全 文 ：第 25卷　第5 期 武汉大学学服(医学版) Vol.25 ,No.5
2004年 9 月 Medical Journal of Wuhan University Sept , 2004
作者简介:石清照 ,女 , 1969,医学硕士 ,主治医师 ,主要从事小儿血液病研究
当归注射液治疗再生障碍性贫血的实验研究
石清照　徐之良　罗劲松　李爱民　杨　杨
武汉大学人民医院儿科　武汉　430060
摘要　目的:探讨当归注射液对再生障碍性贫血(AA)小鼠骨髓造血功能的保护作用。方法:雌性 Balb/c小鼠 ,
随机分为 5组。 ①正常对照组 , 未经特殊处理。 ②模型对照组 , 经60Co 6.0Gyγ-射线亚致死量全身照射 , 4 d 内由尾
静脉输入取自 DBA/2 小鼠的胸腺 、淋巴结混合细胞 ,制成 AA 模型 ,于制模当天给予腹腔注射无菌生理盐水 , 10 ml·
kg-1·d-1 , 连续 12 d。 ③当归注射液小剂量组 ,于制模当天即给予当归注射液腹腔注射 2 ml·kg-1·d-1 , 连续 12 d。
④当归注射液大剂量组 ,予当归注射液 10 ml·kg-1·d-1 , 腹腔注射。 ⑤丙酸睾丸酮组 , 给予腹腔注射丙酸睾丸酮 10
ml·kg-1·d-1。于第 12 d 每只小鼠称重后 , 采集尾静脉血测外周血白细胞计数 , 后断颈处死小鼠 , 取出双侧尺骨及
股骨 ,冲出骨髓单个核细胞 , 计数。并行 CD34+细胞检测及骨髓超微结构观察。结果:与正常对照组比较 , 模型对
照组造血细胞明显减少 ,骨髓微环境受损。当归注射液大剂量组能明显改善骨髓增生程度 , 修复骨髓微环境。结
论:当归注射液能通过促进骨髓造血细胞增生 , 改善骨髓微环境对 AA 小鼠进行保护作用。
关键词　当归注射液;贫血 , 再生障碍性;CD34抗原;超微结构
中图分类号　R 285.5　文献标识码　A　文章编号　1671-8852(2004)05-0557-03
A Study of Angelica Sinenisis Injection on Aplastic Anemia Mice
Shi Qingzhao , Xu Zhiliang , Luo Jinsong , et al
Department of Pediatrics , Renmin Hospital , Wuhan University , Wuhan 430060 , China
Abstract
Objective:To investigate the protective effect of angelica sinenisis injection on hematopoiesis of aplastic
anemia(AA)mice.Methods:The female Balb/c mice were divided into 5 groups.GroupA was normal con-
trol.Group B had been generally irradiated by sub-lethal dosage 60Co 6Gyγ-ray , then injected through tail vein
with mixed lymphocytes of thymus gland and lymphoid node of DBA mice in 4 hours.After AA models were
established , each mouse was intraperitoneally injected with sterile saline 10 ml·kg-1·d-1 for 12 days.Mice
from Group C were intraperitoneally injected with angelica sinenisis injection 2ml·kg-1·d-1 for 12 days for an
intervention treatment.Mice from Group D were intraperitoneally injected with angelica sinenisis injection 10
ml·kg-1·d-1 for 12 days.Mice from Group E were intraperitoneally injected with testosterone propionate 10
ml·kg-1·d-1.All mice were killed by cutting neck on the 12th day , and ulnas and femur were taken out.
The bone marrow ultrastructure of the mice ulnas were observed.The number of femnr bone marrow mononu-
cleate cells(BMNC)were measured and the CD34 expression levels were measured by the flow cytometor analy-
sis system.Results:The expression levels of CD34 in Group B were lower than those in Group A (P <0.
01), but they were increased in Group D(P <0.01).The ultrastructure observation showed that the mito-
chondria and endoplasmic reticulum of hematopoietic cells in Group B had been reduced and aberrant , and the
blood sinus cavity was expanded and the wall of sinus was broken.In Group D , the mitochondria and endo-
plasmic reticulum were plentiful and normal in shape , and the blood sinus were almost normal.No obvious dif-
DOI :10.14188/j.1671-8852.2004.05.023
ference was found between Group D and Group E inMNC counting and hematopoietic microenvironment.Con-
clusion:Angelica sinenisis injection plays a protective role in aplasitic anemia mice .Because it could promote
the proliferation of bone marrow of mice , it could improve the hematopoietic microenvironment.
