良好(r ＞ 0. 9983)，精密度 ＲSD ＜ 2. 5%，重复性 ＲSD ＜
3. 8%，平均加样回收率在 96. 3% ～ 100. 7%。结论:该方法准确、快速、重复性好，可用于灰毡毛忍冬中 9 种成分的
测定。
关键词 灰毡毛忍冬;高效液相色谱-紫外-蒸发光串联检测系统;活性成分
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)06-1217-03
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 06. 027
忍冬科植物灰毡毛忍冬 Lonicera macranthoides
Hand. -Mazz. 是 2010 年版中国药典一部收载的“山
银花”来源品种之一，以干燥花蕾或带初开的花入
药，具有清热解毒、疏散风热之功效〔1〕。其主要成
分有有机酸类、黄酮类以及三萜皂苷类等〔2〕。由于
各成分性质差异大，中国药典分别采用 HPLC-UV
和 HPLC-ELSD 测定灰毡毛忍冬中绿原酸和灰毡毛
忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙的含量，操作较为复杂。
有文献〔3〕采用 HPLC-ELSD 同时测定绿原酸、灰毡
毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙，但该方法却降低了
绿原酸等具有紫外吸收物质的检测灵敏度。为了兼
顾两者，本实验采用 HPLC-UV-ELSD 串联检测技
术，在一个分析周期内同时检测灰毡毛忍冬花蕾中
的 9 种成分。现报道如下。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 Ultimate 3000 型高效液相色谱仪(美
国 Dionex 公司);2000ES 型蒸发光散射检测器(美
国 Alltech 公司);DISCOVEＲ-SP 微波合成仪(美国
CEM公司)。
1. 2 材料 新绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、3，4-二
咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰
奎宁酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙对照品均
购于成都曼思特生物科技有限公司，质量分数均≥
98%，批 号 依 次 为 MUST-12113001、13013002、
12041703、12041114、12101101、12081803、13022804、
13022805。绿原酸对照品由成都天源天然产物有限
公司提供，质量分数 98. 36%，批号为 CAA-111101。
实验用灰毡毛忍冬药材分别购自福建、贵州、湖北、
安徽、湖南、广西、重庆，由成都医学院钟世红副教授
鉴定为忍冬科植物灰毡毛忍冬 Lonicera macran-
thoides Hand. -Mazz. 的干燥花蕾。甲醇、乙腈为色
谱纯，水为屈臣氏蒸馏水。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件〔4，5〕 Shiseido C18色谱柱(250 mm ×
4. 6 mm，5 μm);流动相为 0. 2% 甲酸(A)-乙腈
(B)，梯度洗脱(0 ～ 10 min，4% →6% B;10 ～ 30
min，6%→8% B;30 ～ 35 min，8% →10% B;35 ～ 45
min，10%→14% B;45 ～ 65 min，14%→18% B;65 ～
75 min，18%→20% B;75 ～ 85 min，20%→30% B;
85 ～ 97 min，30%→45% B);体积流量为 1. 0 mL /
min;柱温为 35 ℃;新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3，4
二咖啡酰奎宁酸、3，5 二咖啡酰奎宁酸、4，5 二咖啡
酰奎宁酸的检测波长均为 326 nm，木犀草苷检测波
长为 350 nm;灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙检
测的 ELSD漂移管温度为 100 ℃，载气(氮气)流速
为 3 L /min。
2. 2 对照品溶液的制备 分别精密称取各对照品
适量，用 50%甲醇稀释定容，得混合对照品溶液，其
质量浓度分别为:新绿原酸 90. 0 μg /mL、绿原酸
242. 5 μg /mL、隐绿原酸 22. 5 μg /mL、木犀草苷 6. 2
μg /mL、3，4-二咖啡酰奎宁酸 21. 0 μg /mL、3，5-二咖
啡酰奎宁酸 191. 5 μg /mL、4，5-二咖啡酰奎宁酸
39. 5 μg /mL、灰毡毛忍冬皂苷乙 520. 0 μg /mL、川续
断皂苷乙 190. 0 μg /mL。
2. 3 供试品溶液的制备 取灰毡毛忍冬药材粉末
(过 60 目筛)0. 04 g，精密称定，置微波玻璃试管中，
·7121·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 6 期 2015 年 6 月
精密加入 50%甲醇 4 mL，称定重量，在 60 ℃条件
下，微波提取 10 min，放冷后再称定重量，用 50%甲
醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。
2. 4 专属性试验 分别取混合对照品、供试品溶
液各 10 μL，按“2. 1”项下条件测定。在此条件下，
各成分分离情况良好，结果见图 1。
图 1 混合对照品(A)和灰毡毛忍冬药材(B)
的 HPLC-UV-ELSD图
1. 新绿原酸 2. 绿原酸 3. 隐绿原酸 4. 木犀草苷 5.
