全 文 ：应用与环境生物学报 2010，16 ( 1 ): 018~022
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X
2010-02-25
DOI: 10.3724/SP.J.1145.2010.00018
光合作用可以将太阳能转变为化学能并蓄积在合成的
有机物中，是生命赖以生存的基础. 光系统Ⅱ（PSⅡ）由光反
应中心、核心光捕获天线及外周捕光天线组成. 外周捕光天
线由大量的捕光叶绿素a/b结合蛋白复合物组成，分为主要
和次要捕光叶绿素a/b结合蛋白复合物，能将光能量转移到
光合中心[1]. 这些蛋白有多基因编码，彼此间有着很高的同源
性，LHCⅡ编码基因命名为lhcb [2]. 植物生长环境中的光、温、
水、肥、气等非生物因素在不断变化，在进化过程中形成了许
多调节机制，从而使得光合机构能够相应地协调各个部分反
应间的关系来适应环境的变化 [3~4].
有关光照对LHCⅡ组成结构影响的研究已经比较深入 .
LaRoche等发现，当把 Dunaliella tertiolecta从高光移到低光
条件下时，LHCⅡ含量明显升高. 细胞叶绿素含量升高，叶绿
素a/b值明显下降 [5]. 这说明植物在高光到低光转换过程中，
依靠增加LHCⅡ的量和增加叶绿素b的比率来适应这种转换.
LHCⅡ复合体大小的变化有两种途径，一种是状态转换，这
是由电子传递链调控的类囊体膜的磷酸化引起的，LHCⅡ可
以通过磷酸化或脱磷酸化在两个光系统之间进行转移 [6~8].
另外就是磷酸化调控的核内lhcb基因的表达 . Escoubas实验
表明，强光造成了LHCⅡ蛋白量的减少，这种变化是由围绕
在光合中心的电子传递链的变化引起的，其中质体醌的氧化
还原态有着重要的作用，当醌池处于还原态时，就会抑制核
内基因的表达，最终导致LHCⅡ复合体尺寸减小[9]. Hagit总结
不同光照下盐生杜氏藻光捕获蛋白基因lhcb和
叶绿素a合成酶基因cao的表达变化*
陈卫民 张 书 费保进 李 伟 于荣清 徐 辉 乔代蓉 曹 毅**
（四川大学生命科学学院四川省生物信息与代谢工程共享实验平台 成都 610064）
Expression Changes of lhcb and cao in Dunaliella salina under
Different Light Intensities*
CHEN Weimin, ZHANG Shu, FEI Baojin, LI Wei, YU Rongqing, XU Hui, QIAO Dairong & CAO Yi**
(Experimental Platform of Bioinformatics and Metabolic Engineering of Sichuan, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)
Abstract Due to the high homology among the family members encoding light-harvesting protein (lhcb), only total
gene expressions, not the individual gene of lhcb were studied in previous researches. Using the real-time PCR, this study
investigated the gene expression changes of the lhcb members under different light intensities in single-cell photosynthetic
organism Dunaliella salina. The results showed that the expressions of lhcb were inhibited after the transition to high light
intensity of cells, but there was no similar changing tendency for each gene with the change in time. Contrary to the lowest
accumulation of lhcb1, lhcb2.1 and lhcb2.2 in 3 h, the mRNA amount of lhcb3 was the highest except the control (0 h). When
cells were transferred to the dark condition, the mRNA amount of each gene elevated and existed a similar changing current,
which peaked in 3 h except lhcb2.1 in 1 h. The expression change of cao encoding chlorophyll a oxygenase was similar to that
