全 文 ：·药理·
收稿日期:2015-01-20
基金项目:国家自然科学基金(31370373);湖北自然科学基金(2011CDA139)
作者简介:汪鋆植(1966-)，男，博士，教授，主要从事三峡地区民族民间药物活性评价和质量控制研究;Tel:0717-6397478，13886684362，E-
mail:wangjunzhi@ ctgu. edu. cn。
忍冬木层孔菌醇提物对肝纤维化大鼠肝星状细胞的影响
汪鋆植1，武 玲1，罗友成1，张宏岐2，黄文峰2，闫喜明1，张 盼1
(1. 天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学)/湖北省土家族药物研究所，湖北 宜昌 443002;2.
三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002)
摘要 目的:研究忍冬木层孔菌醇提物抗肝纤维化的机制。方法:用 2 mL /kg CCl4 橄榄油溶液对大鼠腹腔注
射制备肝纤维化模型。第 1 次注射后，给药组分别灌胃剂量相当于忍冬木层孔菌生药量 1、0. 5 g /kg 的乙醇提取
物，1 次 /d，共给药 8 w。给药结束后，测定各组大鼠血清转化生长因子-β1(TGF-β1)、肝组织的总抗氧化能力(T-
AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;免疫组化测定 α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及基质金
属蛋白酶-1(MMP-1)和基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)的表达。结果:与模型组比较，忍冬木层孔菌醇提物
能降低模型大鼠血清中 TGF-β1 含量;升高肝组织 T-SOD 的活性及 T-AOC 水平，降低 MDA 含量;下调肝组织中 α-
SMA的表达，上调 MMP-1 的表达并下调 TIMP-1 的表达。结论:忍冬木层孔菌具有良好的抗氧化能力，具有防治肝
纤维化的应用前景。其机制可能与抑制由氧化应激引发的肝星状细胞激活，并降低 TGF-β1 等激活肝星状细胞的
细胞因子，上调促进胶原降解的 MMP-1 表达有关。
关键词 忍冬木层孔菌;桑黄;肝星状细胞;抗氧化
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)08-1680-05
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 08. 030
Effects of Ethanol Extracts of Phellinus lonicerinus on Hepatic Stellate Cells of Fibrosis Liver in Ｒats
WANG Jun-zhi1，WU Ling1，LUO You-cheng1，ZHANG Hong-qi2，HUANG Wen-feng2，YAN Xi-ming1，ZHANG Pan1
(1. Hubei Key Laboratory of Natural Products Ｒesearch and Development，China Three Gorges University /Hubei Institute of Tujia Med-
ical Ｒesearch，Yichang 443002，China;2. Medical Science College，China Three Gorges University，Yichang 443002，China)
Abstract Objective:To study the effects of ethanol extracts of Phellinus lonicerinus on hepatic stellate cells of fibrosis liver in
rats. Methods:The model rats of hepatic fibrosis were established by intraperitoneally injection of CCl4 olive oil solution at the dose of 2
mL /kg. And then the model rats were administered orally ethanol extract of Phellinus lonicerinus with 1 g /(kg·d)and 0. 5 g /(kg·d)
for consecutive eight weeks. Serum transforming growth factor-β1(TGF-β1)，liver total antioxidant capacity(T-AOC) ，total superoxide
dismutase(T-SOD)activity and the content of malondialdehyde(MDA)were determined． The α-smooth muscle actin(α-SMA) ，matrix
metalloproteinases-1(MMP-1)and tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-1(TIMP-1)were determined by immunohistochemical. Ｒesults:
Compared to the model group，the ethanol extracts of Phellinus lonicerinus decreased the content of serum TGF-β1 and MDA in liver tis-
sue，as well as increased the activity of T-SOD and the level of T-AOC. Immunohistochemical showed that the ethanol extracts of Phelli-
nus lonicerinus downregulated the expression of α-SMA in liver tissue and the expression of TIMP-1，as well as upregulated the expres-
sion of MMP-1. Conclusion:The ethanol extracts of Phellinus lonicerinus has good antioxidative activity with application prospects in pre-
vention of hepatic fibrosis. The mechanism may be related to inhibiting the activation of hepatic stellate cells induced by oxidative
stress，reducing the TGF-β1 and cytokines activating the hepatic stellate cells，and upregulating the expression of MMP-1 promoting the
collagen degradation.
Key words Phellinus lonicerinus (Bond.)Bond. et Sing;Sanghuang;Hepatic stellate cell;Antioxidation
忍冬木层孔菌 Phellinus lonicerinus(Bond. )
Bond. et Sing 属于土家族常用药，是药用真菌桑黄
中的一种，被收载于《湖北省中药材质量标准》
(2009)年版，主治癥瘕积聚、淋病、崩漏带下、脾虚
泄泻等证，有排毒软坚、活血止血、和胃止泻等功效。
此前对忍冬木层孔菌的研究较少，而桑黄中的常用
品种火木层孔菌 Phellinus igniarius(L. :Fr. )Quél.
