全 文 ：桑黄菌原生质体的分离与再生研究
祝子坪 t o马海乐 tou3
ktq江苏大学 食品与生物工程学院 o江苏 镇江 utustv~
uq江苏省农产品生物加工与分离工程技术研究中心 o江苏 镇江 utustvl
≈摘要   目的 }研究桑黄菌原生质体分离与再生的条件 ∀方法 }研究以菌丝体为材料的不同酶解条件对桑黄菌
原生质体产量的影响及不同再生条件对桑黄菌原生质体再生率的影响 ∀结果 }在 t1xh溶壁酶 n s1xh崩溃酶的混合
酶系 !酶解温度为 vs ε !菌龄为 { §!蔗糖为酶解渗透压稳定剂 !酶解时间为 v «的条件下 o桑黄菌原生质体分离产量
较高 o但兼顾菌丝量和原生质体的再生 o较适宜的菌龄为 ts §o较适宜的酶解渗透压稳定剂是甘露醇 ∀另外用甘露醇
作为培养基渗透压稳定剂 !用加桑枝的马铃薯葡萄糖再生培养基进行再生 o桑黄菌原生质体再生率较高 ∀结论 }在综
合考虑桑黄菌原生质体的产量与再生的前提下 o获得了使桑黄菌原生质体产量与再生率均较高的试验条件 ∀
≈关键词   桑黄菌 ~原生质体 ~分离 ~再生
≈中图分类号   ≥ xyz ≈文献标识码   „ ≈文章编号   tsst2xvsukusszlut2uuvu2sw
≈收稿日期   ussy2ts2us
≈通讯作者   3 马海乐 oר¯}ksxttl{z{stzwo∞2°¤¬¯}°«¯ ƒ ∏­¶q
§¨∏q¦±
桑黄菌 Πηελλινυσ ιγνιαριυσkq ¬¨ ƒµql± ∏¨ 属¯于
多孔菌科针层孔菌属真菌 o子实体入药 o为我国传统
药用真菌 o中医用以治疗血崩 !血淋 !带下 !脾虚泄泻
等 ≈t  ∀近年来发现桑黄菌具有抗菌 !抗癌 !抗氧化
等药用价值 ≈uov  o因而引起各国学者的关注 ∀国内
外科研工作者对其在人工栽培 !生物学特性 !所含多
糖及其药理活性等方面开展了广泛而深入的研
究 ≈w  o但关于桑黄菌原生质体的分离和再生研究 o
迄今国内外尚未见报道 ∀微生物原生质体因去掉了
细胞壁的障碍而对外界刺激的敏感度显著提高 o所
以是诱变的良好材料 o还可用于细胞融合 !基因转移
等研究 ∀本研究的目的是通过对桑黄菌原生质体分
离和再生条件的研究 o使桑黄菌原生质体的产量和
再生率均达到较高水平 o为以后进行该菌菌种选育
和遗传研究奠定基础 ∀
1 材料与方法
1q1 材料 菌株购于中国普通微生物菌种保藏管
理中心 o编号为 x1|x∀
马铃薯葡萄糖液体培养基 k°⁄…培养基 l}马铃
薯 uss ªo沸水中煮 tx °¬±o{层纱布过滤 o取滤液 o
加入 us ª葡萄糖 o补加水至 t sss °o³‹自然 ∀
再生培养基 }≠ °⁄„再生培养基 }°⁄…培养基
加渗透压稳定剂 o使其浓度为 s1y °²t# pt o再加
th的琼脂粉 ∀  °⁄„ n桑植再生培养基 }马铃薯
uss ªo桑植 us ªo沸水中煮 tx °¬±后 {层纱布过滤 o
取滤液 o加入 us ª葡萄糖 o补加水至 t sss °o³‹
自然 o加渗透压稳定剂 o使其浓度为 s1y °²t# pt o
再加 th 的琼脂粉 ∀ ≈ 麦芽糖酵母粉再生培养基
k ≠Š再生培养基 l}麦芽糖 ts ªo葡萄糖 w ªo酵母