of lhcb3. The accumulations of LHCⅡ and chlorophyll decreased and elevated under high light intensity and dark condition,
respectively, but the value of chla/b showed a contrary changing tendency. Fig 4, Ref 19
Keywords photosystemⅡ; LHCⅡ; lhcb gene family; expression amount; chlorophyll a oxygenase
CLC Q948.112.1 : Q949.206
摘 要 由于光捕获天线蛋白（LHCⅡ）编码基因（lhcb）家族同源性较高，以往研究只能从总体上反映家族基因的变
化，对各个编码基因的表达研究较少. 本研究以光合单细胞生物盐生杜氏藻（Dunaliella salina）为材料，应用实时PCR
的方法，系统研究了lhcb基因家族成员在光环境转换过程中的表达变化. 结果表明，当由正常培养光环境转移到高光
条件下时，lhcb基因家族成员的表达整体上受抑制，但各个基因的表达变化趋势随时间变化不尽相同. 在强光照下，
lhcb1、lhcb2.1、lhcb2.2 3 h时有最低的表达积累量，而lhcb3却有较高的表达量. 细胞转入黑暗环境后，各个基因的转录
水平升高，变化趋势基本相同，在3 h时均有较高的表达量，只有lhcb2.1在1 h时的表达量最高. 叶绿素加氧酶编码基因
cao的变化与lhcb3基本相同. LHCⅡ蛋白量在高光下降低，在黑暗条件下升高. 叶绿素含量在高光条件下明显下降，叶
绿素a/b值升高，黑暗条件下则相反. 图4 参19
关键词 光系统Ⅱ；LHCⅡ；lhcb基因家族；表达量；叶绿素加氧酶
CLC Q948.112.1 : Q949.206
收稿日期：2009-01-29 接受日期：2009-05-05
*国家自然科学基金项目（Nos. 30871321，30740055，30771312）和教育部
新世纪优秀人才支持计划（No. NCET-05-0785）资助 Supported by the
National Natural Science Foundation of China (Nos. 30871321, 30740055,
30771312), and the P rog r a m of Mi n i s t r y of Educa t ion of Ch i na for
Ne w C e n t u r y E xc e l l e n t Ta le n t s i n Un ive r s i t i e s of C h i n a (No.
NCET-05-0785)
**通讯作者　Corresponding author (E-mail: caoyi_01@163.com)
191 期 陈卫民等：不同光照下盐生杜氏藻光捕获蛋白基因lhcb和叶绿素a合成酶基因cao的表达变化
出电子传递链造成醌池的氧化还原态，触发膜上磷酸激酶
的活性，它同时使CP43、D1/D2、LHCII、TSP9及PsbH几种蛋
白发生磷酸化，其中被磷酸化的TSP9作为一种信号分 子调
节核内基因的表达 [10].
光 线依 赖的 LHCⅡ复合 体 数 量的 调 节是 一 个 动 态的
过程 [11]，叶绿素b的合成在调节LHCⅡ复合体数量的过程中
起着很重要的作用 [12]. 在 Arabidopsis中，当叶绿素a加氧酶
（CAO）过 量表 达时，LHCⅡ复合体的数 量会明显增多 [13].
Tatsuru研究表明lhcb和叶绿素a加氧酶编码基因cao的表达具
有一致性 [14]. 当把D. salina从高光转移到低光或低光转移到
高光下后，几种叶绿素合成酶编码基因只有叶绿素加氧酶基
因cao与lhcb有相同的变化趋势.
盐生杜氏藻（D. salina，盐藻）作为一种最耐盐的真核
单细胞光合生物，是研究各种非生物因子对其生长状态影响
很好的材料. 迄今为止，本实验室已经从盐藻中克隆出了4条
lhcb基因，分别命名为lhcb1、lhcb2.1、lhcb2.2和lhcb3，这就使
系统研究lhcb基因家族的表达成为可能. 本试验拟以盐藻为
材料，研究在持续高光和黑暗条件下，4条lhcb基因及叶绿素
a加氧酶编码基因cao的变化情况，再结合蛋白和色素含量的
变化，以期揭示不同强度持续光照对LHCⅡ组成变化的影响.
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 生物材料 D. salina、菌株Escherichia coli BL21、质粒载
体pET32a均由本实验室保藏；纯种新西兰大白兔由四川大学
华西实验动物中心提供.
1.1.2 生化试剂 TRIZOL购自Invitrogen公司. PrimeScriptTM RT
及SYBR®Premix Ex TaqTM 试剂盒购于TaKaRa公司. 弗氏完全
佐剂和弗氏不完全佐剂购自SIGMA公司. 辣根过氧化物酶标
记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司.