Key Words　angelica sinenisis injection;aplastic anemia;CD34 antigen expression;ultrastructure
　　再生障碍性贫血(aplastic anemia , AA)是儿科血
液系统常见的难治性综合征 ,目前多采用中西医结
合治疗 。我科从 1991年起将当归注射液用于临床
治疗AA ,取得较好疗效[ 1] ,但其实验研究却少有报
道。我们用当归注射液对AA小鼠进行干预治疗 ,观
察其对 AA小鼠骨髓细胞 CD34抗原表达的影响 ,并
行超微结构的观察 ,以探讨其保护机制 。
1　材料与方法
1.1　实验动物　雌性 Balb/c小鼠(H-2a 、MLSb),8 ～
12周龄 ,17 ～ 20 g ,作为受者。由武汉生物制品研究
所提供。DBA/2 小鼠 (H-2a 、MLSa), 8 ～ 10周龄 ,作
为供者。由上海斯莱克实验动物有限公司提供。
1.2　当归注射液　由武汉大学中南医院药剂科提
供 ,批号 0303131 ,每毫升含当归生药 0.25 g 。
1.3　试剂及仪器　大鼠抗小鼠 CD 34-RPE 单克隆
抗体 ,购自深圳晶美公司 ,FAC Scalibur 流式细胞仪
为美国 BECTON DICKINSON公司产品。
1.4　免疫诱导 AA小鼠模型的建立　参照姚军[ 2]等
方法 ,取 DBA/2小鼠 ,断颈处死 ,常规消毒 ,无菌取
出胸腺及颈部 、颌下 、腋窝 、腹股沟 、肠系膜等处淋巴
结 ,加少量生理盐水 ,轻轻磨碎后过滤 ,使成单细胞
悬液 ,台盼蓝鉴定细胞活性 ,活性细胞达 98%。计数
后配成所需浓度备用。雌性 Balb/c小鼠 ,经60Co 6.0
Gy γ-射线亚致死量全身照射 。4 h 内由尾静脉输入
取自 DBA/2小鼠胸腺淋巴结混合细胞 ,输细胞量为
每只 1×106/0.2 ml。
1.5　分组与处理　Balb/c 小鼠随机分为 5组 ,即正
常对照组 、模型对照组 、当归注射液小剂量组 、当归
注射液大剂量组 、丙酸睾丸酮组 ,每组 8只 。正常对
照组:即未经照射组 ,给予腹腔注射无菌生理盐水 ,
10 ml·kg-1·d-1 ,每天 1次 ,连续 12 d。模型对照组 ,
于制模当天即给予腹腔注射无菌生理盐水 , 10 ml·
kg
-1·d-1 ,每天 1次 ,连续 12 d 。当归注射液小 、大
剂量组:于制模当天即分别给予当归注射液 2 ml·
kg-1·d-1及 10 ml·kg-1·d-1腹腔注射 ,每天 1次 ,连
续 12 d。丙酸睾丸酮组:于制模当天即给予腹腔注
射丙酸睾丸酮 10 ml·kg-1·d-1 。所有小鼠均给予每
升含红霉素 250 mg 及庆大霉素 320万 U无菌水喂
养。
1.6　小鼠外周血白细胞计数 ,骨髓有核细胞计数　
于制模第 12 d ,每只小鼠经尾静脉采血 ,按常规方法
计数外周血白细胞后 , 断颈处死 ,取右侧股骨 ,用
PBS冲出骨髓细胞 ,计数 ,即为 1根股骨中的骨髓有
核细胞(BMNC)。
1.7　骨髓 CD 34+细胞检测 　将冲出的 BMNC 用
4%甲醛固定 ,加入 10μl CD 34+-RPE单抗 ,4 ℃孵育
30 min ,用 PBS 2 ml洗 2 次后加入 1 ml PBS ,经流式
细胞仪检测 CD 34+细胞。
1.8　骨髓超微结构样本制备　取尺骨中段 ,固定于
4%戊二醛溶液中 ,经磷酸缓冲液充分冲洗后再固定
于 1%四氧化锇中 ,丙酮逐级脱水 ,环氧树脂 618包
埋 ,超薄切片 ,硝酸钴和醋酸钠双重染色 ,置于透射
电镜下观察骨髓造血细胞和基质细胞变化 。
1.9　统计学分析　数据以 x ±s 表示 ,多组间比较
采用单因素方差分析 ,两组间比较采用 q 检验 ,以 P
<0.05为差异有显著性。
2　结果
2.1 　外周血白细胞计数 、骨髓有核细胞计数及
