全 文 ：收稿日期:2005 - 07 - 20.
基金项目:国家科技攻关计划项目(2003BA 901A05).
作者简介:马琼(1979 - ),女(土家族),硕士 ,讲师 ,主要从事植物病害研究.
魔芋白绢病病原菌的分离鉴定
马　琼1 ,万佐玺 1 ,秦恩华1 ,周光来 1 ,柳　俊2 ,余展深 1
(1.湖北民族学院 生物科学与技术学院 ,湖北 恩施 445000;
2.华中农业大学 生命科学学院 ,湖北 武汉 430070)
摘要:从染病魔芋植株上收集白绢病菌核 , 以菌核为分离材料 , 分离到 3株产菌核的丝状病原真菌;根据病原
菌形态学及致病性特征 ,鉴定 3株病原菌为半知菌亚门 , 丝孢纲 , 无孢目 , 小核菌属的齐整小核菌 (Sclerotium rolfsii
Sacc. ) .
关键词:分离;鉴定;齐整小核菌
中图分类号:Q948. 12 +2. 3 文献标识码:A 文章编号:1008 -8423(2006)01 - 0097 - 04
魔芋(Amorphalluskon jac)属天南星科魔芋属草本植物 ,是我国重要的经济作物之一 ,种植面积大 ,魔芋
产品前景广阔.但是 ,由于魔芋软腐病和白绢病等主要病害逐年加重 ,导致魔芋面积和产量滑坡 ,魔芋病害已
成为魔芋高产的最大障碍.白绢病是农作物上普遍发生的重要土传病害 [ 1 ～ 11] ,发病植物有 100多个科的 500
多种植物 ,严重危害魔芋 、葡萄 、花生 、香荚兰 、胡萝卜 、茄子 、洋葱 、辣椒 、马铃薯 、番茄和西瓜等.
目前 ,已有研究报道葡萄 、花生 、香荚兰 、辣椒白绢病病原菌 ,但有关魔芋白绢病病原菌的分离鉴定还未
见报道.为弄清魔芋白绢病的发病规律 ,探索防治措施 ,本实验从恩施自治州巴东县 、建始县 、来凤县染病魔
芋植株上收集白绢病菌核 ,以菌核为分离材料 ,分离白绢病病原菌;对病原菌的培养特征 、菌核的形成过程及
菌核颜色变化 、菌核形态及内部结构观察 、有性阶段的有无 、致病性等进行了研究.
1　材料与方法
1. 1　病原菌的分离与筛选
从湖北省恩施自治州巴东县清太坪镇 、建始县 、来凤县染病魔芋植株上收集白绢病菌核 ,以菌核为分离
材料 ,无菌条件下将菌核置于 PDA培养基 (马铃薯葡萄糖琼脂培养基 )上培养 ,待菌丝长出后 ,进行纯化并
移接于 PDA斜面上保存.
1. 2　病原菌鉴定
1. 2. 1　病原菌培养特征
将纯化菌株置于 PDA平板上 , 25℃培养 3 d,待菌落形成后 ,用 5. 0mm打孔器无菌移置于 PDA平板中
央 , 25℃培养 ,重复 3次.观察菌落生长速度 、形态变化及菌核形成状况 ,并在显微镜下观察菌丝形态 ,测量
菌丝直径.
1. 2. 2　菌核形态及内部结构观察
菌核形成后 ,记录菌核形态 ,测量菌核直径 ,每皿随机测 20粒;作菌核石蜡切片 ,观察内部结构.
1. 2. 3　有性阶段诱发
将纯化菌株分别于 PDA和 PDAY培养基(PDA培养基中加 0. 05%酵母膏)上培养 ,观察有性阶段产生;
另用未耕种过的深层土壤 ,复盖上述刚长满平皿的菌落 ,于人工气候培养箱中保湿培养 ,诱发有性阶段产生.
1. 2. 4　菌核萌发率测定
选取成熟菌核 20粒置于 PDA平板上培养 ,计算菌核萌发率;另用未耕种过的深层酸性 (pH 5.5)、碱性
第 24卷第 1期　　　　 　　　　　　湖北民族学院学报(自然科学版)　　　　　　　　　Vo .l 24　No. 1
2006年 3月　　　　　 Journa l o fHubei Institute forNa tionalitie s(Natural Sc ience Edition)　　　　　　M ar. 2006
(pH 8.5)及中性(pH 7. 0)3种土壤分别复盖上述刚长满平皿的菌落 ,于人工气候培养箱中保湿培养 ,计算菌
核萌发率.
1. 2. 5　致病性测定
(1)离体接种致病性测定:将健康的球茎用 95%的酒精表面消毒 ,后用灭菌刀片将其切成 2. 5 ～ 3 cm的
小块 ,用消过毒的解剖刀在小块的正中央挖一个圆形浅槽 ,其深度和直径约为 0. 1 cm ,然后将菌核置于浅槽
中 ,每菌株 3个重复 , 2个对照.置于 (25±1)℃的恒温培养箱中培养.