和鲍姆木层孔菌 Phellinus baumii Pilate 具有抗肿
瘤、抗氧化、抗肝纤维化等多种药理活性〔1-4〕。笔者
前期研究发现忍冬木层孔菌醇提物对 CCl4 所致的
肝纤维化有良好的抑制作用，因此，本文对忍冬木层
孔菌醇提物对肝纤维化大鼠肝星状细胞活化的影响
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作进一步研究，为忍冬木层孔菌开发与应用提供依
据。
1 材料与仪器
1. 1 实验动物 SPF 级雄性 Wistar 大鼠，体质量
(180 ± 20)g，购自湖北省疾病预防与控制中心，实
验动物生产许可证号:SCXK(鄂)2008-0005。
1. 2 药物与试剂 实验所使用忍冬木层孔菌在湖
北宜昌采集，经中国科学院微生物研究所卯晓岚教
授鉴定为忍冬木层孔菌 Phellinus lonicerinus(Bond. )
Bond. et Sing，将忍冬木层孔菌原药材粉碎，用 90%
乙醇 80 ℃回流提取 3 次，合并提取液后，旋转蒸发
至无醇味，用蒸馏水配成 1 g /mL〔5〕的忍冬木层孔菌
悬液;秋水仙碱，吉林省辉南辉发制药股份有限公
司，批号:20100201;橄榄油，上海嘉里食品工业有限
公司;四氯化碳(CCl4)，天津市恒兴化学试剂制造
有限公司;T-AOC、T-SOD、MDA 及双缩脲蛋白定量
试剂盒，南京建成生物工程研究所;TGF-β1 ELISA
试剂盒、MMP-1 及 TIMP-1 单克隆抗体，美国 Ｒ＆D
systems;α-SMA单克隆抗体，购自武汉博士德生物
科技有限公司;DAB显色试剂盒，SP-9000 通用型免
疫组化染色试剂盒，购自北京中杉金桥生物公司。
1. 3 主要仪器 Stat Fax-2100 型酶标仪(单通
道)，美国 Awareness 公司;U-3010 紫外-可见分光光
度计，日本 Hitachi High-Technol 公司;DMＲ 多功能
显微镜及图像分析系统、TP1020 组织脱水机，德国
Leica公司。
2 方法
2. 1 动物造模与分组 主要参照并改良崔红燕
等〔6〕的造模方法，选取体质量(180 ± 20)g 的雄性
Wistar大鼠 50 只，于(25 ± 2)℃的空调房内饲养，每
天光照 12 h，喂饲正常饲料，自由饮水，3 d 后按体
质量随机分为 5 组:正常对照组、模型组、秋水仙碱
阳性对照组及忍冬木层孔菌醇提物高、低剂量组。
除正常对照组外各组大鼠均用腹腔注射 50% CCl4
橄榄油溶液 2 mL /kg 的方法造模，2 次 /w，共 8 w。
正常对照组采用橄榄油代替。在距首次注射 50%
CCl4 橄榄油溶液 14 d后，各组大鼠的饮水中均加入
350 mg /L的苯巴比妥以增加大鼠肝脏对 CCl4 的敏
感度。在第 1 次注射 50% CCl4 橄榄油溶液之后，
正常对照组、模型组大鼠灌胃生理盐水;秋水仙碱组
灌胃 0. 2 mg /kg的秋水仙碱;忍冬木层孔菌高、低剂
量组分别灌胃相当于忍冬木层孔菌 1、0. 5 g /kg 的
醇提物。配制的药物浓度按每天每次灌胃 2 mL /kg
计算，共灌胃 8 w，每周称 2 次体质量以调整给药
量。
2. 2 样本采集和处理 大鼠在处死前禁食不禁水
24 h。称体质量后采用乙醚麻醉，从股动脉处取血
后处死，解剖切取肝脏将标本置于 4 ℃生理盐水中
洗涤，称量完整肝脏质量;切取大鼠肝脏小叶 5 × 5
× 2 mm，于 4%多聚甲醛中固定 24 h;另取 0. 1 g 肝
组织，于清洁的试管中测定肝组织 T-AOC、T-SOD的
活性及 MDA 含量。血液室温放置 30 min 后，2 000
r /min离心 10 min，吸取血清于 － 20 ℃保存备用。
2. 3 指标测定
2. 3. 1 血清 TGF-β1:参照 ELISA 试剂盒说明书进
行。
2. 3. 2 肝组织抗氧化指标的测定:T-AOC、T-SOD、
MDA的测定按照试剂盒说明书进行。
2. 3. 3 免疫组化实验:肝组织置于 4%多聚甲醛固
定液固定 24 h，用水冲洗后经梯度乙醇脱水，二甲苯
透明后，进行石蜡包埋处理切成 4 μm 厚的薄片，60
℃烘箱中固定 6 h 后，二甲苯脱蜡、酒精梯度水化、
