全 文 ：肝星状细胞 （hepatic stellate cells，HSC）是肝
脏病理情况下细胞外基质（ECM）沉积的主要来源
［1］。 现代药理研究证明，筋骨草具有抑瘤、抗炎等
活性，主要有效成分为黄酮类化合物 ［2］。 我们通过
实验观察筋骨草总黄酮对 HSC 细胞的作用，探讨
其抗肝纤维化的作用机制。
1 材料及方法
1.1 材料 HSC 细胞购于中国医科大学肿瘤研
究所。清洁级 SD 大鼠，雄性，福建中医药大学实验
动物中心提供， 体质量 （200±20）g， 合格证号：
2007000509960。 动物房温度控制在 18℃～26℃，
光暗周期 12 h。Ⅰ型胶原酶联免疫检测试剂盒（北
京博奥森生物公司）；胰蛋白酶、琼脂糖（美国 Sig-
ma 公司）；逆转录试剂盒、Taq 酶（美国 Thermo 公
司）；胎牛血清、RPMI1640 培养基（美国 Gibco 公
司）； 大鼠 MMP-13 上游引物：5-GCT AAC CCT
CCA TAA TGT CAT ACC C-3，下游引物：5-TGT
GAC CCA GCC CAT TCC CT-3；大鼠 TIMP-1 上
游引物：5-GAT GGC TGA ACA GGG AAA CAC-
3， 下游引物 ：5-GCA TCC TCT TGT TAT CAT
TG-3； 内参 （GAPDH） 上游引物：5-AGG GGC
CAT CCA CAG TCT TC-3， 下游引物 ：5 -CAG
TGC CAG CCT CGT CTC AT-3， 由上海生工生物
工程有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 含药血清制备 雄性 SD 大鼠 12 只，随机
分为空白对照组和含药血清组，灌胃给药，分别给
予生理盐水、筋骨草醇提液（相当于筋骨草生药量
12 g ／ kg），每日 2 次，连续 3 d。 末次给药后 2 h，腹
主动脉取血，3 000 r ／min 离心 20 min， 取血清 ，
56℃灭活 30 min，0.22 μm 滤膜过滤除菌，－20℃保
存备用。
1.2.2 细胞培养 HSC 细胞，用 10%胎牛血清的
RPIM-1640 培养液， 置于 37℃、5%的 CO2 培养箱
中，传至 3、4 代，细胞生长活跃，即可用于实验。
1.2.3 HSC 增殖测定 用 MTT 比色法将浓度
1×108 ／ L 的 HSC 悬液接种于 96 孔板， 每孔 100
μL，每组设 6 个复孔，培养 24 h。 细胞分为 4 组：
空白对照组、5%、10%、20%含药血清组，加入各含
药血清干预，孵育 24、48 h 后，每孔加入 5 g ／ L 的
MTT 液 20 μL，继续孵育 4 h，加入 200 μL 二甲基
亚砜，稍振荡，用酶标仪在波长 570 nm 处测定吸
光度值。
HSC 增殖的抑制率＝（1－药物组吸光度值 ／对照
组吸光度值）×100%
1.2.4 Ⅰ型胶原浓度检测 用 ElISA 法，取 1.2.3
项 4 组上清液，按试剂盒说明书操作 ，在 450 nm
波长处测定各孔吸光度值。 根据样品的吸光度值
计算回归方程，得样品的Ⅰ型胶原浓度。
赖文芳，吴符火，南丽红
筋骨草总黄酮对大鼠肝星状细胞 MMP－13和 TIMP-1表达的影响
（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）
摘要： 目的 观察筋骨草总黄酮对大鼠肝星状细胞（HSC）增殖、MMP-13、TIMP-1 表达的影
响。 方法 用筋骨草总黄酮含药血清对 HSC 细胞进行干预，分为空白对照组、5%、10%、20%3 个含
药血清组，用 MTT 检测 HSC 细胞增殖，ELISA 检测Ⅰ型胶原浓度，RT-PCR 检测 MMP-13、TIMP-
1 mRNA 的表达。 结果 与空白对照组比较，含药血清 3 个剂量组对 HSC 细胞的抑制作用增强，I
型胶原浓度降低，促进 MMP-13、抑制 TIMP-1 mRNA 表达，随着药物浓度增加，MMP-13 ／ TIMP-1
比值增大，与 I 型胶原呈负相关。 结论 筋骨草总黄酮抗肝纤维化的机制是抑制 HSC 增殖，促进
MMP-13、抑制 TIMP-1mRNA 表达，促进Ⅰ型胶原降解，抑制细胞外基质积聚。
关键词：肝纤维化；筋骨草总黄酮；肝星状细胞；大鼠模型
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1004-5627（2014）03-0022-03
收稿日期：2013-12-24
基金项目：陈可冀中西医结合发展基金资助课题（CKJ2007026）
作者简介：赖文芳（1985—），女，研究实习员，主要从事药理学研究。
通讯作者：吴符火（1952—），男，教授。 E-mail：wufuhuo@163.com
福建中医药大学学报 2014 年 6 月 第 24 卷 第 3 期
Journal of Fujian University of TCM June 2014，24 （3）22
DOI:10.13261/j.cnki.jfutcm.002933
1.2.5 MMP-13、TIMP-1 mRNA 检测 用 RT -
PCR 法，取处于对数期的 HSC，分为 4 组，分别加
入各含药血清干预，培养 24 h，按总 RNA 抽提试