粉 w ªo溶于 s1y °²t# pt渗透压稳定剂中 o体积为
t sss °o加 th琼脂粉 o³‹自然 ∀ …纤维二糖再生
培养基 }纤维二糖 tx ªo蛋白胨 u ªo酵母粉 w ªo溶于
s1y °²¯# pt渗透压稳定剂中 o体积为 t sss °o加
th琼脂粉 o³‹自然 ∀
原生质体分离所需酶类 }溶壁酶购自广东微生
物研究所 ~崩溃酶购自 ƒ˜Ž„ „Šo≤‹∞ ~蜗牛酶
购自上海国药集团公司 ∀
渗透压稳定剂 }s1y °²t# pt甘露醇 os1y °²t
# pt硫酸镁 os1y °²t# pt葡萄糖 os1y °²t# pt
氯化钙 os1y °²t# pt氯化钾 os1y °²t# pt蔗糖 ∀
1q2 方法 桑黄菌原生质体的分离与再生 o按照以
下步骤进行 ≈x  }≠ 菌丝培养 }取 °⁄„斜面上生长旺
盛的菌丝 o接种于 °⁄…培养基中 oku{ ? s1xl ε 条
件静止培养 o每天早晚各摇动 t次 ∀  酶液配制 }称
取所需酶量 o溶解于 s1y °²t# pt渗透压稳定剂
中 o经 s1uu Λ°微孔滤膜过滤除菌后使用 ∀ ≈ 原生
质体分离 }将已培养好的菌丝用无菌水洗涤干净后
用灭菌滤纸吸去表面水分 o按每 vss °ª湿菌丝加 t
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°酶液量加入酶液 o在试验温度下以 tss µ# °¬±pt
转速水浴振荡酶解 o一段时间后吸取一些酶解液 o用
血球计数板计数并计算原生质体浓度 k个 r°lo以
原生质体浓度来表示原生质体产量 ∀ …原生质体精
制 }将酶解液用灭菌的 Šv砂芯漏斗过滤 ov wss µ#
°¬±pt离心 ts °¬±o去上清液 o用渗透压稳定剂洗涤
u次 o得到纯化后洁白的原生质体 o将原生质体用渗
透压稳定剂稀释成悬液 o用血球计数板计数 ∀   原
生质体的再生 }将精制的原生质体悬液调整浓度为
t ≅ tsx 个 r°o 吸 取 s1t ° 涂 布 平 板 o
ku{ ? s1xl ε 条件下再生培养 x §后菌落计数 ∀ ¡
再生率的计算 ≈y  }将制备的原生质体分 „o…两组进
行再生对比试验 o„组用渗透压稳定剂配制再生培
养基 !…组用水配制再生培养基进行再生 o每组设 v
次重复 o待菌落长出后分别计数 o取平均值 o按下述
方法计算再生率 ∀
再生率 kh l € k„组再生菌落数 p …组再生菌落数 l r
原生质体总数 ≅ tssh
2 结果与分析
2q1 酶系统对桑黄菌原生质体分离的影响 本试
验设计了 v种不同的酶组合 o研究不同的酶系统对
桑黄菌原生质体产量的影响 o酶解温度为 vs ε !渗
透压稳定剂为 s1y °²t# pt甘露醇 o用培养 ts §的
菌丝 o结果如图 t所示 ∀可以看出 o原生质体量在酶
解初期随着时间的延长而增加 o一段时间后达到峰
值 o酶解时间再延长原生质体量会下降 o这可能是因
为酶解一段时间后 o能酶解的菌丝基本酶解完 o而早
期释放的部分原生质体发生了溶解或破裂 ∀从设计
的 v个酶系统看 ouh溶壁酶 n s1xh崩溃酶的酶系