(2)活体接种致病性测定:采用基部无伤和有伤接种 ,测定病原菌对魔芋植株的致病性. 取一菌丝块贴
于魔芋植株基部 ,用消过毒的棉花包裹保湿 ,并用棉绳系扎 ,防止菌丝块脱落. 每菌株 3个重复 , 2个对照 ,于
温度为 (25±1)℃,空气湿度为(78±1)%的人工气候培养箱中保湿培养.
图 1　有隔膜的菌丝
F ig. 1　D iaph ragm a ticm yce lia
2　结果与讨论
2. 1　病原菌分离结果
从白绢病菌核分离得到 3株病原菌 ,分别将巴东县白绢病病原菌命名为 S r - 01,建始县白绢病病原菌命
名为 Sr -02,来凤县白绢病病原菌命名为 S r -03.
2. 2　病原菌鉴定
2. 2. 1　病原菌在 PDA培养基上培养特征
菌丝无色透明 ,呈空心管状结构 ,有隔膜 (见图 1),呈放射状生长 ,有分
枝 ,在分枝的基部有明显的缢缩 ,有锁状联合现象 (见图 2),菌丝直径 4. 5 ～
7. 0μm. 25℃培养 1 d后 , 3株菌均萌发 ,培养 2 d后 ,菌落直径达 35 ～ 40mm , 3
d后达 70 ～ 75mm , 4 ～ 5 d后菌落长满整个平皿;菌落初为白色绒状 ,气生菌丝
茂盛(见图 3), 3 ～ 4 d后 ,中央仍呈疏松绒毛状 ,并向四周平铺扩展 ,集结成线
状或索状(见图 4), 5 ～ 6 d后 ,菌落表面即开始形成白色纽结 ,菌核开始形成 ,
且以平皿周缘或菌丝相向生长相遇时形成较多 ,原因可能是菌丝生长受阻 ,菌
丝易于纽结形成菌核 , 7 ～ 10 d后 ,菌核大量形成(见图 5).
　　　图 2　菌丝锁状联合 图 3　PDA培养基上的气生菌丝
F ig. 2　C lam p connection of the myce lia F ig. 3　Aerial myce lia
图 4　菌核形成初期菌丝集结成索状 图 5　大量形成的菌核　　　　
F ig. 4　Cab le myce lia F ig. 5　Sc le ro tia fo rmed 　　　
3株菌的培养特征稍有差异(见表 1). Sr - 01菌丝生长最为旺盛 ,形成的气生菌丝多 ,生长速度快 ,菌丝
直径最大(平均直径为 6. 61μm),但产生成熟菌核的时间较长;S r - 03生长速度最慢 ,菌丝生长最为稀疏 ,
菌丝直径最小(平均直径为 4. 84μm),但菌核形成速度快 ,数量多.
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2. 2. 2　菌核形态及结构
随培养时间的延长 , 3株菌菌核的形状及颜色变化一致 (见表 2).菌核形成初期为白色 ,逐渐变为淡黄
色 ,成熟后为黄褐色或茶褐色. 菌核表面光滑 ,如油菜籽状 ,多为圆球形 ,少数为不规则球形.当培养基干涸
后 ,菌核随之干缩 ,表面失去光泽.
表 1　病原菌在 PDA培养基上培养特征
Tab. 1　Culturing charac ters of pathogenic strains on PDA
菌株 菌丝结构 菌丝平均直径 /μm 菌丝生长速度 形成菌核情况
Sr -01 菌丝呈透明管状结构 , 有隔膜 ,有锁状联合 6. 61 生长最快 产生成熟菌核的时间较长 , 菌核数量少 , 且菌核颗粒较大 .
Sr -02 菌丝结构同 Sr -01 5. 42 生长速度比 Sr- 01稍慢 菌核形成速度 、数量及菌核颗粒大小居中.
Sr -03 菌丝结构同 Sr -01 4. 84 生长最慢 菌核形成速度快 ,数量多 , 菌核颗粒最小.
图 6　染病球茎
F ig. 6　Corm a ffected
　　菌核直径测定结果表明 , S r - 01菌核的直径最大 ,平均直径为 2. 3mm , S r - 03菌核的直径最小 ,平均直
径为 1. 1mm.菌核石蜡切片显示 , 3株菌的菌核内部结构特征基本一致(见表 2),菌核外层细胞分化不明显 ,
颜色稍深 ,呈黄褐色 ,形状不规则 ,排列紧密;髓部细胞较大 ,呈多角形或不规则形 ,色灰白 ,排列较疏松.
2. 2. 3　有性阶段观察
3株菌在 PDA 、PDAY及复土培养基上培养 ,未见到有性阶段 ,但均发现锁状联合现象.