3%过氧化氢溶液封闭、枸橼酸钠缓冲液微波抗原修
复、正常山羊血清封闭等步骤后，加一抗(小鼠抗大
鼠 α-SMA、MMP-1 和 TIMP-1 单克隆抗体)4 ℃冰箱
过夜，次日取出切片用 PBS 冲洗 3 次，依次加二抗
(山羊抗小鼠)孵育、PBS冲洗，DBA显色(黄色)，苏
木素复染、脱水，中性树胶固定封片。分别在每张片
子的四周和中央随机选取 5 个视野于显微镜下取
图，并用 DMＲ 图像分析系统对图片中的阳性表达
面积进行积分定量。
2. 4 统计学处理 采用 SPSS 13. 0 统计软件对数
据进行处理。先进行数据的正态分布检验，方差齐
性检验，计量数据用 珋x ± s 表示，组间差异用单因素
方差分析，多个样本均数间每两个均数的比较采用
q检验。以 P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。
3 结果
3. 1 忍冬木层孔菌醇提物对肝纤维化大鼠血清中
TGF-β1 含量的影响 结果如表 1 所示，模型组大鼠
血清 TGF-β1 含量较正常对照组显著升高(P ＜
0. 01);与模型组比较，各给药组大鼠血清中的 TGF-
β1 含量显著降低(P ＜ 0. 01)。
3. 2 忍冬木层孔菌醇提物对肝纤维化大鼠肝组织
抗氧化指标的影响 结果如表 2 所示，与正常对照
组比较，模型组大鼠肝组织 T-SOD及 T-AOC水平显
著降低，MDA 含量升高(P ＜ 0. 01)。与模型组比
较，各给药组大鼠肝组织 T-SOD及 T-AOC水平显著
升高，MDA含量降低(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)。
3. 3 忍冬木层孔菌醇提物对肝纤维化大鼠肝星状
细胞 α-SMA表达的影响 结果如图 1 所示，正常对
·1861·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 8 期 2015 年 8 月
表 1 忍冬木层孔菌醇提物对肝纤维化大鼠
血清中 TGF-β1 含量的影响(珔x ± s)
组别
剂量 /
(mg /kg) n /只
TGF-β1 /(ng /L)
正常对照组 － 10 21. 2 ± 4. 6＊＊
模型组 － 6 41. 3 ± 4. 8
忍冬木层孔菌醇提物 1000 10 23. 4 ± 2. 8＊＊
500 9 33. 3 ± 1. 8＊＊
秋水仙碱组 0. 2 6 28. 4 ± 2. 2＊＊
注:与模型组比较，＊＊P ＜ 0. 01
照组大鼠肝组织仅在汇管区有少量的 α-SMA 表达，
模型组大鼠的 α-SMA 在汇管区和肝实质中均存在
强烈的阳性表达，模型组与正常对照组比较差异显
著(P ＜ 0. 01);与模型组比较，各给药组 α-SMA 表
达量显著减少(P ＜ 0. 01)。
3. 4 忍冬木层孔菌醇提物对肝纤维化大鼠肝星状
细胞 MMP-1 表达的影响 结果如图 2 所示，正常对
照组大鼠肝脏组织中仅有少量的 MMP-1 表达，模型
组大鼠肝组织中MMP-1表达较正常对照组显著升
表 2 忍冬木层孔菌醇提物对肝纤维化大鼠肝组织抗氧化指标的影响(珔x ± s)
组别 剂量 /(mg /kg) n /只 MDA/(nmol /mg prot) T-SOD/(U/mg prot) T-AOC /(U/mg prot)
正常对照组 － 10 0. 68 ± 0. 19＊＊ 364. 10 ± 44. 68＊＊ 1. 32 ± 0. 14＊＊
模型组 － 6 2. 48 ± 0. 52 209. 27 ± 38. 44 0. 42 ± 0. 12
忍冬木层孔菌醇提物 1000 10 1. 33 ± 0. 57＊＊ 325. 47 ± 97. 29＊＊ 1. 04 ± 0. 22＊＊
500 9 1. 74 ± 0. 74* 271. 66 ± 50. 01* 0. 81 ± 0. 07＊＊
秋水仙碱组 0. 2 6 1. 64 ± 0. 27* 275. 39 ± 32. 21* 0. 62 ± 0. 03*
注:与模型组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
