全 文 ：1999年 4月第 36卷第 2期　 　 　 　 　 四川大学学报 (自然科学版 )Journa l o f Sich uan Univ ersity ( Na tural Science Edition)　 　 　 　 Apr. 1999Vo l. 36 No . 2
文章编号: 0490-6756( 1999) -02-0350-04
黄精凝集素Ⅱ对大鼠主动脉
Ca2+ 跨膜流动的影响
鲍锦库 ,莫尚武* ,曾仲奎 ,周　红
(四川大学生命科学学院　成都 610064)
摘要: 用 45Ca跨膜流动技术测定黄精凝集素Ⅱ对大鼠主动脉 Ca2+跨膜内流的影响 .黄精凝集
素Ⅱ 在 0. 1～ 10μmo l L- 1时 ,不影响静息状态下 Ca2+ 的内流 ,但能抑制 NE和 KCl引起的 Ca2+
内流 ,其抑制能力依赖于凝集素的浓度 ;在 10μmo l L- 1时 ,可完全阻滞 N E引起的 Ca2+ 增加 ,并
能有效地阻滞 KCl引起的内流作用 .表明黄精凝集素Ⅱ 能阻滞细胞外的 Ca2+ 通过受体操纵钙
通道 ( ROC)和电压依赖钙通道 ( PDC)的内流 .
关键词: 钙拮抗剂 ;凝集素 ;黄精凝集素Ⅱ ;钙离子通道 ;大鼠主动脉
中图法分类号: R965 文献标识码: A
自 1967年 Felckenstein等提出“钙拮抗机制”的概念 ,有关拮抗剂的药理与临床应用有了
巨大进展 .由于钙拮抗剂能阻滞钙通过电压脉冲控制的 L-型钙通道进入各种组织 (如血管平
滑肌、心肌等 ) ,以改善钙通道的功能和全面减少膜对钙的通透性 [ 1] .目前临床上使用的钙拮抗
剂大多是人工合成药物 .近年来 ,中药中有效成分的研究开发成为药物学研究的热点 .人们通
过研究发现 ,在许多中草药中都具有钙拮抗剂活性的有效成分 ,现已有多种来源于中草药的钙
拮抗剂投入临床应用 (如粉防已碱 [2 ] ) .我们应用 45Ca跨膜流动测定方法 ,研究了来源于中药黄精
( Polynatum cyrtonema Hua. )的一种糖蛋白—— 黄精凝集素Ⅱ ( PCL Ⅱ )对大鼠主动脉 Ca2+
内流的影响 .
1　材料和方法
1. 1　材料
Wista r大鼠 ,体重 200± 30g,雌雄兼用 .黄精凝集素Ⅱ ( Polygonatum cy rtonema Hua.
Lectin ,简称 PCLⅡ )按文 [3]的方法纯化 ,经 HPLC, PAGE, SDS-PAGE检测均为单一蛋白组
分 .维拉帕米为德国 Kno ll公司产品 .去甲肾上腺素 ( N E)为 Sigma公司产品 , 45Ca为英国 Amer-
sham Li fe Science公司产品 ,放射性活度为 465× 10- 6 Ci /mL,其余为国产分析纯试剂 .
1. 2　方法
1. 2. 1　动脉血管的预处理及 Ca2+ 内流量测定　击晕大鼠 ,取出胸主动脉 ,去除表面结缔组
织 ,剪成长 5～ 6mm动脉环 ,置于连续通氧气的 37℃ PSS( mmol L- 1: NaCl 137, CaCl2 1. 5, Mg-
Cl2 1. 0, KCl 4. 6, HEPES 20,葡萄糖 10, pH7. 4)溶液中平衡 60min,移入含 45Ca 0. 93×
10
- 6
Ci /mL的 PSS溶液中预处理 3min,将动脉环或继续留在原液中 ,或移入含激动剂 ( N E
收稿日期: 1998-10-21
基金项目: 国家自然科学基金 ( 39770178)
* 四川大学原子核科学技术研究所
1. 2μmol L- 1或 KCl 100 mmol L- 1 )的 45Ca-PSS溶液中 ( 45Ca: 0. 93× 10- 6 Ci /m L) ,处理 5min.取
出动脉环 ,置于 0～ 2℃ EGTA溶液 [ 4] ( mmo l L- 1: EGTA 10, NaCl 137, M gCl2 1. 0, KCl 4. 6,
HEPES 20,葡萄糖 10, pH 7. 4)中浸泡 60min.用滤纸吸干动脉环、称重 ,加入 26μL 70% HClO4
和 50μL 30% H2O2 , 75℃消化 30min,冷却后加入甲苯闪烁液 (含 PPO 0. 5% ,萘 6%和乙二醇乙
醚 30% ) ,用液体闪烁计数器 ( FJ-2107P型 )测量放射性 .动脉环 45Ca内流量由下列公式计算:
Ca
2+内流量= 动脉环
45
Ca活度动脉环湿重 × 溶液
45
Ca浓度
溶液中 45Ca活度或以每克动脉环每分钟的计数表示 .