2. 2. 4　菌核萌发率测定
3株病原菌菌核在 PDA上均萌发较好.在 25±1℃温度下恒温培养 , 3 d内菌核全部萌发.菌株 pH适应
范围广 ,酸(pH 5. 5)、碱 (pH 8. 5)及中性 (pH 7. 0)土壤中 ,菌核均可萌发 (见表 2),中性土壤中菌核萌发最
好 ,萌发率均在 80%以上 ,碱性土壤中菌核萌发最差. 因此 ,应选择偏碱土壤种植魔芋较为适宜.
表 2　3株病原菌菌核的生物学特征及其致病性
Tab. 2　B iologica l prope rties and pa thogen icity o f three pathogenic strains
菌株 菌核形态 菌核内部结构 有性阶段 菌核萌发率 /%
pH 5. 5 pH 8. 5 pH 7. 0
致病性
S r- 01
菌核初为白色 , 逐渐变为淡黄色 , 老熟后茶褐色. 菌核表面光滑 , 如油菜籽状 , 成熟菌核平均直径为 2. 3mm.
菌核外层细胞分化不明显,细胞颜色稍深 , 排列紧密;髓部细胞较大,色灰白 ,排列疏松.
无 有性 阶段 , 有锁状联合. 32. 02 30. 33 85. 5 离体或
S r- 02
成熟菌核平均直径为 1. 8
mm, 颜色变化及形状同 Sr
-01.
菌核内部结构同 Sr - 01. 无 有性 阶段 , 有锁状联合. 31. 67 29. 89 84. 6
活体接种 ,致病率均为
S r- 03
成熟菌核平均直径为 1. 1
mm, 颜色变化及形状同 Sr
-01.
菌核内部结构同 Sr - 01. 无 有性 阶段 , 有锁状联合. 31. 24 29. 72 82. 8
100%
2. 2. 5　致病性测定
用菌丝块在离体的魔芋球茎及盆栽魔芋苗上接种 ,不论是离体接种 ,还是活体接种 ,都有很强的致病力.
经致病性测定 ,离体接种后魔芋块初期呈水汁状 ,后腐烂 ,病部密布大量菌丝 (图 6).活体接种的表现与田间
表现均一致 ,茎部变褐腐烂 ,密布白色绢丝状菌丝. 分离接种后的病株又得到接种病原菌.
2. 3　病原菌鉴定结果
病原菌菌落白色 ,疏松呈放射状生长. 菌丝无色绢丝状 ,有隔膜 ,菌丝
直径 4. 5 ～ 7. 0μm.后期菌丝扭结成白色菌丝束或菌索 ,继而形成白色球形
菌核 ,逐渐变为淡黄色 ,成熟后为茶褐色.菌核球形 ,椭圆形或不规则形 ,菌
核直径 1 ～ 2. 5mm ,在中性偏酸环境易于萌发. 自然条件下 ,病原菌不易发
生有性阶段 ,但均发现锁状联合现象.活体接种的表现与田间表现均一致 ,
茎部变褐腐烂 ,密布白色绢丝状菌丝.根据病原菌形态学及致病性特征 ,本
实验分离所得的魔芋白绢病病原菌 S r - 01、S r - 02、S r - 03基本符合有关
文献关于小核菌属和罗氏小核菌特征的描述 [ 3] .因此 ,该病原菌的无性阶
段应为丝孢纲 ,无孢目 ,小核菌属的罗氏小核菌 (Sclerotium rolfsii Sacc. ),戴
99第 1期　　　　　　　　　　 　　　　　马　琼等:魔芋白绢病病原菌的分离鉴定　　　　 　　
芳澜(1987)和张中义(1988)称之谓齐整小核菌.
齐整小核菌的有性世代 Pellicularia rolfsii(Sacc)West,属担子菌 ,但在自然状态下 ,有性阶段极少发生.
本实验中 ,病原菌菌株虽然未能诱发产生有性阶段 ,但真菌菌丝常有锁状联合现象 ,说明它与担子菌关系密
切.病原菌无性阶段产生的菌丝片段 、菌丝束 、菌索及菌丝的特化结构菌核是危害魔芋的病原繁殖体.
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The Separation and Identification ofSc lero tium rolfsii Sacc.
CausingAmorphalluskon jacWhite Rot
MA Q iong
1 ,WAN Zuo - xi1 , Q IN En -hua1 , ZHOU Guang - la i1 , LIU Jun2 , YU Zhan - shen1
(1. Co llege of B io science and Techno logy, H ubei Institute forN ationalities, Enshi 445000, China;
2. B io science Co llege, H uazhong Ag ricultural University,W uhan 430070, China)
Abstract:In this expe riment, we co llected thew hite ro t sclero tia onAmorphopa lluskon jac plan.t Three pathogenic
strains(S r - 01, Sr - 02, Sr -03)were iso lated succe ssfu lly. A cco rding to the morphologic cha racter and pathoge-
nicity, three strains we re identified as Sclerotium rolfsii Sacc, Agonomyceta les, Hyphomyce tes, Deu te romyco tina.
Key words:separation;identification;Sclerotium rolfsii Sacc
100 　　　　　　　　　　　　　湖北民族学院学报(自然科学版)　　　　　　　　　　 　 　　第 24卷