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羽扇豆醇对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞侵袭转移作用及机制研究
王 明 1, 崔红霞 2, 孙 超 2, 李 刚 2, 王宏兰 2, 夏春辉 2, 王玉春 2, 刘吉成 2*
(1. 黑龙江中医药大学, 黑龙江 哈尔滨 150040; 2. 齐齐哈尔医学院, 黑龙江 齐齐哈尔 161006)
摘要: 探索狼毒大戟活性成分羽扇豆醇 (lupeol) 对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞侵袭转移的作用, 并对其机
制进行研究。采用细胞黏附实验、transwell 侵袭实验和伤口愈合细胞划痕实验检测羽扇豆醇对人乳腺癌 MDA-
MB-231 细胞侵袭转移能力的作用。Western blot 法测定不同浓度羽扇豆醇处理人乳腺癌后, 侵袭转移相关蛋白
环氧化酶 2 (COX-2)、金属基质蛋白-2 (MMP-2)、MMP-9 和 NF-κB p65 的表达。结果显示, 羽扇豆醇对人乳腺癌
MDA-MB-231 细胞的黏附、迁移和侵袭有明显的抑制作用, 并具有一定的量效关系, 且相关蛋白 COX-2、MMP-2、
MMP-9 和 NF-κB p65 的表达均下调。由此可见, 羽扇豆醇在体外能够有效地抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞的
侵袭和转移, 可能与抑制 COX-2、MMP-2 和 MMP-9 的蛋白表达有关, 其机制可能是抑制了核转录因子 NF-κB
信号途径。
关键词: 羽扇豆醇; 乳腺癌细胞; 侵袭; 转移
中图分类号: R963 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2016) 04-0558-05
Effect of lupeol on migration and invasion of human breast cancer
MDA-MB-231 cells and its mechanism
WANG Ming1, CUI Hong-xia2, SUN Chao2, LI Gang2, WANG Hong-lan2, XIA Chun-hui2,
WANG Yu-chun2, LIU Ji-cheng2*
(1. Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China;
2. Qiqihar Medical College, Qiqihar 161006, China)

Abstract: In this study, we examined the inhibitory effects of lupeol, an extract of Euphorbia fischerana
Steud, on human breast cancer MDA-MB-231 cells migration and invasion. Lupeol was found to inhibit the
invasion of MDA-MB-231 in the cell adhesion assay, transwell test and wound healing assay. The expression
of cyclooxygenase-2 (COX-2), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), -9 (MMP-9) and nuclear transcription
factor-kappa B (NF-κB) p65 in breast cancer following treatment with different concentrations of lupeol was
analyzed with Western blot. Lupeol inhibited the migration and invasion of MDA-MB-231 cells in a dose-
dependent manner in vitro (P < 0.05). The expression of COX-2, MMP-2, MMP-9 and NF-κB p65 levels was
significantly down-regulated. These observations suggest that lupeol can inhibit the abilities of invasion of
MDA-MB-231 cells by inhibiting the protein expression of COX-2, MMP-2 and MMP-9. Its mechanism may
be related to inhibition of the nuclear NF-κB signal pathway.
Key words: lupeol; breast cancer cell; migration; invasion



收稿日期: 2015-10-19; 修回日期: 2015-11-26.
基金项目: 国家自然科学基金青年科学基金资助项目 (81302308); 黑
龙江省自然科学基金资助项目 (H201353).
*通讯作者 Tel /Fax: 86-452-2663103, E-mail: qyybliu@126.com
DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-0948
目前, 乳腺癌已成全世界女性最常见的恶性肿
瘤之一, 发病率呈逐年增高趋势, 严重威胁着女性的
健康 [1-3]。其中三阴性乳腺癌约占乳腺癌人群的
10%～16%[4], 临床发病具有年龄小、增殖活性高、
侵袭能力强和预后差等特点, 受到众多学者们的重
王 明等: 羽扇豆醇对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞侵袭转移作用及机制研究 · 559 ·

视[5]。狼毒大戟作为中药已广泛应用于临床, 其中有
效成分羽扇豆醇具有很好的抗肿瘤活性[6]。但其对乳
腺癌的侵袭和转移是否有作用未见报道, 所以本研
究通过细胞黏附、迁移等行为学实验及 Western blot
方法, 观察不同浓度的羽扇豆醇对人乳腺癌 MDA-
MB-231 细胞侵袭转移能力的影响, 并对其相关机制
进行初步探讨。

