全 文 ：福建农学院学报 (自然科学版 ) 22 (2 ): 一59一 16 3, 199 3
J o u nr a l o f F u五a n A g r i e u l t u r a l C o l le g e ( N a tu r a l S e ie n c s E d i t i o n
中国水仙花粉原生质体的分离与培养 ’
陈振光 林庆良 刘 群 林顺权
(福建农学院园艺系 , 福州 3 5 0 0 0 2)
摘要 取水仙花花草中上部即将开放的花蕾 , 按常规方法消毒后 , 把花粉粒挤在含纤素酶 0 . 5% 、 果胶酶
.15 %
、 甘露醇 12 % 的酶混合液中 . 保育 s h 后离心 、 纯化 . 可获得 2 士 .0 04 x 10 5 (个 / 朵 ) 原生质体 . 花粉
原生质体在附加 B A , 2, 4一 D 分别为 0 . 5 m g / L , 甘露醇 5% , 蔗糖 10 % 的 1 / 2 M S 或 K M SP 的液体培养基
中, 培养 3 d , 原生质体开始分裂 . 每隔 10 d 换培养液一次 , 使培养基的渗透压逐渐降低至普通培养浓
度 . 1个月后 , 形成肉眼可见的愈伤组织 , 转人以琼脂糖作固化剂的相同培养基中培养 2 个月后 , 细胞分裂
减弱 . 愈伤组织的增殖和分化 , 目前正在进一步探索之中 .
关键词 中国水仙 ; 花粉原生质体; 原生质体得率 ; 愈伤组织
中图分类号 5 6 8 .2 21
I s o l a t i o n a n d C u l t u r e o f P o l l e n P r o t o P l a s t s
i n N d r c 行s u s t a z e t t a v a r . c h l’n e n s l’s
C h e n Z h e n g u a n g L in Q i n g l i a n
(D e tP
.
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,
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L i u Q u n L i n S h u n q u a n
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A bs t r a c t F r e s h p o lle n g r a in s
,
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,
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.
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,
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,
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o b t a in e d w i th a h i g h y i e l d a b o u t Z土 。 , 0 4 x 10 , p e r a la b a s t r a s . T h e n th e s e p u r i n e d p r o t o p l a s t s w e r e c u l-
tU r e d i n a m o r d iif e d M S ( m a e r o e le m e n t s b e i n g l / 2 s t
r e n g h ) o r K M S P li q u i d m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i th 0
.
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,
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,
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vi s io n w a s o b哭 r v e d a ft e r th r e e d a y s a n d s u s t a in e d d iv i s i o n r e s u lt e d in m a s s p r do u e t i o n o f e e l l e o l o n ie s 阶 d
的 a l l e a lli a m o n th la te r . D u r i n g t h i s p e r i o d , o r i g i n a l l iq u id m e d i u m w a s r e p la c d w i th fr e s h o n e e v e yr 10
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山u m . T h e e e ll d iv i s i o n d im in is h e d i n 2 m o n t h s . T h e P r o d u e t i o n a n d d 人f fe r e n t ia t io n o f e a l li 15 n o w in a d -
粉 n Ce d f e se a r e h .
Ke y w o r d s
随着
八尹口 r c站s u s ra z e z止a v a r . c h in e n s众 R o e m : P o l le n P r o t o P la s t ; y ie ld o f P r o t o p la s t ; c a l lu s .
7 0
(B a孙j e t a l
年代初体细胞原生质体培养获得成功 , 花粉原生质体培养被提上研究 日程
19 7 4
,
P o w er 19 7 3)
、 花粉原生质体具有单倍性 、 结构简单 、 发育同步和群
. 收稿日期 : 1 9 9 2一 0 7一 1 0
本课题为国家自然科学基金项 目
DOI : 10. 13323 /j . cnki . j . f af u( nat . sci . ) . 1993. 02. 006
.10 6
· 福 建 农 学 院 学 报 (自然科学版) 第 2卷.
体数量大等优点 (周嫦1 9) 8 , 是遗传操作和突变研究的卓越体系 , 同时可以为花粉生理学
和个体发育的研究开辟新的途径 . 因而花粉原生质体培养研究进展受到研究者的极大关注 .