剂盒说明书，提取各组细胞总 RNA，用蛋白核酸分
析仪检测总 RNA纯度并计算浓度。 取 0.5 μL RNA
作为反转录模板行 RT 反应，随后进行 PCR 扩增。
GAPDH 为内参，94℃预变性 2 min，35 个循环，循
环参数：94℃变性 40 s，57℃退火 40 s （MMP-13）
及 53℃退火 40 s（TIMP-1），72℃延伸 40 s（MMP-
13）及 72℃延伸 35 s，最后 72℃ 1 min，终止反应。
PCR 产物经 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定 ，279 bp
（MMP-13）、446 bp（TIMP-1）处为目的基因片段。
电泳结果以 Quantity One 图像分析系统进行条带
吸光度分析，与内参 GAPDHmRNA 的比值作为目
的基因 mRNA 的相对水平。
1.2.6 统计学处理 数据用 x±s 表示 ， 用 SPSS
18.0 统计学软件进行分析， 组间比较用单因素方
差分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。
2 结 果
实验结果 见图 1、表 1、表 2。
表 1 筋骨草总黄酮抑制 HSC 细胞的增殖（x±s）
组 别
空 白 对 照 组
5%含药血清组
10%含药血清组
20%含药血清组
大鼠 ／只
6
6
6
6
24 h
0
13.771）
15.251）
35.971）
48 h
0
25.531）
34.111）
53.091）
抑制率 ／%
注：与空白对照组比较，1） P＜0.05。
表 2 筋骨草总黄酮对 HSC 细胞Ⅰ型胶原、MMP-13、TIMP-1 的影响（x±s）
组 别
空 白 对 照 组
5%含药血清组
10%含药血清组
20%含药血清组
大鼠 ／只
6
6
6
6
Ⅰ型胶原 ／ （pg ／mL）
119.32±4.31
107.23±1.851）
103.42±2.191）
100.51±1.411）
MMP-13 ／GAPDH
0.483±0.058
0.765±0.0721）
0.795±0.0681）
0.876±0.0571）
注：与空白对照组比较，1） P＜0.05。
TIMP-1 ／GAPDH
1.071±0.051
0.890±0.0561）
0.873±0.0421）
0.828±0.0531）
MMP-13 ／ TIMP-1
0.451
0.863
0.911
1.058
3 讨 论
HSC 在肝纤维化的发病过程中起着重要作
用，抑制 HSC 增殖与促进 HSC 凋亡，有利于肝纤
维化的逆转。 HSC 合成 ECM，I 型胶原是 ECM 的
主要成分，研究 ［3］发现 HSC 活化时，I 型胶原 mR-
NA 表达为静止状态的 60～70 倍。 降解 I 型胶原
的是间质胶原酶， 在人类为 MMP-1， 在大鼠是
MMP-13，MMP-13 主要受 TIMP-1 调控。 我们实
验用不同浓度的筋骨草含药血清干预 HSC， 发现
MMP-13 mRNA 表达明显上调，TIMP-1 mRNA 明
显下调， 随着浓度的增加，I 型胶原则显著降低，
MMP-13 ／ TIMP-1 比值增大， 与 I 型胶原呈负相
关。结果表明，筋骨草抗肝纤维化的作用机制是抑
制 HSC 增殖，促进 MMP-13、抑制 TIMP-1 mRNA
表达，促进Ⅰ型胶原降解，抑制细胞外基质积聚。
参考文献：
［1］ 梁增文，张国，王天才 ． 大鼠肝纤维化中细胞外信号调节激
酶的作用［J］． 世界华人消化杂志，2003，11（6）：730-732．
［2］ 马志平， 黄榕． 筋骨草有效部位黄酮类粗品的保肝试验［J］．
海峡药学，2002，14（5）：40-41．
［3］ 陈益平， 卢朝升． 肝素对大鼠肝星状细胞中转化生长因子 β1
和 I 型胶原的影响 ［J］． 世界华人消化杂志 ，2007，34（15）：
3629-3630．
MMP-13
TIMP-1
GAPDH
注：1. 空白对照组；2. 5%含药血清组；
3. 10%含药血清组；4. 20%含药血清组。
图 1 不同给药组 MMP-13、TIMP-1 PCR 凝胶电泳结果
1 2 3 4
第 3期 赖文芳等：筋骨草总黄酮对大鼠肝星状细胞 MMP－13 和 TIMP-1 表达的影响 23
Effect of Total Flavonoids from Ajuga Decumbens on Expressions of MMP-13 and
TIMP-1 in Hepatic Stellate Cells of Rats
LAI Wenfang, WU Fuhuo, NAN Lihong
(College of Pharmacy, FUTCM, Fuzhou, Fujian 350122, China)
ABSTRACT: Objective To observe the effect of total flavonoids from ajuga decumbens (TFAD) on
the proliferation of rat hepatic stellate cells (HSC), and the expressions of matric metalloproteinase-13 (MMP-