统原生质体产量在 v «时达到峰值 v1{{ ≅ tsy个 r
°o而另外 u酶系则在酶解 w «时达到峰值 o且产量
也较低 ∀可见该酶系统酶活性较高 o原生质体释放
较多 !较快 ∀
图 t 酶系统对桑黄菌原生质体分离的影响
2q2 酶浓度对桑黄菌原生质体分离的影响 从上
面的试验结果发现溶壁酶和崩溃酶的组合最适于桑
黄菌原生质体分离 o于是设计以 s1xh 崩溃酶作为
辅助酶 !以溶壁酶作为主体酶的酶系统 o并对溶壁酶
的适宜浓度进行了研究 ∀酶解温度为 vs ε !渗透压
稳定剂为 s1y °²t# pt甘露醇 o用培养 ts §的菌
丝 o结果如图 u所示 ∀可以看出 o酶解时间相同时酶
浓度不同原生质体的产量不同 o但各浓度组合产量
变化趋势基本一致 o都在酶解 v «原生质体产量达
到峰值 o且在前 v «以 t1xh溶壁酶 n s1xh崩溃酶
的酶系统产量最高 o可见该浓度组合酶活性较高 o较
有利于桑黄菌菌丝的酶解 ∀
图 u 酶浓度对桑黄菌原生质体分离的影响
2q3 酶解温度对桑黄菌原生质体分离的影响 酶
解温度不仅影响细胞壁的生理状态而且还影响酶的
活性 o不同真菌最适酶解温度也有所不同 o在上面选
定的酶系统和酶浓度下 o以 s1y °²t# pt甘露醇为
渗透压稳定剂 !用培养 ts §的菌丝 o研究了不同温
度对桑黄菌原生质体分离的影响 o结果如图 v所示 ∀
可知 o在 ux ε 时酶活性较低 o原生质体产量始终不
高 o随温度升高酶活性增强 ows ε 时酶解 u «后原生
质体产量开始下降 o可见温度太高酶易失活 o保持高
活性时间较短 ∀本试验在 vsovx ε 时酶的活性较
高 ovs ε 时酶解 v «原生质体产量最高 o为 v1xt ≅
tsy个 r°o因此取 vs ε 作为本试验的酶解温度 ∀
图 v 酶解温度对桑黄菌原生质体分离的影响
2q4 菌龄对桑黄菌原生质体分离的影响 菌丝的
生理状况是决定原生质体分离产量的主要因素 o而
菌丝的生理状况又受菌龄影响 ∀在上面试验选定的
酶解条件下 o以 s1y °²t# pt甘露醇为渗透压稳定
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剂 o研究不同菌龄对原生质体分离的影响 ∀结果如
图 w所示 ∀培养 { §的菌丝酶解 u «原生质体产量
即达到峰值 v1{y ≅ tsy个 r°o其余菌龄的菌丝酶解
v «产量才能达到峰值 o其中培养 ts §的菌丝产量
最高 o为 v1zx ≅ tsy个 r°∀可见菌龄短的菌丝酶解
时原生质体释放较快 !较多 o可能是因为菌龄短的菌
丝的壁成分相对简单 o壁也相对薄些 o较易被酶解 ∀
但菌龄过短 o又会造成菌丝量不足 o所以本试验采用
培养 ts §的菌丝 ∀为了验证推测是否正确 o在酶解
结束后取酶解液用显微镜观察 o发现随着菌龄增加
酶解液中残存的菌丝量增多 o残存的多是老化的骨
架菌丝 ∀
图 w 菌龄对桑黄菌原生质体分离的影响
2q5 渗透压稳定剂对桑黄菌原生质体分离的影响
渗透压稳定剂在菌丝与酶反应系统中起着媒介物
的作用 o对原生质体形成很重要 ∀在上面试验选定
的条件下 o研究了不同的渗透压稳定剂对桑黄菌原