最早 , P o w e r ( 1 9 7 3 ) 和 B a扭j e t a l ( 1 9 7 4 ) 分别在烟草和几种茄科及禾本科植物中制
备花粉原生质体 , 但效果不佳 . 尔其后 10 年左右时间里 , 这方面工作处于停滞状态 . 1 9 8 5
年开始 , 在花粉原生质体的分离技术上有了新的突破 . L oe w us et al ( 1 9 85) 用 M M N O ·
H Z o ( 4一 m e t h y l m o r p h o l i n e N 一 o x id e m o n o h y d r a t e ) 分离出大量赓香百合花粉原生质体 ,
但药物与高温使原生质体严重失活 . 翌年该组研究人员改进了技术 , 初步解决了原生质体的
生活力问题 ( a a担j e t a l , 一9 7 4 ) . T a n a k a e t a l (一9 8 7 ) 也分离出察香百合的近成熟时期花
粉的原生质体 ; 周嫦 ( 19 8 ) 应用水合膨胀的原理 , 酶解分离出百合科 3 种植物的花粉原生
质体 . 这两组研究者通过培养这些花粉原生质体 , 分别诱导细胞壁再生 , 类似花粉管结构的
形成 , 还观察到生殖核分裂和精子形成 . 周嫦 ( 19 8 9) 还进一步诱导培养物启动胚胎分裂 .
但是 , 到目前为止 , 尚未见有进一步的报道 .
水仙花为三倍体的石蒜科植物 , 杂交不亲和 . 因而 , 细胞工程的应用研究特别有意义 .
我们曾进行了中国水仙鳞茎盘离体培养快速育苗的研究 (陈振光等 1986 ) , 但水仙花花粉
原生质体的分离和培养尚未见报道 . 本文报道这方面研究的初步结果 .
1 材料与方法
L l 供试材料
中国水仙 (而 r e is s 。 : z a z e z t a v a r . 。 h in e n s臼 R o e m ) 的商品球经水培 (或田 间种植 ) ’抽
草后取单瓣花的花草 , 花草发育期分为 I 期 (即将开苞 ) 、 n 期 (第一朵花 即将开放 ) 和 1
期 (最后一朵花即将开放 ) . 每支花草又分为上 、 中、 下 3 个部位取花 , 观察花粉粒饱满率
(因其为三倍体 , 花粉多不育呈干瘪样 ) .
L Z 原生质体的分离
花蕾经 75 % 酒精浸渍 30 5 后 , 用 0 , l % 升汞消毒 5一 7 m in , 然后 , 用无菌水冲洗 3一 5
次 . 把花药放人经 D 盯 a p or 。 M e m b ar n 。 过滤灭菌的酶液中 (酶液组合见表 3 ) , 角注射器内
筒轻压 , 让花粉散 出后 , 去除花药壁 . 花粉置于 26 ℃弱光下酶解处理 . 酶液用纤维素酶 、 果
胶酶混合或单独使用 (表 3) . 在倒置显微镜下检查酶解效果 . 酶解时间一般为 3一 s .h
L 3 原生质体的纯化与收集
用 8 0 9 离心 3 m in , 去除酶液 , 把富集的原生质体悬浮液铺于含 30 % 蔗糖的 c PW 液面
上 , 离心收集纯净的原生质体 . 然后用 ’12 % 甘露醇洗涤 2 次 , 培养液洗涤 1次 . 用上海医用
光学仪器厂生产的血球计数器计算原生质体得率 . 计算公式 : 原生质体个数 / 朵 = ( 5 个中
方格的原生质体数 x 50 00 x 定容毫升数 ) / 花朵数 .
L 4 原生质体培养及观察
把花粉原生质体以略高于 1 04 / m L 的密度接种于 1 / 2 M s 或 K M S P 附加 B A 和 2, 4一 D
分别为 0 . 5 m g / L 的培养基中 , 置于 25 ℃弱光下进行浅层培养 . 用倒置显微镜观察培养结
果 , 并摄影记录原生质体的变化动态 . 每隔 10 d 换培养液 l 次 , 降低渗透 压直至普通培养
浓度 , 形成肉眼可见的愈伤组织后 , 转人琼脂糖培养基 中继续培养 .
第 2 期 陈振光等: 中国水仙花粉原生质体的分离与培养 1 6 1
2 结果与讨论
2
.
1 花尊发育期和花蕾部位与花粉饱满率的关系
由于水仙花花粉高度不育 , 花粉干瘪率相当高 . 直接影响花粉原生质体得率 . 为此 , 我
们对各种材料进行 比较 , 其结果见表 1 .
从表 1 可以看出 : 花草发育期以 1 和 1
为适 ; 花 蕾 部位 以 上 部 花 为好 , 中部花
次之 , 下部花的饱满率大大低于上部花和中
部花 . 因此 , 我们认为 , 花粉饱满率受花草
发育期和花蕾部位的双重影响 . 花粉原生质
体的分离材料应选取花草发育期 n 期的中上
表 1 花攀发育期和花蕾位置与花粉饱满率的关系
发育期 花蕾比率 (% )上部 中部
15
.
