全 文 ：中国农学通报 2011,27(24):302-306
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
随着魔芋种植面积逐年攀升，魔芋软腐病越来越
严重[1]。尽管国内外学者对魔芋软腐病防治做了许多
研究工作，然而软腐病至今依然是危害魔芋产业的第
一大病害，在生产上尚未找到防治魔芋软腐病的特效
药[2]。长期使用单一农药不但引发病菌耐药性，而且
引起环境污染等问题日益严峻，许多科技工作者尝试
采用生物防治。周盈等[3]从魔芋的内生菌中筛选到一
株能抑制魔芋软腐病病原菌生长、产芽孢的杆状细
菌。马琼从发病魔芋植株中分离筛选到拮抗菌株
BJ-1，该菌具广谱抗菌活性，对软腐病病原菌有较强的
抗菌作用[4]。云南大学姬广海等[5]采用解淀粉芽孢杆
菌 C3及其发酵液制成针对魔芋软腐病的生物制剂
（ZL200510048755），取得了约50%的防效并有一定的
增产作用。韩冬梅等 [6]的研究表明，枯草芽孢杆菌
BSn5所产生的APn5蛋白对魔芋软腐病菌具有较好的
抑菌活性。
国内对魔芋软腐病生物防治方面虽然进行了大量
研究，但目前推广应用的并不多。这主要是因为魔芋
软腐病为土传病害[7]。已有研究表明，利用植株上附
基金项目：湖北省重点自然科学基金“魔芋软腐病生防菌分离、鉴定及生防机理”（2010CBB01001）。
第一作者简介：吴金平，女，1978年出生，安徽合肥人，助理研究员，博士，研究方向：植物病理学；学术成就：作者从2002年起，一直从事魔芋快繁体系
和魔芋软腐病的研究。主持或参与国家科技支撑计划、国家自然基金、湖北省重大科技攻关项目、自然科学资金项目等8个科研项目的研究。第一
作者发表相关论文20余篇，其中3篇为SCI收录；2项专利为第一申请者，另2项为第二申请者；参与编写科普专著两部；获得湖北省科技进步三等奖
两项。通信地址：430064湖北省农业科学院经济作物研究所蔬菜研究室，E-mail：wjp9188@yahoo.com.cn。
收稿日期：2011-06-07，修回日期：2011-07-26。
一株魔芋软腐病拮抗菌的分离鉴定
及其活性物质的研究
吴金平 1，刘晓燕 1，张静柏 2
（1湖北省农业科学院，武汉 430064；2华中农业大学植物科技学院，武汉 430070）
摘 要：在分离魔芋软腐病病原菌的过程中，获得一株对魔芋软腐病病原菌具有较强抑制作用的菌株
Wh2。通过形态观察、生理生化实验、16S rDNA同源性序列分析，HPLC-MS分析，鉴定该菌为解淀粉芽
孢杆菌，该菌在18.92 min时的洗脱液具有较明显的抑菌效果，此时的紫外吸收峰波长为229.5 nm，拮抗
物质分子量为425 Da。
关键词：解淀粉芽孢杆菌；鉴定；活性物质
中图分类号：S432.1 文献标志码：A 论文编号：2011-1671
Isolation and Identification of Antagonistic Bacterium for Soft Rot in Amorphophallus konjac
and the Study on Its Bioactive Substances
Wu Jinping1, Liu Xiaoyan1,Zhang Jingbai2
(1Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064;
2College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)
Abstract: In the process of separating the soft rot pathogen in konjac, Wh2 was got which strongly inhibited
the soft rot pathogen. According to the morphology characteristics, physiology and biochemistry tests, the
comparison of 16S rDNA sequence, and HPLC-MS analysis, the Wh2 was similar Bacillus
amyloliquefaciens. MS showed the active fraction was at the retention time of 18.92 min and the
corresponding ultraviolet absorption peak wavelength was 229.5 nm. The molecular mass was 425 Da.