材料与方法
主要试剂 羽扇豆醇购自上海宝曼生物科技有
限公司; 胎牛血清 (FBS) 和人工基质胶 matrigel 购自
Hyclone 公司; L-15 培养基、BSA 蛋白浓度试剂盒和
ECL 高灵敏度化学发光试剂盒购自碧云天生物技术
公司; Transwell 小室购自 Costar 公司; 金属基质蛋白
2 (MMP-2)、MMP-9、环氧化酶 2 (COX-2)、核转录
因子 NF-κB 和 NF-κB p65 抗体购自细胞信号公司。
细胞培养 人乳腺癌 MDA-MB-231 购自中国科
学院上海细胞库, 使用含 10% FBS 的 L-15 培养基,
放入 37 ℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养。0.25% 胰
酶消化传代。
羽扇豆醇贮存液的配制 取 6.4 mg 羽扇豆醇溶
于 500 μL DMSO 和乙醇 1∶1 混合的溶液中 (加热促
溶)。即配成 30 mmol·L-1 的母液, 4 ℃保存待用。实验
过程中按需要进行稀释。
MTT 法检测细胞生长 以每孔 7 000 个人乳腺
癌 MDA-MB-231 细胞接种到 96 孔板中。待细胞贴壁
后, 加入羽扇豆醇 (终浓度分别为 0、2.5、5 和 10
μmol·L-1) 置于培养箱中培养 24 h。每孔加 MTT 溶液
(5 mg·mL-1) 20 μL, 继续孵育 4 h, 终止培养, 小心弃
去上清液, 每孔加 DMSO 150 μL, 震荡 10 min, 使紫
色结晶物充分溶解。酶标仪测 OD570, 记录结果。
细胞与 matrigel 黏附实验 用 matrigel 包被 96
孔板, 放置 37 ℃ 60 min 成胶, 弃上清液, 用 2% 的
BSA 封闭 30 min, PBS 洗板 3 次待用。消化乳腺癌
细胞, 使其呈单细胞悬液, 计数, 按每孔 5×104 个细
胞计算, 重悬于 1 mL 完全培养基中, 加入羽扇豆醇
(终浓度分别为 0、2.5、5 和 10 μmol·L-1), 将细胞分
别加入已被 matrigel 包被的 96 孔板中, 每个浓度组
设 3 个复孔, 置于 37 ℃、5% CO2 培养箱中黏附 2 h,
PBS 洗去未黏附的细胞, 0.1% 结晶紫染色 30 min, 显
微镜下记录 5 个视野细胞数, 计算平均值。
细胞侵袭力实验 用 matrigel 稀释液均匀地铺
在 transwell 上室底部膜的内表面, 37 ℃培养箱成胶
30 min, 按每孔 1×105 个细胞重悬于 200 μL 含 1%
血清培养基中, 并分别加羽扇豆醇 (终浓度分别为
0、2.5、5 和 10 μmol·L-1), 加入到上室, 下室加含 10%
FBS 的培养基 600 μL, 培养 24 h。取出小室, 用棉
签擦去上室细胞, 穿过膜的细胞浸泡在甲醇中固定
30 min, 风干后用 0.1% 结晶紫染色 30 min, PBS 冲洗
3 次, 显微镜拍照。染色细胞用 10% 醋酸溶解, 酶标
仪测 OD570, 记录结果。
伤口愈合细胞划痕实验 取 24 孔板, 用 marker
笔在板底均匀画横线, 作为标记。每孔加 5×105 个细
胞 , 细胞贴壁后 , 用枪头垂直于背后的横线划痕 ,
PBS 洗去掉落的细胞, 加入羽扇豆醇 (终浓度为 0、
2.5、5和 10 μmol·L-1), 用含 1% FBS的培养基培养, 24
h 镜下拍照。通过测定各划痕在对应时间点的宽度计
算细胞迁移的距离。计算公式为: 细胞迁移距离 = (0
h 划痕宽度 - 各时间点划痕宽度) / 2。
Western blot 人乳腺癌 MDA-MB-231 按 2×106
个细胞种于 6 cm 培养皿中, 培养过夜, 待细胞贴壁后
加入相应浓度 (0、2.5、5 和 10 μmol·L-1) 的羽扇豆
醇。加药后 24 h 提取总蛋白。细胞用细胞裂解液 50 μL
冰上充分裂解 30 min。12 000 r·min-1 4 ℃离心 15 min,
收集上清液, 采用 BSA 法测定蛋白浓度。取 30 μg 蛋
白样品进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳, 转膜后, NC
膜用 5% 脱脂奶粉封闭, 4 ℃过夜。加入抗 MMP-2 (1∶
1 000)、MMP-9 (1∶1 000) 和 COX-2 (1∶1 000) 的抗
体室温 3 h。TBST 洗膜 3 次。加入相应的二抗 (1∶
5 000), 室温 2 h, 1×TBST 洗膜 3 次。用 ECL Western
blot 化学发光试剂盒显色检测, 以 GAPDH 为内参。
统计学方法 应用 SPSS 13.0 统计软件进行结
果分析。计量资料均以 x ± s 表示, 多组间比较采用
One-Way ANOVA, 两组间比较采用 Q 检验。