5
l名. 0
矛OnùO…
ù
6、16,且,`,乙,
声
4
,、à….、甘七J, ,ù
, .,、ùJlI1m
部花蕾 为好 . 花草发育期 1 期的花粉饱满率虽然也较高 , 但因花蕾多数已经开放 , 不便消
毒, 故不宜采用 .
2.2 花粉原生质体的分离
花粉粒置于含有 12 % 甘露醇的酶液中处理 o . s h 后 , 花粉因水合而膨胀 , 外壁裂开 , 露
出椭圆形 的具内壁的原生质体 . 内壁在酶液的作用下 , 含果胶质的内壁外层和含纤维素的内
壁内层相继溶解 , 原生质体逐渐变圆 . 酶解 s h 可观察到大量完整的花粉原生质体和花粉空
外壁 (图 I A .)
图 l 中国水仙花粉原生质体的分离与培养
·
A
. 花粉粒外壁和具有内壁的原生质体; B . 分离的原生质体 ; C . 形成管状结构 ; D . 形成结节状结构 ; E . 形成念珠状
结构 ; F . 均等分裂 ; G . 不规则分裂 ; H , 1 . 多细胞原胚发生 ; J . 花粉原生质体形成的愈伤组织 .
1 6 2 福 建 农 学 院 学 报 (自然科学版 ) 第 2 2卷
上述观察到的结果与周嫦 ( 19 88) 在风
雨花和营草中观察到的结果十分近似 . 然后
用 30% 蔗糖进行纯化 , 可获得纯的原生质
体 (图 I B ) . 花粉原 生质体分离 的得率不
仅受到材料的影响 , 而且也受到酶液组合的
影响 . 为了探明它们之间的关系 , 我们做了
几种比较 . 结果见表 2 , .3
表 2 花蕾位置对原生质体得率的效应 ’ )
花蕾位置 得率 (原生质体数 / 朵 ) 0F 。 , 0F 01
AB上部
中部
下部
1 9 7土 0 . 19 x 10 ,
1
.
7 3土 0 . 12 x 10 ,
3
.
34 士 2 . 9 8 x 10 3
果孩酶
花草发育为 n 期 . 酶液组合为纤维素酶 1% 、
1
.
5%
、 甘露醇 12 % .
从表 2 可见 , 上部花蕾的原生质体得率最高 , 其次为中部花蕾 . 经 F 测验和处理间的新
复极差比较 , 两者无显著性差异 . 而下部花蕾的原生质体得率与中上部的比较 , 其差异均达
到极显著水平 .
综合表 1和表 2 的试验结果 , 可以看出花粉原生质体得率直接受到花粉饱满率的影响
(图 2 ) .
由图 2 可见 , 花粉饱满率与原生质体得率呈正
相关 . 饱满率愈高 , 原生质体得率也愈高 . 由此可
见 , 材料的选择是至关重要的 .
从表 3 可见 , 酶液组合以 0 . 5% 和 l % 纤维素
酶分别加 1 . 5% 果胶酶为好 . 原生质体得率分别是
.2 0 士 .0 04 x 10 5 和 1 . 9 7 士 0 . 19 x l0 , . 经测验 , 两者
之间无显著性差异 ; 但同其它组合相比 , 均达到极
显著水平 . 在纤维素酶为 1% 、 果胶酶分别为
1
.
5% 和 1% 时 , 高浓度的果胶酶效果更好 . 但单用
果胶酶的 3 种不同浓度均未达到显著性差异 . 加有
纤维素酶的 3 种组合与不加纤维素酶的组合相比 ,
其差异均达到极显著水平 .
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0
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花粉饱满率 (% )
图 2 花粉原生质体得率与花粉饱满率的关系
表 3 酶液组合对花粉原生质体分离的效应 ’ )
酶液组合 (% )
纤维素酶 果胶醉
原生质体数 / 朵 F。刀 , 0F 。 ,
酶液组合 (% )
纤维素酶 果胶酶 原生质体数
/ 朵 F 0 , F0 :
C,4U00
山.且,且口
7
.
2 土0 .0 8 x
5
.
5 6 土 0 . 17 x
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:
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.
2 2 土 0 . 4 3 x
AB1
.
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1
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5
1
.
0
2
.
0() 土 0
.
04
x 10 ,
1
.