生质体分离的影响 o结果如图 x所示 ∀酶解 v «原
生质体产量达到峰值时 o以蔗糖为渗透压稳定剂的
产量远高于用其他渗透压稳定剂的产量 o其次是以
硫酸镁和甘露醇为渗透压稳定剂的产量较高 ∀试验
还发现 o用不同渗透压稳定剂分离的原生质体大小
存在较大差异 o蔗糖为渗透压稳定剂所分离到的原
生质体较小 !颜色较浅 o以氯化钙为渗透压稳定剂所
分离到的原生质体较大 !颜色较深 ∀
图 x 渗透压稳定剂对桑黄菌原生质体分离的影响
2q6 酶解时间对桑黄菌原生质体再生的影响 将
酶解时间为 uou1xovov1x «条件下所分离的桑黄菌
原生质体稀释成相同浓度后再生 o研究酶解时间对
桑黄菌原生质体再生率的影响 ∀培养基为  ≠Š再
生培养基 o甘露醇做酶解及培养基渗透压稳定剂 ∀
试验所得再生率分别为 s1x{h os1xxh os1xth o
s1wxh ∀由结果可知 o随着酶解时间的延长原生质
体再生率下降 o这可能是因为酶解时间越短细胞壁
残存的越多 o细胞新形成的细胞壁物质被加到现有
壁的结构上 o而现有的壁结构能为新插入分子的精
细定位和空间构象提供信息 o使壁的再生变得容易 ∀
综合考虑原生质体的再生率与产量 o酶解 v «时两
者的乘积最高 o故本试验取酶解时间为 v «∀
2q7 酶解渗透压稳定剂对桑黄菌原生质体再生的
影响 在原生质体分离的试验中 o发现在不同的渗
透压稳定剂中分离到的原生质体大小存在很大差
异 o因此推测不同的渗透压稳定剂分离到的原生质
体的再生能力可能存在差异 ∀本试验选用以蔗糖 !
硫酸镁 !甘露醇 !氯化钙为渗透压稳定剂分离的原生
质体做再生试验 o培养基为  ≠Š再生培养基 o甘露
醇做培养基渗透压稳定剂 ∀试验所得再生率分别为
s1u{h os1tzh os1w|h os1suh ∀从试验结果可知 o
以甘露醇为渗透压稳定剂分离到的原生质体的再生
率远高于另外 v种渗透压稳定剂中所得到的原生质
体的再生率 o可见在甘露醇中分离的原生质体质量
较好 o试验也发现在甘露醇中分离的原生质体体积
中等 !大小较均匀一致 ∀在其他分离渗透压稳定剂
中分离的原生质体再生率较低 o可能是因为部分原
生质体形成时细胞核数量发生了改变而失去了再生
能力 ∀
2q8 再生渗透压稳定剂对桑黄菌原生质体再生的
影响 同一种真菌的原生质体再生时 o使用不同种
类的渗透压稳定剂 o再生率有明显的差别 ≈y  ∀本试
验研究了再生渗透压稳定剂为蔗糖 !葡萄糖 !甘露
醇 !氯化钾时对桑黄菌原生质体再生率的影响 o所用
培养基为  ≠Š再生培养基 o试验所得再生率分别
为 s1vzh os1t{h os1xth os∀由结果可知 o培养基
中渗透压稳定剂不同时 o桑黄菌原生质体的再生率
存在很大差异 o以甘露醇为渗透压稳定剂的培养基
再生率最高 o其次是以蔗糖为渗透压稳定剂的培养
基 o而以氯化钾为渗透压稳定剂时原生质体则不能
再生 o其原因还有待研究 o可见不同的培养基渗透压
稳定剂对原生质体再生率有重要的影响 ∀另外在试
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验中还发现以氯化钙和硫酸镁为渗透压稳定剂时 o
培养基很难凝固 o即使凝固后仍有较高的流动性 o妨