结果
1 羽扇豆醇对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞 24 h 生
长和凋亡的影响
采用 MTT 法和流式细胞术分别检测羽扇豆醇对
人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞生长和凋亡的影响, 统
计分析结果显示, 2.5、5、10 μmol·L-1 羽扇豆醇作用
24 h 对细胞生长和凋亡均无显著影响 (P > 0.05), 结
果如图 1A～C 所示。
2 羽扇豆醇对人乳腺癌 MDA-MB-231 与 matrigel
黏附能力的影响
为明确羽扇豆醇是否对人乳腺癌 MDA-MB-231
的黏附有抑制作用, 采用细胞黏附实验测定不同浓
度羽扇豆醇处理的人乳腺癌 MDA-MB-231 的黏附能
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Figure 1 Effect of lupeol on the proliferation (A) and apoptosis (B, C) of MDA-MB-231 breast cancer cells for 24 h (P > 0.05)

力。如图 2 所示, 随羽扇豆醇浓度增加, 细胞的黏附
数逐渐减少, 呈浓度依赖关系 (P < 0.01)。
3 羽扇豆醇对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞侵袭能
力的影响
由于人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞恶性程度高,
侵袭能力强, 所以本实验采用 transwell 小室检测肿
瘤细胞对细胞外基质的侵袭作用, 以不同浓度的羽
扇豆醇处理人乳腺癌 MDA-MB-231, 观察计算各组
侵袭率的变化。实验结果如图 3 显示, 随着浓度的增
加, 肿瘤细胞侵袭能力逐渐降低, 差异具有统计学意
义 (P < 0.05)。
4 羽扇豆醇对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞迁移能
力的影响
通过伤口愈合细胞划痕实验可观察到, 正常组细
胞在 24 h 后几乎完全愈合, 而经羽扇豆醇处理过的人
乳腺癌 MDA-MB-231 迁移能力受到抑制, 且药物浓
度越大, 迁移抑制率越大, 呈一定浓度依赖关系, 差
异具有显著性 (P < 0.05), 如图 4 所示。


Figure 2 Lupeol suppressed cell adhesion to matrigel in
MDA-MB-231 cells. The numbers of cell adhesion were shown
as x ± s. **P < 0.01 vs control group


Figure 3 Lupeol suppressed invasion of MDA-MB-231 cells (magnification×100). The optical densities at 570 nm of migration and
invasion cells were shown as x ± s. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group


Figure 4 Lupeol suppressed migration of MDA-MB-231 cells (magnification×40). The migration distance of cells were shown as
x ± s. *P < 0.05 vs control group
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5 羽扇豆醇对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞相关蛋
白的表达影响
经羽扇豆醇处理后的人乳腺癌 MDA-MB-231 中
COX-2、MMP-2 和 MMP-9 的蛋白表达量均随药物浓
度的增高而降低。结果如图 5 所示。
6 羽扇豆醇对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞相关机
制蛋白影响
经羽扇豆醇处理后的人乳腺癌 MDA-MB-231 细
胞中 NF-κB 的表达量没有显著差异, 而 NF-κB p65
的表达量随药物的浓度增高而降低 (图 6)。