13) and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1). Methods The HSC were treated with TFAD
drug-containing serum, then the cells were divided into blank control group, 5% TFAD drug-containing serum
group, 10% TFAD drug-containing serum group and 20% TFAD drug-containing serum group. The HSC pro-
liferation was detected by MMT assay, the content of collagen-I was detected by ELISA assay, and the expres-
sions of MMP-13 and TIMP-1 mRNA were detected by RT-PCR. Results Compared with blank control
group, the HSC in TFAD drug-containing serum groups were inhibited significantly, the content of collagen-I
was decreased respectively, the expression of MMP-13 mRNA was increased respectively, and TIMP-1 mRNA
was decreased respectively. With the increase of drug concentration, the MMP -13 ／ TIMP -1 ratio was in-
creased, which was significantly negative correlation with collagen-I. Conclusion TFAD has the effect of
anti-hepatic fibrosis, and the possible mechanism may be related with inhibiting HSC proliferation, promoting
MMP-13 mRNA expression, inhibiting TIMP-1 mRNA expression, then promoting degradation of collagen-I,
and decreasing extracellular matrix.
KEY WORDS: hepatic fibrosis; total flavonoids from ajuga decumbens; hepatic stellate cells; rat model
小胶质细胞被认为是中枢神经系统的固有免
疫细胞， 在正常情况下处于静止状态的小胶质细
胞，受到外界刺激后会释放大量的细胞因子，起到
清除脑内异物及调节脑内环境平衡的作用。 但过
度的激活可释放细胞因子，会引起神经元的损伤。
研究 ［1-2］表明，如果降低小胶质细胞的活化水平，
可以降低神经退行性病变的严重程度。 瓜蒌桂枝
汤出自《金匮要略》，其组成是瓜蒌根（天花粉）、桂
枝、白芍、甘草、生姜、大枣，具有解肌祛邪、舒缓筋
脉的功效。临床治疗脑卒中后痉挛有显著疗效，但
瓜蒌桂枝汤对 PC12细胞的保护作用
胡海霞，李钻芳，林如辉，朱晓勤，陈立典
（福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122）
摘要： 目的 研究瓜蒌桂枝汤对 PC12 细胞生长的保护作用。 方法 用脂多糖（LPS）激活小
胶质细胞制备炎症细胞模型，用获得的条件培养基对 PC12 细胞进行干预，用 MTT 法检测细胞生长
活力， 用细胞高内涵细胞分析系统对 PC12 细胞进行形态学观察。 结果 LPS 激活小胶质细胞后
得到的条件培养基能明显抑制 PC12 细胞生长及形态发生明显改变， 瓜蒌桂枝汤干预后，PC12 生长
活力良好，形态学改变恢复。 结论 瓜蒌桂枝汤对 LPS 活化小胶质细胞条件培养基引起的神经细
胞损伤具有保护作用。
关键词： 瓜蒌桂枝汤；小胶质细胞；条件培养基；PC12 细胞
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1004-5627（2014）03-0024-03
收稿日期：2013-12-24
基金项目：福建中医药大学校管课题（X2012010）
作者简介：胡海霞（1981—），女，医学硕士，助理研究员，主要从事中西医结合基础研究。
通讯作者：陈立典（1963—），男，教授。 E-mail： cld@fjtcm.edu.com
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福建中医药大学学报 2014 年 6 月 第 24 卷 第 3 期
Journal of Fujian University of TCM June 2014，24 （3）24
DOI:10.13261/j.cnki.jfutcm.002934