Key words: Bacillus amyloliquefaciens; identification; bioactive substances
吴金平等：一株魔芋软腐病拮抗菌的分离鉴定及其活性物质的研究
生的或根际土壤中的拮抗细菌或其代谢产物调控根围
有害微生物的平衡以达到控病保产的目的，是土传病
害防治的重要途径[8-9]，筛选高效和活性稳定的拮抗菌
株是保证生物防治获得成功的先决条件[10]。在分离魔
芋软腐病病原菌的过程中，发现有时表现软腐症状的
魔芋组织分离不到软腐病病原菌，将非软腐病病原菌
纯化保存，从中筛选到一株抗魔芋软腐病的菌株，经鉴
定该菌为解淀粉芽孢杆菌。该菌株营养要求较简单，
环境适应能力强，有望用作生物农药或生物肥料具有
很高的开发应用前景。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品 病原菌胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚
种（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora）
(GenBank登录号为FJ463863)为武汉大学生命科学院
实验室分离、保存。
1.1.2 引物 P1: 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，
P2: 5-CGGCTACCTTGTTACGA CTTC-3’参 考
Weisburg等[7]由上海奥科生物技术有限责任公司合成。
1.1.3 培养基 分离筛选用培养基为营养肉汤培养
基 [8]，其成分为：每升水含牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，
NaC1 5 g，pH 7.0~7.2。
1.1.4 主要试剂和仪器 DNA凝胶回收试剂盒（广州东
盛生物科技有限公司）、PCR反应用的各种试剂均购
自上海鼎国公司；蛋白胨、牛肉膏、NaCl、葡萄糖等购
自上海生物工程技术服务有限公司。光学显微镜：
Olympus BH-2 microscope。
1.2 拮抗菌的分离和筛选
在采用组织分离法[8]分离软腐病病原菌过程中，将
不是软腐病病原菌的细菌纯化、保存。采用点接法进
行拮抗菌的初筛：将营养肉汤培养基过夜培养的浓度
为 1×108 CFU/mL的魔芋软腐病病原菌菌悬液 0.1 mL
涂布于NA培养基平板上，然后在每个平板上用无菌
牙签均匀接种4个参试菌株，每个处理3次重复，30℃
恒温培养箱中培养24 h后，将有抑菌圈的菌株再采用
管碟法进行拮抗菌的复筛：将初筛的拮抗菌株在营养
肉汤培养基中200 r/min，30℃培养24 h，发酵液8000 g
离心 20 min，上清液用 0.22 μm微孔滤膜过滤，经营养
琼脂培养基培养无菌落生成，视为无菌滤液。取过夜培
养的魔芋软腐病病原菌菌悬液（浓度为1×108 CFU/mL）
0.1 mL均匀涂于营养琼脂培养基上，用灭菌打孔器在
平板上打孔，然后在每个孔中加入0.1 mL的供试拮抗
菌无菌滤液，每个处理3个重复，30℃恒温培养箱中培
养24 h后测定其抑菌圈直径。
1.3 拮抗菌菌株鉴定
1.3.1 形态观察与染色 在光学显微镜下观察个体形态
并测量菌体大小；参照文献[8]进行Gram染色、芽孢染
色。
1.3.2 拮抗菌的16S rDNA PCR扩增和序列测定 抽提
拮抗菌总DNA，利用16S rDNA细菌通用引物P1和P2
进行PCR扩增。扩增产物回收，送北京六合华大公司
进行PCR产物的直接测序，测序为双向引物测序，测序
用引物为P1和P2。将测得的基因序列通过Blast程序
与GenBank中核酸数据库进行对比分析(http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/blast)，用Clustalx 1.8软件对相似的序
列进行多重匹配排列分析，由MEGA5.03软件中的邻
接法(Neighbor-Joining)进行系统发育树构建和聚类分
析，确定拮抗菌株在微生物系统发育学上的地位。
1.4 拮抗菌活性物质的分离
1.4.1 菌株的发酵 接种单菌落活化过夜，然后转接于
500 mL三角瓶中进行摇瓶发酵，200 r/min在30℃条件
下培养 24 h。发酵后的菌液在-20℃冷冻干燥机中进
行冷冻干燥12~24 h，直至水分消失。
1.4.2 活性物质的提纯 冻干粉用水:甲醇=1:1（10 mL)