CD34
+细胞抗原的表达　表 1显示 ,实验各组小鼠
白细胞计数 、骨髓有核细胞计数均显著低于正常对
照组(P<0.01),但当归注射液大剂量组及丙酸睾丸
酮组较模型对照组明显增加(P<0.01)。
558 武汉大学学报(医学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 25 卷
表 1　小鼠外周血细胞 、骨髓有核细胞数及 CD 34抗原表达的变化( x±s)
组别 n 白细胞(×10·L-1) 骨髓单个核细胞计数(×106/根股骨) CD 34(%)
正常对照组 8 6.8 ± 0.6 7.8 ± 1.1 71.2±2.7
模型对照组 8 0.8 ± 0.4## 1.8 ± 1.0## 52.8 ±4.6##
当归注射液小剂量组 8 1.2 ±0.7## 2.0 ±0.9## 49.4 ±3.8##
当归注射液大剂量组 8 3.9 ± 0.9##＊＊ 4.5 ± 1.1##＊＊ 64.0 ±5.3##＊
丙酸睾丸酮组 8 4.8 ± 0.9##＊＊ 5.5 ± 0.9##＊＊ 68.7 ±5.9##＊＊
F 13.73 11.24 10.43
　　　　　与正常对照组比较 , ##P<0.01;与模型对照组比较 , ＊P<0.05 , ＊＊P<0.01
　　模型对照组 BMNC 上 CD 34+细胞抗原的表达
水平明显低于正常对照组(P<0.01),而当归注射液
大剂量组及丙酸睾丸酮组较模型对照组明显增加
(P<0.05和 P <0.01),且与正常对照组之间无显
著性差异(P >0.05)。但当归注射液小剂量组与模
型对照组比较无显著差异(P>0.05)。
2.2　骨髓组织超微结构观察　正常对照组小鼠骨
髓中造血细胞排列有序 ,胞浆中有丰富的线粒体和
内质网 。骨髓微环境中可见血窦的扁平状内皮细
胞 、外膜网状细胞及基板 。
模型对照组(图 1)小鼠骨髓中造血细胞基本消
失。残存的造血细胞核膜模糊 ,核周隙变宽 ,线粒体
基质深染 ,嵴扩张 ,内质网扩张呈囊泡样 ,可见大量
溶酶体 。骨髓间质主要为巨大脂肪细胞 ,血窦扩张 ,
窦壁断裂 ,无微绒毛 ,内皮细胞核呈梭形 ,未见核内
小体 ,很少见到外膜网状细胞 。
图 1　模型对照组尺骨骨髓超微结构(×20 000)
当归注射液大剂量组(图 2)小鼠电镜下可见组
织结构与正常组接近 ,与模型对照组比较 ,骨髓中出
现了多量的幼稚造血细胞 ,胞浆中有丰富的线粒体
和内质网 ,形态基本正常。骨髓间质可见造血岛较
多 ,夹杂一定数量的脂肪细胞。血窦丰富 ,窦壁较
厚 ,有丰富的微绒毛 ,血窦内皮细胞核为圆形或椭圆
形 ,常见核内小体 ,血窦的外膜网状细胞常见 。
图 2　当归注射液大剂量组尺骨骨髓超微结构(×15 000)
3　讨论
本实验AA 模型经γ-射线照射后 , 不仅造成造
血细胞的死亡 ,对组成造血微环境的血窦 、内皮细
胞 、外膜网状细胞也造成损伤 ,呈现血窦壁断裂 ,细
胞器肿胀 、变形等超微结构的变化 。照射同时输入
具有免疫活性的淋巴细胞后 ,可使造血微环境的损伤
加重 ,病变持续存在 ,影响造血细胞的正常生长代谢 ,
最终导致造血功能不能重建 ,出现不可逆的AA 。
本实验证明 ,大剂量当归注射液不仅能增加骨髓
细胞 CD 34抗原的表达 ,而且能提高造血细胞线粒体 、
内质网的数量 ,改善其质量 ,从而促进 AA小鼠骨髓造
血干细胞的增生。同时 ,当归注射液能修复骨髓静脉
窦 ,保证细胞生长所需的营养物质及体液因子 ,进而
促进造血细胞 、基质细胞的生长发育及其功能 。
牛泱平[ 3] 等采用体外造血祖细胞集落形成技
术 ,首次观察了当归注射液对正常人和再生障碍性
贫血患者骨髓红系 、粒系的作用 ,结果发现:当归注
射液能促进正常人和再生障碍性贫血患者骨髓造血
干 、祖细胞的增生和分化 。邢金龙等[ 4] 的实验结果
