全 文 ：科 考五 粗
第 40 卷 第 18 期 C l l 【N E S E S C I E N C E B U L L E T IN 1卯 5 年 9 月
紫菜苔花粉原生质体的电激转化及
Z m 13 一2 6 0一G U S 一N O S 融合基因的时序表达 *
施华中 徐秉芳 杨弘远 周 嫦
(武汉大学 生命科学学院植物生殖生物学研究室 , 武汉 43 加72 )
关键词 紫菜苔 花粉原生质体 , 电激转化 花粉特异启动子 G I J S 基因
利用花粉作为外源基因的媒介进行植物遗传转化是一个活跃的研究方向 l[] , 而将外源基 因
导人花粉是这一转化体系的重要环节 . 但因花粉壁厚 , 导人外源 D N A 比较困难 , 而脱壁后的
花粉原生质体则理应相对优越 . 近年花粉原生质体的分离与培养已取得了一定进展 2[] , 以花粉
原生质体作为转化受体已成为可能 . 为此 , 我们以花粉特异启动子 Z m 1 3~ 2 60 控制的 G U S 基
因作为报告基因 , 用电激法分别转化紫菜苔花粉原生质体和花粉粒 , 通过 瞬间表达检测 , 比较
了二者的转化效果 , 并探讨了 C U S 基因在不同发育时期花粉原生质体中的时序表达特性 .
1 材料与方法
L l 供试材料
紫菜苔 归 r “ 5反ca ca m娜 tr is va r . uP聊aer ) .
12 质粒
p B s一 60 gn 质 粒 由 J . P . M as ca enr h as 教 授 惠 赠 , 它 是带有 由玉米 花粉 特异 启 动 子
Z m 1-3 26 0
,
G U S 编码区和 N O S 终止子组成的融合基因的表达载体 3t] . 质粒 D N A 的提取鉴定
按文献 4[] 所述方法进行 .
1 3 成熟花粉
取当天开花的花药 , 置于 巧% 的蔗糖溶液中压出花粉 , 45 林m 不锈钢 网过滤 , 离心收集后
用 15 % 蔗糖溶液洗涤 3 次 , 重悬于花粉电激液 (含 巧% 蔗糖 的 C PW 溶液 , p H .S 8) 中 , 调整密
度至 3 x l OS加L 待用 .
1.4 花粉原生质体
取单核 、 二核及三核成熟花粉按梁立等 !习 的方法制备花粉原生质体 . 幼嫩花粉原生质体
按李昌功等问 的过滤离心法纯化 ;成熟花粉原生质体以沉降法纯化 . 纯化 的花粉原生质体最
后重悬于原生质体电激液 (附加 .0 8 mo l压 蔗糖
、
.0 4 mo l压甘露醇
、
.0 2 mo l瓜葡萄糖的 D Z培养
基 , P H S . 8 )中 .
1.5 电激处理
用天津理工大学研制的 L -N 10 1基因脉冲导人仪 , 将 .0 8 m L 样品置于 电极间距 为 .0 4 mr
19 5
一沮 一 13 收稿
* 国家自然科学基金资助项 目
第 1 8期 科 学 通 报 17 ()5
的电激槽中 , 加人终浓度为 10 协g /m L 的小牛胸腺 D N A 混匀 , 再加入质粒 D N A 使其终浓度
达 10 陀 /m L , 充分混匀后电激处理 . 电容为 20 林F , 脉冲时 间常数约为 .3 2 nsI , 根 据实验要求
调整电压 . 电激完成后 , 室温下静置 30 而 n , 电激液洗涤 2 次 . 花粉粒最后培养于附加 5% 蔗
糖和 20 % PE G 的 R o be 出 培养基 中 , p H .S 5 , 25 ℃ , 80 r娜 n 振荡培养 . 花粉原生质体则培养
于上述原生质体电激液中 . 培养 16 h 后 , 进行生活力的 F D A 鉴定与 G U S 活性检测 .