浸湿，乙酸乙酯（100 mL）提取，干燥后的物质利用乙
酸乙酯进行提纯，室温提纯 1 h，然后取上清置于旋转
蒸发仪中进行旋转蒸发5~6 h。
1.4.3 高效液相色谱分离 蒸发后的干物质用10 mL甲
醇溶解，取 1 mL进行高效液相色谱半制备仪分离，每
分钟的流出物收集在1个试管中，共收集36份。
1.4.4 质谱鉴定 通过高效液相色谱联合质谱（Waters
2695 高效液相色谱系统，美国 Micromass Quattro
micro质谱仪(电喷雾离子源(ESI))，MasslynxV4.1液-
质联用分析软件）查看紫外线峰值和正负离子大小，采
用 sunfireTM C18 prep 10 Ixm，10 mm×250 mm液相
柱；190~500 nm的紫外扫描范围；水梯度洗脱，流动相
为乙腈；质谱条件为ES+和ES-相同均为毛细管电压
3.5 kV，源温度100℃，锥孔电压35 V，Extractor 2 V，脱
溶剂室温度 30℃，脱溶剂气体流速 500 L/h，锥孔气体
流速 50 L/h；扫描时间为 0~36 min；扫描范围为 100~
1400 Da。
1.4.5 生物活性测定 通过 LC-MS分离出来的 36组
份，用干净空气吹干通过无菌水（200 μm）溶解，采用
管碟法进行活性成分测定。
2 结果与分析
2.1 拮抗菌筛选结果
在收集分离魔芋软腐病病原菌的过程中，将非软
腐病病原菌的菌株分离、纯化，保存。以魔芋软腐病病
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a.菌株光学显微镜下的形态 b.菌株在LB培养基上的形态
图1 菌株Wh2形态
原菌为阳性对照，通过点接法和管碟法结合筛选到 1
株拮抗效果比较明显的菌株，命名为Wh2。
2.2 拮抗菌形态特征及生理生化分析
Gram染色阳性，菌体呈杆状，染色均匀，具运动
性，兼性厌氧，孔雀绿染液染色后在油镜下观察形成
芽孢，游离芽孢表面着色弱（图 1a）。在LB培养基上
生长良好，菌落白色，表面不规则，边缘波状（图 1b）。
2.3 16S rDNA序列测定分析结果
用 16S rDNA序列的通用引物进行扩增，DNA扩
增后进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察条带清晰，
凝胶回收等程序获得该菌片段为1453 bp，将该菌株的
16S rDNA序列在网站 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中
进行Blast比对分析，结果表明：该菌株与解淀粉芽孢
杆菌成员的同源性较高，其序列相似性均在99%。用
CLUSTALX 1.8软件对相似的序列进行多序列比对，
MEGA4.0软件采用邻接法进行系统发育树构建和聚
类分析（图 2）。从图中可以看出，拮抗菌株与解淀粉
芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）聚为一群。
图2 以16S rDNA序列为基础的Wh 2菌株系统发育树
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吴金平等：一株魔芋软腐病拮抗菌的分离鉴定及其活性物质的研究
依据16S rDNA分类标准，一般认为16S rDNA序列同
源性大于97%，可认为属于同一个种，结合上述形态和
部分生理生化特征，可初步判定拮抗菌菌株Wh2
（Genbank登录号：JF827346）属于解淀粉芽孢杆菌。
2.4 活性物质的分离
整个拮抗菌发酵液梯度洗脱，收集 36 min的样
品，每分钟为一个样，将样品吹干进行生物活性测定，2
个（19 min，20 min）时间点拮抗菌株发酵液的提取物
具有抑制魔芋软腐病病原菌的活性组分（图3）。其中
19 min的组分抑菌效果较明显，20 min的次之，但都有
用于生物农药开发的潜力。整个拮抗菌发酵液液质联
用分析结果如图4。19 min液质联用分析结果如图5，
其对应的紫外吸收峰波长为 229.5 nm，其中[M-H+]为
424.6 Da，[M+H+]为426.5 Da，因此推定该物质分子量
为425 Da。
3 结论与讨论
芽孢杆菌产生的拮抗物质主要有抗生素、抗菌蛋
白及挥发性抗菌物质等。抗生素主要分为 2类，分别
是核糖体合成的小分子细菌素和非核糖体合成的肽类
物质及其他一些抗菌活性物质，其中脂肽抗生素是一
个较大的类群。已经应用推广的脂肽抗生素生产菌株
很多，田间应用生物防效良好，如日本东京研究所研发