1. 2. 2　黄精凝集素Ⅱ对大鼠主动脉 Ca2+ 内流阻滞作用的测定　在 45Ca溶液中加入 PSS溶液
45min后 ,再放入动脉环并测定维拉帕米和 PCLⅡ对 Ca2+ 内流的影响 .在配制 45Ca-PSS溶液
时 ,要尽可能地减少 CaCl2的加入量 ,以保证加入 45Ca后溶液的 Ca2+ 浓度不大于 1. 5mmol L- 1 ,
并采用二甲基橙 -溴化十六烷以吡啶分光光度法 [6 ]测定溶液中的 Ca2+ 浓度 , 45Ca样品采用外标
准道比法 ( ESR)进行淬灭校正 .实验所得数据以平均值加减标准差表示 .采用 t-测验 ( pooled-
test)检验其显著性差异 .
2　结果
2. 1　去甲肾上腺素和 KCl对静息状态下 Ca2+内流的影响
静息状态下大鼠主动脉 Ca2+ 内流量为 203± 17( min- 1 g- 1 ) (n= 24) ,去甲肾上腺素为 1.
2μmol L- 1时大鼠主动脉 Ca2+ 内流量 293± 35( min- 1 g- 1 ) ,高钾溶液 ( KCl)为 100mmol L- 1时
Ca
2+的流量为 585± 34( min- 1 g- 1 ) ,与静息状态相比 , N E和 KCl均引起 Ca2+内流量的增加 ,
并以 KCl引起的增加量为最多 (表 1, 2, 3) .
2. 2　 PCLⅡ对静息状态下 Ca2+内流的影响
　　和维拉帕米相同 , PCLⅡ在 0. 1～ 10μmol L- 1时并不影响静息状态下大鼠主动脉 Ca2+ 的
跨膜内流 (表 1) ,说明 PCL Ⅱ对平滑肌细胞膜上溢流 Ca2+通道并无阻滞作用 .
2. 3　 PCLⅡ对去甲肾上腺素 ( N E)引起的大鼠主动脉 Ca2+ 跨膜内流的影响 (表 2)
表 1　 PCLⅡ对静息状态下大鼠主动脉
Ca2+ 内流的影响*
样　　品 浓度
(μmo l L- 1 )
Ca2+内流
( min- 1 g- 1 )
对　　照 0. 0 203± 17
维拉帕米
0. 1 201± 17* *
1. 0 203± 20* *
10. 0 202± 16* *
黄精凝集素Ⅱ
0. 1 204± 21
1. 0 203± 18* *
10. 0 201± 20* *
　　　* 样品数 n= 12; * * P> 0. 05(和正常值比较 )
表 2　 PCLⅡ对去甲肾上腺素 ( NE)引起
的大鼠主动脉 Ca2+ 跨膜内流的影响
样　　品 浓度
(μmo l L- 1 )
Ca2+ 内流量
( min- 1 g- 1 )
对　　照 0. 0 293± 35
维拉帕米
0. 1 280± 26*
1. 0 220± 30* *
10. 0 203± 19* * *
黄精凝集素Ⅱ
0. 1 290± 20*
1. 0 226± 28* *
10. 0 201± 31* * *
　* P> 0. 05; * * P > 0. 05; * * * P > 0. 01 (和正常值比
较 ) ;除不加 PCLⅡ的对照样品数为 24外 ,其余样品数
均为 12
与对照相比 , PCLⅡ对 1. 2μmol L- 1去甲肾上腺素 ( NE)引起的大鼠主动脉 Ca2+内流具有
阻滞作用 ,并随 PCLⅡ浓度的增加 , Ca2+ 内流量呈减少趋势 (表 2) ,当 PCLⅡ浓度为 10μmol
351第 2期 　 鲍锦库等:黄精凝集素Ⅱ对大鼠主动脉 Ca2+ 跨膜流动的影响 　
L
- 1时 ,即可完全阻滞 Ca2+内流 .这些结果说明 PCL Ⅱ对平滑肌细胞膜上受体操纵 Ca2+ 通道
( ROC)有很强的阻滞作用 ,临床常用的钙拮抗剂维拉帕米也有相似的作用 .