1.2 方 法
1.2.1 材料培养及胁迫处理 D. salina在正常光照条件（300
μmol m-2 s-1）下培养. 培养温度为25 ℃，光照节律为18 h光照
/8 h黑暗. 待细胞生长至对数期后，分别转到强光（1 000 μmol
m-2 s-1）和黑暗条件下进行胁迫处理. 取样时间设定为0 h、1
h、3 h、6 h、9 h.
1.2.2 样品处理 处理后的样品立即进行RNA的提取或液氮
冻存. RNA提取及反转录均按照产品说明书提供的方法进
行，cDNA产物保存备用. 参照LaRoche实验方法 [5]，冻存样品
超声波破碎后提取总蛋白.
1.2.3 实时定量PCR 使用软件Primer premier 5.0分别针对
lhcb1、lhcb2.1、lhcb2.2、lhcb3、cao和18S rRNA各条基因进行
引物设计，其中18S rRNA作为内参. 经特异性验证后确定引
物如下：
lhcb1：上游引物 5TGGTTGAGAGTTTGGACACCGA3；
下游引物 5GATGGCTTTGTGGGCTTCG3 .
lhcb2.1：上游引物 5TTCTT GACCGGACCTTAGTT-
GAGC3；下游引物5GGAAGCATCATGCACACGATGTAT3.
lhcb2.2：上游引物 5TTGATTCTGTGCCTTAAGAC-
CTGG3；下游引物5CACGCAAGCAGTTACTTCTCACAG3.
lhcb3：上游引物 5CAGGCTTGAGTGCACCTTGTAG3；
下游引物 5ATGGCTGGGTGCTGCTTCG3.
cao：上游引物 5CTTGGTGGTTCAAT GGTTCCTG 3；
下游引物 5CAACAGTATGCA TGGTGGGACAG3.
18S rRNA：上游引物 5TTGGGTAGTCGG GCTGGTC3；
下游引物 5CGCTCGTTCTTCATCGTT3.
对引物及反应条件进行优化之后，确定反应条件如下：
95 ℃预变性5 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循
环. PCR反应结束后，做出样品的溶解曲线. 每个样品3个重
复，避免偶然性结果的影响. 采用2-ΔΔCt法对实时定量PCR获
得的Ct值进行分析.
1.2.4 抗体制备 将盐藻lhcb3克隆到PET32a载体中，转入大
肠杆菌BL21菌株进行表达，收集包涵体蛋白后，经切胶、电
洗脱后纯化出所需要蛋白. 免疫兔后待效价达到需要时，取
血清低温保存备用[15].
1.2.5 蛋白电泳及Western blot 先对提取的总蛋白进行定量，
蛋白浓度按照Bradfold法 [16]进行测定. 样品用0.5 mol/L Tris-
HC1，7% SDS，20%甘油，2 mol/L 尿素（pH 6.8）60 ℃处理30
min后，每个泳道等量蛋白上样，SDS-PAGE（15%分离胶，5%
浓缩胶，4 mol/L的尿素）分离[17]. 4 ℃、100 V转膜1 h , 用制备
的抗体进行杂交，将辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗血清
1 : 5000稀释作为二抗检测目的蛋白.
1.2.6 色素含量测定 等量的盐藻细胞收集后，按Arnon的方
法 [18]测定叶绿素含量：取样品50 μL溶于80%（V/V）丙酮中，
定容至5 mL，3 000 r/min离心3 min，取上清测定663 nm和645
nm的光吸收值并计算叶绿素a和叶绿素b的含量. 使用血球计
数板进行细胞计数.
2 结果与分析
2.1 抗体验证及LHCⅡ位置的确定
利用制备的盐藻 lhcb3多克隆抗体，经过与盐藻总蛋白
的Western杂交，在Mr 29×103处有比较清晰的双条带出现（图
1），根据LHC II氨基酸序列推测以及文献报道 [13]，确认此位
置蛋白为LHCⅡ，说明制备的抗体可以用于后续的实验.