讨论
肿瘤侵袭转移是非常复杂的过程, 肿瘤细胞从
原发部位脱离, 分泌金属蛋白酶 (MMPs), 特别是明
胶酶MMP-2和MMP-9可降解周围基质, 使肿瘤细胞
进入血液循环或淋巴循环。进入循环的肿瘤细胞大部
分仍不能逃避免疫系统的监控而被杀死。然而活力较
高、活性较强的肿瘤细胞能与血小板黏附, 逃避免疫
系统的杀伤。当肿瘤细胞被微血管捕获, 或黏附在内
皮细胞壁上时, 向血管外迁移, 在远隔器官形成新的
转移灶[7]。此过程中肿瘤细胞分泌的金属蛋白酶是重
要的调控因子, 也是癌症转移的开始。
近年来, 学者们发现炎症也与肿瘤有着密切的
关系, 在炎症环境中细胞因子和自由基等炎性应答
可引起基因表达变化及翻译后修饰不稳定, 从而增
加肿瘤发生的机会[8]。COX 是催化花生四烯酸转化为
前列腺素的关键酶, 有 COX-1 和 COX-2 两种亚型。
COX-2 在许多实体瘤中呈过度表达, 与肿瘤的发生、
发展高度相关, 也是加速癌症转移的驱动力, 更是预
后不良的独立指标[9, 10]。在乳腺癌患者中 COX-2 亦
过表达, 促进转移, 且预后差。临床上虽有 COX-2 抑
制剂可控制, 但是由于不良反应仍限制其使用[11, 12]。
所以在分子生物学和分子药理学飞速发展的今天 ,
中药抗肿瘤越来越受到人们的关注, 近几年, 从中药


Figure 5 Lupeol inhibited COX-2, MMP-2 and MMP-9 protein expression. The GAPDH was used as a loading control. *P < 0.05,
**P < 0.01 vs control group


Figure 6 Effect of lupeol on NF-κB signal pathway in human MDA-MB-231 cells. NF-κB and NF-κB p65 were determined by Western
blot analysis. The GAPDH was used as a loading control. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group
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中寻找毒副作用小、作用明显的抗癌活性成分已取得
一系列成果[13]。研究发现这些成分能够诱导细胞凋
亡、抑制血管生成及其侵袭转移能力[14]。
本实验选取中药狼毒大戟的提取物三萜类化合
物羽扇豆醇[15], 具有很好的抗癌活性[16, 17]。细胞模型
选用高转移能力的三阴性人乳腺癌 MDA-MB-231。
本次实验利用人工基底胶 matrigel 作为黏附基质, 因
为其成分与组织基底膜相似, 可模拟体内环境, 研究
细胞与细胞外基质的相互作用。肿瘤细胞降解
matrigel 后穿越的细胞数越多代表其侵袭能力越强。
从实验结果可以看出, 羽扇豆醇能够有效地抑制肿
瘤的侵袭和转移, 并呈一定的浓度依赖性。
NF-κB 是一种重要的核转录因子, p65 和 p50 构
成的二聚体存在于细胞浆中。当细胞受到刺激后可活
化进入细胞核中, 调节相关目的基因的表达。MMP-9
基因的启动子上含有 NF-κB 等多个结合位点, 通过这
些结合位点 NF-κB 可诱导 MMP-9 的表达[18]。Western
blot 方法检测羽扇豆醇处理人乳腺癌 MDA-MB-231
细胞后发现, 金属蛋白酶 MMP-2、MMP-9 和 COX-2
随着浓度升高而表达量降低, 其机制可能是下调了
核转录因子 NF-κB p65, 支持了羽扇豆醇能降低人乳
腺癌 MDA-MB-231 细胞的侵袭转移能力的结果。
总之, 羽扇豆醇能够有效地抑制人乳腺癌 MDA-
MB-231 的侵袭转移, 其机制可能是下调 MMP-2、
MMP-9、COX-2 及相关 NF-κB 信号通路的表达, 为
中药抗肿瘤提供了新的思路和方向。
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