3，4 二咖啡酰奎宁酸 6. 3，5 二咖啡酰奎宁酸 7. 4，5-二
咖啡酰奎宁酸 8. 灰毡毛忍冬皂苷乙 9. 川续断皂苷乙
2. 5 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液 1、
2、5、10、15、20 μL，进样测定。灰毡毛忍冬皂苷乙和
川续断皂苷乙以进样质量的自然对数为横坐标，峰
面积的自然对数为纵坐标进行线性回归，其他对照
品以进样质量为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性
回归，得回归方程，结果见表 1。
表 1 9 种成分的线性关系考察结果
化合物 回归方程 r 线性范围 /μg
新绿原酸 Y =33. 837X －0. 067 0. 9997 0. 090 ～ 1. 80
绿原酸 Y =41. 627X －1. 423 0. 9999 0. 2425 ～ 4. 85
隐绿原酸 Y =46. 555X －0. 214 0. 9999 0. 0225 ～ 0. 450
木犀草苷 Y =29. 485X －0. 035 0. 9998 0. 0062 ～ 0. 124
3，4-二咖啡酰奎宁酸 Y =30. 022X －0. 146 0. 9993 0. 0210 ～ 0. 420
3，5-二咖啡酰奎宁酸 Y =26. 380X －1. 092 0. 9998 0. 1915 ～ 3. 83
4，5-二咖啡酰奎宁酸 Y =45. 700X －0. 704 0. 9997 0. 0395 ～ 0. 79
灰毡毛忍冬皂苷乙 Y =1. 603X +1. 998 0. 9983 0. 520 ～ 10. 40
川续断皂苷乙 Y =1. 484X +0. 868 0. 9986 0. 190 ～ 3. 80
2. 6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液 10
μL，连续进样 6 次，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原
酸、木犀草苷、3，4 二咖啡酰奎宁酸、3，5 二咖啡酰奎
宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川
续断皂苷乙峰面积的 ＲSD 分别为 0. 8%、0. 8%、
1. 2%、1. 1%、2. 5%、2. 1%、1. 7%、1. 4%、1. 7%，表
明仪器精密度良好。
2. 7 重复性试验 取同一批供试品 6 份，按“2. 3”
项下方法制备供试品溶液，取 10 μL 进样分析。结
果样品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、3，
4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖
啡酰奎宁酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙峰面
积的 ＲSD 分别为 2. 0%、1. 4%、1. 7%、2. 4%、
3. 0%、2. 4%、3. 8%、1. 6%、3. 6%，表明方法重复性
良好。
2. 8 稳定性试验 将制备好的供试品溶液分别在
0、6、12、24、48 h进样，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿
原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡
酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、灰毡毛忍冬皂苷
乙、川续断皂苷乙峰面积的 ＲSD 依次为 1. 5%、
1. 9%、1. 7%、1. 2%、1. 5%、1. 8%、1. 0%、3. 2%、
3. 2%。结果表明供试品溶液中上述 9 个成分在 48
h内稳定性良好。
2. 9 加样回收率试验 采用加样回收法，取已知
含量的灰毡毛忍冬药材样品(产地:重庆)，分别加
入各对照品适量，按“2. 3”项下方法制备供试品溶
液，测定并计算加样回收率，结果新绿原酸、绿原酸、
隐绿原酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二
咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、灰毡毛忍冬皂
苷乙、川续断皂苷乙的平均加样回收率分别为
100. 7%、97. 2%、96. 4%、99. 8%、97. 6%、97. 2%、
96. 3%、96. 8%、98. 4%(n = 6)，ＲSD依次为 2. 9%、
1. 5%、2. 5%、2. 0%、1. 2%、0. 59%、2. 3%、1. 2%、