1.6 G U S 活性检测
按 北旋招。 ln 刀的荧光法检测 G U S 活性 . G U S 反应底物为 M U G (M o le c u l a r P or 肠 nI .c) ,
以不同浓度 的 M U 似 of e C u la r p or 比 cnI .) 作 为荧光强度标准 , 荧光分光光度计 为 S h iam d uz
R F
一
540
, 激发波长为 360 n m, 检测波长为 450 unr
. 按 B al d of 记同 的方法测定蛋白质含量 . G U S
比活性以
~
1 M U /而 n . gnr 一 ’ 蛋白质表示 .
2 结果
.2 1 电场强度对成熟花粉原生质体和成熟花粉粒生活力的影响
原生质体由于缺少壁的保护 , 在高场强电脉冲作用后易破碎死亡 , 因此通常利用较低场强
表 l 电场强度对成熟花粉原生质体和
成熟花粉粒生活力的影响
夕以〕 7印
5 5 3 1
如 6 5
1 〕刃 1 2 50
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46
和较长脉 冲时 间进行电激转化 . 花粉
原生质体同样如此 . 如表 1所示 , 当脉
冲时间常数约为 .3 2 snT 时 , 随着电场强
度的增加 , 花粉原生质体生活力逐渐降
低 , 其半致死 电场强 度约 为 SOO V c/ m .
花粉粒对电场强度的耐受性较大 , 其半
250一8395电场强度周 · cnI 一 ,
生活力 /叹 花粉原生质体花粉粒
致死电场强度约为 1 0 0 0 V /nCI 为兼顾一定的通透性和生活力 , 以下实验中均采用半致死电场
强度进行 电激转化 .
.2 2 花粉原生质体和花粉粒电激转化效果的比较
成熟花粉原生质体与成熟花粉粒的电激转化效果有很大差异 (表 2) . 由于成熟花粉原生
表 2 花粉原生质体和花粉粒中 G U S 基因表达水平的 比较
材料 花粉原生质体三核 二核 单核 花粉粒 (三核 )
G U S 活性 /
n l刀 C I M U
·
r n l n
·
grn 蛋白质 一 ’
12 0
一
26 a 以
质体消除了花粉壁的障碍 , 电激处理后
外源 D N A 更 易进 入细胞 , 因而 G U S
基因的瞬间表达水平远较花粉粒者为
高 . 前者的 G U S 活性为后者的 10 倍
以上 . 这说明花粉原生质体是 一个更
好的电激转化受体 .
.2 3 G U S 基因在不同发育时期花粉原生质体中的时序表达
Z m 1 3
~
260 是花粉特异表达启动子 , 其启动活性具有 时空特点 . 将 Z m 13一26 0城3 U S - N O S
融合基 因导人不同发育时期的花粉原生质体 , G U S 基 因的表达水平存在很大差异 . 在成熟花
粉原生质体 中有高水平表达 , 在二核期花粉原生质体中表达水平较低 , 而在单核期花粉原生
质体中极低 (表 2) . 说明 Z m 13一 260 是在小抱子有丝分裂后的花粉成熟过程中方才启动基 因
表达 .
170 6科 学 通 报 第 0 4卷
3讨论
以花粉原生质体作为转化受体的设想早 已提出阴 .本实验证实了这一设想 的可行性 .与
花粉粒相比 , 花粉原生质体的电激导人效果更高 . 随着今后花粉原生质体实验体系的建立和
完善 , 以成熟花粉原生质体作用外源基因的媒介 , 经授粉受精获得转基因植株 , 可能成为有潜
力的遗传转化新体系 .
H a而 lot n 等间利用基因枪法将含 Z m l3 不 同酶切片段 的 G U S 基因导入玉米和紫露草成
熟花粉以及紫露草叶片 , 分析了 Z m l3 不同片段的功能 , 并证实了该花粉特异启动子的组织特
异性 . G ue n ℃ r o 等 110] 在转基因烟草中证实 Z m l3 仅能启动 G U S 基因在小抱子有丝分 裂后的
花粉中表达 . 我们在紫菜苔花粉原生质体的电激转化及瞬间表达的分析也得到 了类似结果 ,
花粉愈幼嫩 , Z nr l3 的启动活性愈低 .
参 考 文 献
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