图 1 忍冬木层孔菌醇提物对肝纤维化大鼠肝星状细胞 α-SMA表达的影响
A. 正常对照组 B. 模型组 C. 忍冬木层孔菌醇提物高剂量组 D. 忍冬木层孔菌醇提物低剂量组 E. 秋水仙碱组
注:与模型组比较，＊＊P ＜ 0. 01
高(P ＜ 0. 01)。与模型组比较，各给药组大鼠肝组
织中 MMP-1 表达显著升高(P ＜ 0. 01)。
3. 5 忍冬木层孔菌醇提物对肝纤维化大鼠肝星状
细胞 TIMP-1 表达的影响 结果如图 3 所示，正常对
照组大鼠肝脏组织中仅有少量 TIMP-1 表达，模型组
大鼠肝组织 TIMP-1 表达显著升高(P ＜ 0. 01)。与
模型组比较，各给药组大鼠肝组织 TIMP-1 表达显著
降低(P ＜ 0. 01)。
4 讨论
肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组
织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀
的病理过程，肝星状细胞目前被公认是细胞外基质
的主要来源，肝星状细胞的激活是肝纤维化形成初
始的中心环节〔7〕。研究忍冬木层孔菌醇提物对肝
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图 2 忍冬木层孔菌醇提物对肝纤维化大鼠肝星状细胞 MMP-1 表达的影响
A. 正常对照组 B. 模型组 C. 忍冬木层孔菌醇提物高剂量组 D. 忍冬木层孔菌醇提物低剂量组 E. 秋水仙碱组
注:与模型组比较，＊＊P ＜ 0. 01
图 3 忍冬木层孔菌醇提物对肝纤维化大鼠肝星状细胞 TIMP-1 表达的影响
A. 正常对照组 B. 模型组 C. 忍冬木层孔菌醇提物高剂量组 D. 忍冬木层孔菌醇提物低剂量组 E. 秋水仙碱组
注:与模型组比较，＊＊P ＜ 0. 01
纤维化大鼠中肝星状细胞活性的影响有助于阐释忍
冬木层孔菌抗肝纤维化的作用机制，为应用忍冬木
层孔菌防治肝纤维化提供依据。
肝星状细胞的活化与氧化应激、自由基损伤、脂
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质过氧化等密切相关，严重氧化应激是肝星状细胞
活化的主要原因之一〔8〕。超氧化物歧化酶对机体
的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，其活性
高低间接反映了机体清除氧自由基的能力〔9〕。机
体中的超氧阴离子自由基能攻击生物膜中的多不饱
和脂肪酸形成脂质过氧化物，如 MDA。因此测定
MDA的含量能间接反映机体细胞受自由基攻击的
严重程度〔10〕。机体防御体系抗氧化能力的强弱与
健康程度存在着密切联系，测定肝组织的 T-AOC 可
反映机体对抗过氧化损伤的总体能力〔11〕。忍冬木
层孔菌醇提物能增加超氧化物歧化酶活性，降低
MDA的含量并提升肝组织的 T-AOC，说明忍冬木层
孔菌醇提物有良好的体内抗氧化活性。
CCl4 可在肝组织富集，通过细胞色素氧化酶的
作用启动脂质过氧化，脂质过氧化物诱导 Kuffer 细
胞大量表达 TGF-β1
〔12〕。TGF-β1 激活肝星状细胞，
并通过肝星状细胞上Ⅰ型受体激活 Ｒas /ＲK 使前胶
原纤维大量表达，同时抑制 MMP-1 的表达，并刺激
TIMP-1 的表达，使细胞外基质的分泌降解失衡而加
速肝纤维化的进程〔13-15〕。α-SMA 的表达是肝星状
细胞活化的显著标志之一，测定 α-SMA 的表达可评
价忍冬木层孔菌醇提物对肝星状细胞活化的抑制作
用。灌胃忍冬木层孔菌醇提物的肝纤维化大鼠血清
中 TGF-β1 含量下降，肝组织中 α-SMA的表达减少，
MMP-1 表达量提高，而 TIMP-1 表达受到抑制，说明
忍冬木层孔菌醇提物能有效对抗 CCl4 引起的肝星
状细胞活化，延缓肝纤维化的进程。
忍冬木层孔菌作为药用“桑黄”的品种之一，对
CCl4 引起的肝纤维化大鼠肝星状细胞的活化有显
著的抑制作用，具有抗肝纤维化药用价值，其作用机
制可能与其含有大量酚类化合物，具有良好的体内
抗氧化活性有关。
参 考 文 献
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