图1 盐藻特异性lhcb3抗体杂交类囊体膜蛋白LHCⅡ分析
Fig. 1 Western blot analysis of thylakoid membrane LHCⅡin D. salina using
special lhcb3 rabbit polyclonal antibody
Lane M：标准蛋白标记；Lane 1: 特异性lhcb3多克隆抗体杂交
Lane M: Standard protein molecular weight; Lane 1: Western blot using
special lhcb3 polyclonal antibody
20 16 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol
2.2 强光照和黑暗条件下lhcb基因家族的表达
盐藻细胞经强光和黑暗处理后，4条lhcb基因的表达均
受强光照抑制（图2-A, B, C, D）. 菌体变化为: lhcb1在3 h时积
累量最低，6 h后逐渐升高，9 h时与对照水平相当；lhcb2.1 积
累量在3 h时最低，6 h时有一些升高，9 h时又降低；lhcb2.2表
达趋势与lhcb1一样，只是在9 h时的积累量仍比对照低；lhcb3
积累量在6 h时表达量最低，9 h时略有回升，但仍受抑制；cao
表达量在1 h时积累量最低，3 h时有一些回升，6 h又降低（图
2-E）.
与强光 照 对lhcb和cao mRNA积累的影响不同，在 细
胞转入黑暗环境 后，5条 基因的积累量均有升高. Lhcb1、
lhcb2.1、lhcb3和cao基因在3 h时的积累量最多，然后逐渐回
落；lhcb2.2在1 h时的积累量最多，然后逐渐回落. 但几条基
因在9 h时的积累量仍比对照要高. 这说明高光造成了lhcb及
cao基因的表达抑制，而黑暗条件下使得几条基因的表达量
有所增加.
2.3 不同光处理对LHCⅡ蛋白积累的影响
强光处理后，LHCⅡ蛋白量在6 h后明显减少，说明强光
抑制了LHCⅡ蛋白量的积累；与之相反，在黑暗条件下，LHC
Ⅱ从3 h开始蛋白量有明显增加，9 h时蛋白量积累最多（图
3）. 这说明mRNA的积累与蛋白量在时间段上并非完全对应.
然而，总体来说，强光抑制了mRNA和蛋白的积累，黑暗条件
下二者的积累则有明显增加.
2.4 细胞叶绿素含量的变化
叶绿素含量在强光处理后明显降低（图4-A）. 3 h强光
照后有比较大的降低，9 h时降低到约2.5 pg/细胞，整体呈下
降趋势.
而在黑暗条件下，叶绿素含量逐渐上升，但是变化不是
很大，9 h时含量最高，约为4.9 pg/细胞. 关于叶绿素a/b的变
化，如图4-B所示. 高光胁迫使下，叶绿素a/b比值有较大增
加，从对照值2.07升高到9 h时的3.2左右. 相反，黑暗条件下，
二者的比值有小幅度升高. 因而，强光照不但降低细胞叶绿
素的总含量，而且还使叶绿素a/b的比值降低. 黑暗条件下则
有着相反的作用.
图2 高光和黑暗条件下不同时间段lhcb1 (A)、lchb2.1 (B)、lhcb2.2 (C)、lhcb3 (D)和cao (E)基因的转录变化
Fig. 2 Transcriptive changes of lhcb1 (A), lchb2.1 (B), lhcb2.2 (C), lhcb3 (D), and cao (E) in different periods under high light and dark treatments
□：高光处理；■：黑暗处理 □: High light treatment; ■: Dark treatment
图3 强光及黑暗处理下LHCⅡ蛋白水平的变化
Fig. 3 Changes in LHCⅡunder high light and dark treatments
A：高光处理；B：黑暗处理 A: High light treatment; B: Dark treatment
211 期 陈卫民等：不同光照下盐生杜氏藻光捕获蛋白基因lhcb和叶绿素a合成酶基因cao的表达变化
3 讨 论
自上世纪90年代以来，藻类中的LHCⅡ编码基因在各种
光照的表达已有广泛研究. 然而，研究者通常利用同源探针，
通过Northern杂交对LHCⅡ编码基因的表达进行研究[5]. 由于
光捕获蛋白基因的同源性很高，同源探针往往会非特异地与
其它光捕获蛋白基因结合，因此通过Northern杂交只能反应
整体水平的表达，而不能揭示每条光捕获蛋白基因的表达
情况. 在前期实验中，本实验室已经从盐藻中获得4条lhcb基
因，因而使得系统研究lhcb基因家族在不同环境变化中地表
达成为可能.