碍再生试验的进行 o故在研究中 o没有采用氯化钙和
硫酸镁作为再生培养基的渗透压稳定剂 ∀
2q9 再生培养基对桑黄菌原生质体再生的影响
原生质体再生是一个复杂的生理过程 o营养成分对
其有较大影响 o在不同的再生培养基中再生 o再生率
相差很大 ∀本试验研究了 °⁄„o ≠Šo纤维二糖 o
°⁄„ n桑枝再生培养基对桑黄菌原生质体再生率的
影响 o结果所得再生率分别为 s1zyh os1xth o
s1xzh os1{xh ∀从试验结果可以看出 o在 w种食用
菌再生培养基中 o加了桑枝的 °⁄„再生培养基较适
于桑黄菌原生质体再生 o在平板上长出的菌落数较
多 o最差的是  ≠Š再生培养基 o可见加了桑枝的
°⁄„再生培养基营养成分较适合桑黄菌原生质体
再生 ∀
3 结论
酶组成 !酶浓度 !酶解温度 !菌龄影响桑黄菌原
生质体的分离 o本试验适宜的酶解条件是 }t1xh溶
壁酶 n s1xh 崩溃酶的组合酶系 !vs ε 的酶解温度
和 ts §菌龄的菌丝 ∀用不同渗透压稳定剂分离到
的桑黄菌原生质体不但产量不同而且质量也存在很
大差异 o兼顾高产与优质即原生质体的产量与再生
率都较高 o宜采用甘露醇为分离渗透压稳定剂 ∀酶
解时间也影响桑黄菌原生质体的产量和再生率 o在
选定的酶解条件下 o酶解 v «时产量和再生率的乘
积最高 o所以本实验最佳酶解时间是 v «∀再生培养
基所用渗透压稳定剂对桑黄菌原生质体再生有重要
影响 o本试验适宜的再生培养基渗透压稳定剂是甘
露醇 ∀再生培养基显著影响桑黄菌原生质体的再
生 o本试验用 °⁄„ n桑枝的再生培养基再生效果
较好 ∀
≈参考文献  
≈t  刘 波 q中国药用真菌 ≈  q太原 }山西人民出版社 ot|zw}ztq
≈u  ²±ª2 ²²± ‹∏µo ≤«∏±2‹²≠¤±ªo ≥ ∏¨±ª2‹²‹¤2±o ·¨¤¯q „±·¬¥¤¦2
·¨µ¬¤¯ ©¨©¨¦·²©Πηελλινυσλιντευ󤪤¬±¶·° ·¨«¬¦¬¯¯¬±2µ¨¶¬¶·¤±·Σταπηψ2
λοχοχχυσαυρευσ≈ q ƒ¬·²·¨µ¤³¬¤o usswozxkyl}ysvq
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¤³²¯¼³²µ¨ °¤¦µ²©∏±ª∏¶o Πηελλινυσ ριµ οσυσ k… µ¨®l °¬¯¤·≈  q 
∞·«±²³«¤µ°¤¦²¯o ussvo{wkul}txzq
≈w  刘春辉 o陈体强 o林跃鑫 q药用真菌桑黄的研究进展 ≈ q菌物
研究 ousswoukul}xvq
≈x  李 刚 o李宝健 q灵芝原生质体分离与再生研究 ≈  q菌物系
统 ot|||ot{ktl}z|q
≈y  张志光 q真菌原生质体技术 ≈  q长沙 }湖南科学技术出版社 o
ussv}tuuq
Σεπαρατιον ανδ ρεγενερατιον οφ προτοπλαστ φροµ Πηελλινυσ ιγνιαριυσ
‹˜ ¬2³¬±ªt o  „ ‹¤¬2¯ t¨ou
(t. ΣχηοολοφΦοοδ ανδ ΒιολογιχαλΕνγινεερινγ , ϑιανγσυ Υνιϖερσιτψ, Ζηενϕιανγ utustv, Χηινα;