出的商品菌B.subtilis RBl4和美国Taegro公司研发商
品菌B.amgloliquefaciens FZB42。因脂肽抗生素对植
物病害真菌、细菌、病毒、昆虫等都具有生物活性[9-10]，
抑制或杀死病菌机制形式多样。最近研究还表明脂肽
抗生素有助于产生菌在植物根部的定殖增强其生态环图3 菌株发酵液半制备产品的生物活性
2
Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00
%
1
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00
%
2
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00
AU 0.0
2.0e+2
20100819_01_LIU 3: Diode Aray Range: 2.317e+21.45 18.921.83 7.522.00 7.07 9.55 17.0811.50 20.2320.7824.15
20100819_01_LIU 2: Scan ES- TIC1.90e718.9815.4012.8911.527.677.151.342.54
24.2520.34 27.6329.09 37.0931.30
20100819_01_LIU 1: Scan ES+ TIC1.36e812.9512.489.141.942.43 7.754.32 19.0114.03 19.62 24.40 27.6729.08 37.03
a.菌株Wh2提取液的HPLC色谱图，b.菌株Wh 2提取液质谱总离子流图（正离子模式），c.菌株Wh 2提取液质谱总离子流图（负离子模式）
图4 菌株Wh 2紫外图谱和质谱图
a
b
c
2
nm200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
AU
0.0
2.5e-1
5.0e-1
7.5e-1
1.0
1.25
1.5
1.75
2.0
2.25
2.5
20100819_01_LIU 1130 (18.917) Cm (1128:1133) 3: Diode Array 2.832229.5222.5
213.5
203.5
235.5
261.5
a
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境适应性，在激发植物防御机制过程中也能起到关键
作用，因此被称为植物病害生物防治中的万能武器[11]。
从感病魔芋的病样中分离到一株魔芋软腐病病原
菌的拮抗菌，经理化性质与16S rDNA结合，确定其为
一株解淀粉芽孢杆菌，通过HPLC-MS分析其对魔芋
软腐病病原菌有拮抗作用物质的分子量和波峰，初步
判定其活性物质为脂肽抗生素。但其物质分子结构、
特性、拮抗活性能否在生产实践中应用等还待进一步
深入研究。
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致谢：感谢湖北省农业科学院经济作物研究所生物技
术研究室提供的帮助和宝贵意见。
2
m/z370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530
%
0
100
%
0
10020100819_01_LIU 809 (19.013) Cm (808:812) 1: Scan ES+ 1.45e6426.5
386.5369.4
384.4370.5 423.4388.2 408.5
427.5
474.6428.5 442.5 472.6454.8 526.7500.7482.7484.7 502.6512.8 530.6
20100819_01_LIU 809 (19.025) Cm (809:813) 2: Scan ES- 3.82e5424.6
380.5373.5 402.6384.5386.4 403.7412.6
490.8
479.8425.6
428.7 462.7446.6 472.8 489.9 504.8491.9498.9 519.9517.0 536.9525.0
c
b
a.拮抗菌菌株提取液紫外全波长扫描图，b.拮抗菌菌株提取液质谱总离子流图（正离子模式），c.拮抗菌菌株提取液质谱总离子流图（负离子模式）
图5 拮抗菌菌株提取液（Rt=18.92 min）的紫外全波长扫描图和质谱图
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