环境中的光、温度、水、营养等均能影响植物的光合效
率，其中 LHCⅡ的组成结构在光合作用中起着至关重要的作
用. LHCⅡ复合体的多基因编码亚基在环境变化的过程中，
必然会通过组成结构的变化适应外部条件的变化. 目前的研
究中，只有Teramoto通过荧光定量PCR的方法，较为系统地
研究了lhcb基因家族成员的表达差异 [19]. 结果表明衣藻 lhcb
基因会受到强光的负调控. 在较低的温度和较低浓度的CO2
中，光强是诱发基因表达负调控的因素，但是在持续的不同
光强度环境中各 个基因的变化调节还未见研究报道 . 本文
通 过 把 正常光下生长的盐藻转入到高光 及黑暗环境中，发
现各个基因的表达在高光条件下明显受到抑制. 在3 h时，除
lhcb3外，其它3条基因的表达量最低. 到9 h时，lhcb1、lhcb2.2
和lhcb3的mRNA积累量有少许的恢复. 这说明强光确实强烈
抑制了lhcb基因表达，然而在逐渐适应强光环境的过程中，
推测细胞会波动性地通过未知信号途径调节各个基因的表
达，对LHCⅡ的组成进行调整，从而来保护自身并更好地进
行光合作用[19]. 叶绿素b的量同样调控LHCⅡ复合体数量[12]，
Arabidopsis中叶绿素a加氧酶（CAO）过量表达时，LHCⅡ复
合体的数量会明显增多 [13]. 同样，在我们的实验中，cao基因
的表达在强光下同样受到抑制，说明叶绿素b的合成在高光
胁迫条件的下调是叶绿素和LHCⅡ蛋白组装调节过程中，二
者表达受到光环境得共调节性表达.
在转入黑暗条件下时，发现lhcb各成员的表达明显上调.
跟高光胁迫一样，在适应黑暗环境时，基因的表达逐渐恢复
到一定水平. 这可能是细胞为了增加LHCⅡ结构尺寸来获得更
多的捕获光子来获取能量，在适应过程中逐渐回调各基因
mRNA的水平，同样cao的表达跟lhcb的表达有相同的变化趋
势. 结合前人的研究成果 [5]，认为在光调节过程中，总体上高
光抑制lhcb基因的表达，黑暗条件则诱导表达，而表达过程
中各个基因有着细微的差别. 这种调节可能就是植物适应环
境的一种途径.
同样的处理条件下, LHCⅡ蛋白的量跟mRNA的积累并
不完全一致. 在高光下蛋白的积累量6 h后有较大的减少，黑
暗条件下9 h时有很大的升高. 叶绿素总量以及叶绿素a/b测定
跟以前的报道相似[5]. 由于各蛋白亚基的相似性很高，无法精
确反映各个亚基的变化 . 但结合mRNA积累量的变化，初步
地探讨了植物在持续的不同光环境中是如何调节LHCⅡ各组
成蛋白编码基因，以及叶绿素a加氧酶编码基因的表达，为今
后更好地研究植物在环境中如何调节自身LHCⅡ组成结构变
化奠定了基础.
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图4 强光或黑暗处理后盐藻细胞叶绿素素含量变化（A）和
叶绿素素a/b变化（B）
Fig. 4 Changes in total chlorophyll content (A) and chlorophyll a/b (B)
content in D. salina cells under the high light and dark treatments
□：高光处理；■：黑暗处理 □: High light treatment; ■: Dark treatment
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