u. ϑιανγσυ ΠροϖινχιαλΡεσεαρχη Χεντεροφ ΑγριχυλτυραλΠροδυχτσΒιο2προχεσσινγ ανδ Βιο2σεπαρατιον Ενγινεερινγ ,
Ζηενϕιανγ utustv, Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ¶·∏§¼ ·«¨ ¦²±§¬·¬²±¶²± ¶¨³¤µ¤·¬²± ¤±§µ¨ª¨ ± µ¨¤·¬²± ²©³µ²·²³¯¤¶·©µ²° Πηελλινυσ ιγνιαριυσq Μετηοδ :
׫¨ ©¨©¨¦·¶²© ±¨½¼°²¯¼¶¬¶¦²±§¬·¬²±¶²©Π1ιγνιαριυσ°¼¦¨ ¬¯¤²± ¼¬¨ §¯²©³µ²·²³¯¤¶·¤±§¦∏¯·∏µ¬±ª¦²±§¬·²±¶²± µ¨ª¨ ± µ¨¤·¬²± µ¤·¬²²©³µ²·²2
³¯¤¶·º µ¨¨ ¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨§q Ρ εσυλτ: • «¨ ± ·«¨ { §¤¼¶2²¯§°¼¦¨ ¬¯¤º¤¶«¼§µ²¯¼¶¨§¥¼ t1xh ²© ¼¯º¤¯ ½¯¼°¨¤§§¬±ª·²§µ¬¶¨ ¤¯¶¨ ²©s1xh ¤±§
¤·vs ε ©²µv «¤±§ ±¨½¼°²¯¼¶¬¶º¤¶¶·¤¥¯¬½¨ §¥¼ ¶∏¦µ²¶¨ ¤¶¤¶·¤¥¯¬¶«¨ µ²©²¶°²·¬¦³µ¨¶¶∏µ¨o «¬ª«¨ µ¼¬¨ §¯²©Π1ιγνιαριυσ³µ²·²³¯¤¶·º¤¶
²¥·¤¬± §¨q Œ©ts §¤¼¶2²¯§°¼¦¨ ¬¯¤º¤¶∏¶¨§¤¶µ¤º °¤·¨µ¬¤¯ ²© ±¨½¼°²¯¼¶¬¶¤±§°¤±±·²¯ º¤¶¶¨¯¨ ¦·¨§¤¶¶·¤¥¯¬¶«¨ µ²©²¶°²·¬¦³µ¨¶¶∏µ¨ ²©
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¬±ª«¬ª«¨ µ¼¬¨ §¯q ƒ²µ·«¨ µ¨ª¨ ± µ¨¤·¬²± ³µ²¦¨¶¶¬±ªo ¬·º¤¶¥¨ ± ©¨¬¦¬¤¯ ©²µ·«¨ µ¨ª¨ ± µ¨¤·¬²± ²©Π1 ιγνιαριυσ³µ²·²³¯¤¶··«¤·°⁄„ ³¯∏¶¬±ª°∏¯2
¥¨ µµ¼ µ¤°∏¯∏¶º¤¶∏¶¨§¤¶·«¨ ¦∏¯·∏µ¨ ° §¨¬∏° ²©µ¨ª¨ ± µ¨¤·¬²± ¤±§°¤±±·²¯ º¤¶¶¨¯¨ ¦·¨§¤¶·«¨ ²¶°²·¬¦³µ¨¶¶∏µ¨ ¶·¤¥¯¬¶«¨ µ²©µ¨ª¨ ± µ¨¤2
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[ Κεψ ωορδσ] Πηελλινυσ ιγνιαριυσ~ ³µ²·²³¯¤¶·~ ¶¨³¤µ¤·¬²±~ µ¨ª¨ ± µ¨¤·¬²±
≈责任编辑 张宁宁  
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