2. 2%。
2. 10 样品测定 取 10 批灰毡毛忍冬药材，分别
按“2. 3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算
各成分的含量，结果见表 2。
3 讨论
本试验建立了 HPLC-UV-ELSD 同时测定灰毡
毛忍冬药材中 9 种活性成分含量的方法。结果显示
UV 对有机酸类和黄酮类成分有很好的响应灵敏
度，但对皂苷成分几乎无响应。ELSD 虽然是通用
型检测器，对皂苷成分响应良好，但对其他成分的响
应极差，只能测定含量较高成分(如绿原酸和 3，5-
二咖啡酰奎宁酸)，而其他成分几乎无法检测。为
了获得最佳检测效果，试验以 326 nm波长检测有机
酸类成分，以 350 nm 检测黄酮类成分，以 ELSD 检
测皂苷类成分。经方法学验证，本试验所建立的方
·8121· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 6 期 2015 年 6 月
表 2 不同产地的灰毡毛忍冬药材中 9 种成分的含量(%)
来源 新绿原酸 绿原酸 隐绿原酸 木犀草苷
3，4-二咖啡
酰奎宁酸
3，5-二咖啡
酰奎宁酸
4，5-二咖啡
酰奎宁酸
灰毡毛忍冬
皂苷乙
川续断
皂苷乙
福建 0. 77 3. 84 0. 14 0. 022 0. 12 4. 01 0. 31 5. 71 0. 54
贵州 0. 79 4. 93 0. 21 0. 016 0. 14 4. 73 0. 40 6. 48 0. 52
湖北 0. 31 2. 30 0. 06 0. 008 0. 04 3. 79 0. 13 3. 33 0. 37
安徽 0. 45 4. 51 0. 14 0. 014 0. 15 6. 19 0. 49 6. 32 0. 44
湖南 1 0. 74 4. 83 0. 18 0. 021 0. 11 3. 79 0. 32 6. 48 0. 43
湖南 2 0. 71 4. 48 0. 16 0. 018 0. 12 5. 39 0. 37 5. 97 0. 37
广西 1 0. 42 4. 33 0. 14 0. 013 0. 15 7. 17 0. 52 6. 64 0. 80
广西 2 0. 73 4. 67 0. 15 0. 009 0. 10 4. 32 0. 27 6. 31 0. 34
重庆 1 0. 80 4. 22 0. 25 0. 020 0. 14 5. 99 0. 42 6. 28 0. 25
重庆 2 0. 76 5. 40 0. 20 0. 016 0. 12 4. 85 0. 36 7. 62 0. 59
法简单、灵敏、准确。此外，本试验采用微波法提取
灰毡毛忍冬药材的有效成分，该方法用时短、样品用
量少，其提取效率与中国药典规定的超声法〔1〕比较
无显著差异。
2010 年版中国药典规定山银花中绿原酸的含
量不得低于 2%，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷
乙的总量不得低于 5%〔1〕。本试验结果显示，各地
药材除湖北产药材的皂苷类成分未达到要求外，其
余均满足中国药典规定。此外，3，5-二咖啡酰奎宁
酸含量较高，其含量几乎与绿原酸和灰毡毛忍冬皂
苷乙相当，因此可以考虑将其作为灰毡毛忍冬药材
的另一个质量控制指标。其他 6 种成分中木犀草苷
的含量最低，不超过 0. 022%。而木犀草苷是金银
花的质控成分，中国药典规定不得少于 0. 05%。由
此可见灰毡毛忍冬药材中木犀草苷含量普遍低于金
银花。
参 考 文 献
［1］国家药典委员会 . 中华人民共和国药典［S］．一部 . 北
京:中国医药科技出版社，2010:28-29.
［2］刘文娟，陈雨，马鑫，等 . 灰毡毛忍冬化学成分研究进展
［J］．中国野生植物资源，2013，32(1):6-10.
［3］卢凤来，蒋海英，陈月圆，等 . HPLC-ELSD 法测定山银花
中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙［J］． 中
成药，2013，35(8):1821-1823.
［4］谷筱玉，陈振鹏，陈乾平，等 . HPLC-UV-ELSD 测定山银
花中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含
量［J］．药物分析杂志，2011，31(5):884-887.
［5］滕昱伯，陈雨，赵友谊，等 . HPLC 法同时测定灰毡毛忍
冬不同部位 5 个活性成分的含量［J］．中药材，2012，35
(4):586-588.
·9121·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 6 期 2015 年 6 月