2. 4　 PCLⅡ对 KCl引起的 Ca2+ 内流的影响 (表 3)
表 3　 PCLⅡ对高钾 ( CK l)引起的大鼠主动脉 Ca2+跨膜内流的影响*
样　　品 浓度 (μmol L- 1 ) Ca2+ 内流量 ( min- 1 g- 1 )
对　　照 0. 0 585± 34
维拉帕米
0. 1 450± 29* *
1. 0 405± 40* * *
10. 0 320± 35* * *
黄精凝集素Ⅱ
0. 1 470± 32* *
1. 0 416± 27* *
10. 0 350± 22* * *
　　　　　　* 除不加 PCLⅡ的对照样品数为 24外 ,其余样品数均为 12; * * P> 0. 05; * * * P> 0. 01(和正常值比较 )
PCLⅡ对高钾 ( 100mmol L- 1 )引起的大鼠主动脉 Ca2+ 跨膜内流具有阻滞作用 ,并随
PCLⅡ浓度的升高 , Ca2+内流量逐渐减少 (表 3) ,当 PCL Ⅱ为 10μmol L- 1时 ,表现出强烈的阻
滞作用 .说明 PCLⅡ和维拉帕米一样 ,对平滑肌细胞膜电压依赖性 Ca2+通道具有阻滞作用 .
3　讨论
　　血管平滑肌细胞膜上存在着三种钙通道: ( 1)溢流 ( leak) .静息状态下细胞 Ca2+ 的内流途
径 ; ( 2)电压依赖钙通道 ( potential-dependent calcium channels, PDC) .细胞去极化兴奋时
Ca
2+的内流途径 ; ( 3)受体操纵钙通道 ( recepto r-operated calcium channels, ROC) . N E等与膜
受体结合后使其活化 ,除引起细胞外 Ca2+内流 ,还促进细胞内储存的 Ca2+释放到胞浆内 [ 4] .
以临床使用的钙拮抗剂维拉帕米为参照 ,通过测定 PCLⅡ影响 N E和高钾引起的大鼠主
动脉 Ca2+ 内流结果表明 , PCLⅡ对受体操纵钙通道和电压依赖钙通道均有明显的阻滞作用 ,
而对 Ca2+ 正常溢流不起作用 ,说明 PCLⅡ是一种有效的植物源性钙离子通道拮抗剂 .和临床
上应用的大多数合成药物和天然来源的小分子钙拮抗剂相比 ,黄精凝集素Ⅱ ( PCL Ⅱ )是一种
从中草药黄精中提取的糖蛋白凝集素 ,分子量为 15. 9KD,它不仅对免红细胞和胃癌细胞株
SGC、 HSC均有强凝集作用 ,而且还是一种甘露糖识别蛋白 [3, 9 ] . PCLⅡ具有钙离子通道拮抗
剂活性可能和糖识别结合能力有关 ,因在钙通道上存在 PCLⅡ的识别结合位点 ,它的结合作
用能稳定钙通道静息状态 ,从而阻止细胞外钙的大量流入 .已发现几百种中草药中含有钙拮抗
剂活性分子 ,但人们关注的多是其中的小分子物质 (如酮类、皂甙等 ) [ 10, 11] ,其中是否含有生物
大分子的钙拮抗剂 ,尤其是蛋白质类生物活性分子却鲜为人知 .我们的研究结果初步为中草药
中存在大分子钙拮抗剂提供了依据 ,也为凝集素这一类重要的糖识别蛋白的开发应用提出了
新的思路 .
[参　考　文　献 ]
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THE EFFECT OFPOLYGONATUM CYRTONEMA HUA . LECTINⅡ ( PCLⅡ )
ON CALCIUM TRANSMEMBRANE INFLUX INDUCED BY NOREPINEPHRINE
AND KCl IN SMOOTH MUSCLE CELL OF RAT AORTA
BAO J ing -ku ,MO Shang -wu , ZENG Zhengk-ui , Z HOU Hong
( Col leg e of Li fe Science, Sichuan Univ ersity, Chengdu 610064)
Abstract: Using
45
Ca as a tracer, the influence of Polygonatum cyrtonema Hua. (a Chinese
herbal drug ) Lectin Ⅱ ( PCL Ⅱ ) on Ca2+ t ransmemrane influx in smoo th muscle cell of
mouse aor ta w as studied. PCLⅡ can block the potential-dependent Ca2+ channel ( PDC) and
receptor-opera ted Ca
2+
channels( ROC) in cel l membrane of smoo th muscle ef fectiv ely , the el-
evation o f Ca
2+
induced by 1. 2μmol L- 1 no repineph rine and 100mmol L- 1 KCl can be blocked
ef fectiv ely by PCL Ⅱ a t the concentra tion of 10μmol L- 1. As a carbohydrate-recognization
and binding pro teine, PCLⅡ can be uti li zed as calcium channels blocker( CCB, calcium antag-
onist CA) . It’ s the fi rst repor t about CCB( CA) can be from bio-macromolecular, especially
f rom phytohemagglutinin.
Key words: calcium antagonist; lectin; Polygonatum cyrtonema Hua. lectinⅡ ( PCLⅡ ) ;
calcium channel; rat ao rta
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