(下转第 573页)
559　第 5 期　　　　　　　石清照 , 等.当归注射液治疗再生障碍性贫血的实验研究
预防PONV 的发生 ,并取得了一定的疗效 。枢复宁
为一种高度选择性 5-羟色胺 3(5-HT3)受体拮抗剂 ,
它通过与 5-HT3受体结合而激活受体 ,达到拮抗作
用 ,而且无镇静和锥体外系反应。氟哌利多是丁酰
苯类药物 ,镇吐作用强大 ,其作用机制是通过阻滞中
枢神经系统的多巴胺受体 ,但是可产生嗜睡 、低血压
和锥体外系反应 。甲氧氯普胺是通过阻滞多巴胺受
体而作用于延脑催吐化学感应区 ,具有中枢性镇吐
作用。PONV非单一受体的激活所致 ,故单一用药预
防PONV 可能不完全 。枢复宁和氟哌利多影响不同
的受体反应系统 ,加之氟哌利多起效快而枢复宁持
续时间长 ,疗效有一定的互补性。本观察结果显示
甲氧氯普胺和氟哌利多单用预防 PONV 的效果很
差 ,枢复宁疗效好 ,显著高于前两者(P <0.01),与
国外文献报道一致[ 5] 。联合用药组疗效明显高于其
他3组 ,与甲氧氯普胺和氟哌利多比有显著差异(P
<0.01),但统计学上与枢复宁单用无显著差异(P >
0.05)。另外 ,在病例观察过程中发现氟哌利多组和
联合用药组个别患者出现心慌 、胸闷 ,ECG 示心律失
常 ,提示我们注意氟哌利多的副作用 ,对无监测患者
联合用药安全性不如枢复宁单一用药 。
总之 ,枢复宁单一用药和枢复宁与氟哌利多联
合用药通过 PCA 输注对预防 POVN 疗效持续且显
著 ,可在临床推广应用 ,但其安全性有待我们进一步
观察研究 。
参考文献
1　张文其 , 邓硕曾.术后病人自控镇痛与恶心呕吐.国外医
学·麻醉学与复苏分册 , 1999 , 20(2):91
2　王珊娟 , 杭燕南.全麻恢复期并发症及其处理.中华麻醉
学杂志 , 2000 , 20(9):574
3　胡国昌编译.恶心和呕吐的生理学.国外医学·麻醉学与
复苏分册 , 1995 , 16(3):154
4　Greif R, Laciny S , Rapf B.Supplemental oxygen reduces the
incidence of postoperative nausea and vomiting.Anesthesiology ,
1999 , 91(5):1 246
5　Fujii Y , Tanaka H , Toyoka H.Prevention of nausea and vomit-
ing in female patients undergoing breast surgery.Acta Anaesthe-
siol Scand , 1998 , 42:220
(2003-10-18 收稿)
编辑　孙孝云
(上接第 559页)
也证实当归注射液具有清除氧自由基等有害物质 ,
保护细胞器的作用。
本实验进一步说明当归注射液可促进 AA 小鼠
骨髓造血细胞增生 ,改善骨髓造血微环境。本研究
为当归注射液应用于临床治疗 AA 提供了科学的实
验依据。
参考文献
1　王军陵 , 仲照东 , 仲惟昆 , 等.川芎嗪和当归联合雄性激
素和皮质激素治疗儿童再生障碍性贫血的临床观察.中
华血液学杂志 , 2000 , 21(10):544
2　姚军 , 李树浓.淋巴细胞与再生障碍性贫血的实验研究.
中华血液学杂志 1991;12(5):229
3　牛泱平 , 金锦梅 ,高瑞兰 , 等.当归注射液对正常人和再生
障碍性贫血患者造血祖细胞的刺激增生作用.实用中西
医结合杂志 , 1998 , 11(9):772
4　邢金龙 , 赵如意.当归清除氧自由基及保护线粒体的作
用.中医药研究 , 1996 , 12(4):55
(2003-12-201收稿)
编辑　孙孝云
573　第 5 期　　　杜朝晖 , 等.甲氧氯普胺 、氟哌利多 、枢复宁对术后自控镇痛患者恶心呕吐预防作用的比较