9 7士 0 . 19 x 10 ,
1
.
5土 0 . 0 6 x 10 ,
, ) 材料为花覃发育期 n 期的上部花蕾 .
.2 3 花粉原生质体培养
在 1 / 2 M S 附加植物生长调节剂的液体培养基中培养 3 d , 50 % 以上的花粉原生质体开
始发生变化 . 变化具有丰富的多样性 : ( l) 有一小部分类似于花粉管的萌发 , 形成管状结构
第 2期 陈振光等 : 中国水仙花粉原生质体的分离与培养 · 16 3 ·
(图 IC ) ; ( 2) 大部分原生质体首先 “ 出芽 ’ , 最后形成结节状 (图 I D ) 或念珠状的结构
(图 I E ) ; ( 3) 有些花粉原生质体出现均等分裂 (图 I F ) . 这种分裂方式与我们从水仙叶片
组织分离下来的原生质体培养的分裂方式 (未报道 ) 相同 ; ( 4) 有些花粉原生质体出现不规
用分裂 (图 I G ) ; ( 5) 还有极少数的花粉原生质体 , 可连续分裂 、 启动胚胎发生分裂 (图
I H
,
1)
. 这与周嫦 ( 19 91 ) 报道的情况相类似 .
花粉原生质体培养 20 d 后 , 可形成不同类型的细胞团 . 其后 . 每隔 10 d 降低渗透压一
次 , 直至普通培养浓度 . 1个月后 , 形成肉眼可见的愈伤组织 , 转人以琼脂糖作固化剂的相
同培养基进一步增殖 (图 I )J , 但分裂 比较缓慢 . 对花粉原生质体的愈伤组织进一步增殖和
分化 , 目前正在进一步探索 .
水仙花 、 风雨花 (周嫦 19 8 8) 同属于石蒜科植物 . 而石蒜科与其它研究者迄今研究较
为成功的百合科和莺尾科均属于百合目植物 . 我们初步认为 : 几组研究者在花粉原生质体所
取得的进展 , 可能与所用的材料均为百合目有关 . 我们除了酶解水仙花花粉原生质体之外 ,
还先后尝试酶解了多种植物 (柑桔 、 蒲桃 、 杜鹃等 ) 的花粉 , 在同样的条件下 , 均未见木本
植物具有这种水合膨胀能撑破花粉壁的现象 . 草本植物的表现也与水仙花有很大的不同 . 所
以 , 似乎可以认为 , 百合目有些特殊 . 这个问题值得进一步探讨 .
参 考 文 献
陈振光 , 邱雪芝 , 林庆良 , 等 . 19 86 . 中国水仙(万盯`山。 taez tal va r
. 认翻随川自 R co m )试管育苗 . 福建农学
院学报 , 15 ( 3 ) : 20 4一 2 10
周 嫦 ; 19 8 · 三种植物花粉原生质体的大量分离与初步培养 . 植物学报 , 30 (4) : 36 2一3 67
周 撇 . 198 9 . 置草花粉原生质体培养启动胚胎发生分裂 . 植物学报 , 31 (6) : 钓 9一4 13
B a孙j y p S , D a v e y M R · 1974 · T h e is o la t io n a n d u l t ar s tr 公 t ur e o f p o ll e n p or t o p恤 st · I n : L i n s k o n s H F ( e d ) ,
F e r t i l该a t io n i n H ig h e r P la n st . A m s te r d a m , 73一8()
h 记 1 B G , F r a n ce s ch i V R , L o e wu s F A
,
198 6
. 众翔 lu it o n o f P o ll e n in t i加 a时 民 k议 o f s P o ro P las “ . I n :
M u cal h
y L M ( e d )
.
P o lle n CE
o l o g y a n d B i o te e h
.
N e w Y o r k
l加 w u s F A , B a ld i B G , F r a n e o cs h i V R , e t a l . 19 85 . P o l len s p o r o p la st s : d沁 0 1以 io n o f p o l le n w a l i-s P l a n t
P h y ` 10 1
.
7 8 : 6 52一6 54
氏 , “ J B . 19 73 . I os al it o n o f m a t u r e t a ab e co p o l 1e n p r o t o p l a s t s . I n : S t cer t H E c( d ) . P l a n t T is s u e a n d C e ll
C u l t u er
.
o x of r d
,
1 18一 119
aT na k a L K i t吐 u m e C , I t o M . l夕8 7 . T h e i s o la t io n a n d c u l tu er o f U ly p o ue n p r o 场p la s t s . P la n t cS ie nce
,
5() :
20 5一 2 11