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决明毛状根、实生根及决明子的化学成分比较研究



全 文 :第38卷 第8期 西 南 师 范 大 学 学 报 (自然科学版) 2013年8月
Vol.38  No.8   Journal of Southwest China Normal University(Natural Science Edition) Aug.2013
文章编号:1000-5471(2013)08-0114-05
决明毛状根、实生根及决明子的化学成分比较研究①
李素红1,2, 章艳玲3, 谭 燕1,
米 瑶1, 黄 靖1, 南志奇1, 李关荣1
1.西南大学 南方山地农业教育部工程研究中心,重庆400716;2.山东天地园艺科技有限公司,山东 泰安271000;
3.新乡学院 化学与化工学院,河南 新乡453003
摘要:通过比较决明毛状根、无菌实生根及决明子中的有效成分,得知决明毛状根中的可溶性蛋白、水解和游离氨
基酸、Fe、Mn、Zn含量均高于实生根和决明子;结合蒽醌、游离蒽醌、粗脂肪、不饱和脂肪酸含量低于实生根及决
明子;总糖、还原糖和可溶性糖含量均显著低于实生根;Mg和Ca含量高于实生根,但低于决明子,Cu含量与实
生根相当,但低于决明子.这为毛状根的综合利用提供了理论依据,为毛状根培养技术的改进提供了可能的方向.
关 键 词:毛状根;实生根;决明子;成分;比较分析
中图分类号:R282.2 文献标志码:A
决明子为豆科决明属钝叶决明(Cassia obtusifolia L)或小决明(Cassia tora L)的干燥成熟种子,因其
有明目之功而得名.决明子始载于《神农本草经》,性味甘、苦、微寒,归大肠经,具有清热明目,润肠通便
的功效[1],主治目赤涩痛,羞明多泪,头痛眩晕,目暗不明,大便秘结[2].
毛状根培养是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术,它将发根农杆菌
(Agrobacterium rhizogenes)Ri(root inducing)质粒中的T-DNA整合到植物细胞的DNA上,诱导植物细
胞产生毛状根,毛状根培养是获得有用次生代谢产物的重要途径[3],具有生长迅速、合成能力高和遗传性
稳定等优点.利用毛状根培养技术生产次生代谢物极具工业生产潜力,已引起人们的广泛注意并得到飞跃
的发展[4].虽然目前已经有关于毛状根培养体系的研究报道[5-7],但毛状根与实生根乃至决明子的成分差
异尚无研究报道.本研究首次系统比较决明毛状根、实生根以及决明子的成分差异,为改进决明毛状根的
批量培养,工厂化生产优质决明毛状根提供有价值的参考.
1 仪器及材料
1.1 仪 器
索氏提取仪,日立L-8800氨基酸分析仪;SZF-06A粗脂肪测定仪(上海精密科学仪器有限公司);气相
色谱仪(岛津GC2100);TA5-990型原子吸收分光光度计
1.2 材料及实验设计
挑选本研究所自产的籽粒饱满的钝叶决明,洗净,80℃烘干,粉碎后备用;取用发根农杆菌C58C1(由
西南大学生命科学学院赠送)诱导钝叶决明(Cassia obtusifolia L)产生且完全除菌的毛状根和无菌条件下
培养的实生根,用无菌水将其上的培养基残留彻底冲洗干净,吸干,烘干,粉碎后备用.
① 收稿日期:2012-04-11
作者简介:李素红(1986-),女,山东阳谷人,硕士,主要从事药用植物学方面的研究.
通信作者:李关荣,教授,博士.
DOI:10.13718/j.cnki.xsxb.2013.08.016
2 方  法
2.1 蒽醌含量的测定
混合碱液法[8](根据文献进行改进).
2.1.1 标准曲线的制作
精密称取3.6mg的1,8-二羟基蒽醌,于50mL容量中并用甲醇溶解并稀释至刻度.精密量取上述标
准液0.50,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00mL,分别放人25mL容量瓶中,在水浴上蒸去甲醇,加5%氢氧化
钠-2%氢氧化铵混合碱液至刻度,摇匀,30min后比色,以5%氢氧化钠-2%氢氧化铵混合碱液为空白
对照,509nm处绘出光密度—浓度的曲线.
2.1.2 总蒽醌含量的测定
称取0.5g左右的样品于索氏提取器中加2.5mol/L硫酸30mL回流水解2h,稍冷后过滤,用滤纸将
滤渣包好后全部置于抽提器内,加50mL左右的氯仿于抽提瓶内,安装好装置后,打开电源,设置温度到
100℃,从溶剂挥发后开始计时,大约3h后关闭调节旋塞,进行溶剂回收,回收结束后,取约20mL混合
碱液于抽提瓶内,待抽提瓶内的蒽醌全部溶解后将蒽醌溶液收集起来,重复上述操作直至氯仿液无色,合
并蒽醌溶液,并用混合碱液将蒽醌溶液定容至合适的体积,以混合碱液为空白对照,30min后在509nm
处测其吸光值.
2.1.3 游离蒽醌含量的测定
称取0.5g左右的样品用滤纸包好后置于抽提器内,下同总蒽醌含量的测定
2.2 可溶性蛋白的测定
考马斯亮蓝法[9].
2.3 氨基酸的测定
1)水解样品前处理:
准确称取样品200mg于18×180mm的试管中,向盛有样品的试管加入14mL 6mol/L HCl,振荡混
匀.用酒精喷灯把该试管口下1/3处拉细到4~6mm,抽真空10min后封管.处理过的试管置于110℃±
1℃恒温烘箱中沙浴水解22h,拿出后冷却至室温,摇匀过滤,取1mL滤液倒入50mL烧杯中,置于
60℃恒温水浴锅中蒸干滤液.然后加入0.02mol/L HCl释4倍,用0.45μm滤膜过滤后上机.
2)游离样品前处理:
准确取样品500mg,于50mL烧杯中,加入20mL 4%磺基水杨酸溶液,震荡摇匀,超声波提取
30min后,于16 000r/min离心15min.用0.45μm滤膜过滤后上机.
3)用日立L-8800型全自动氨基酸分析仪按照下列条件进行测定:
一个样品分析周期53min.分析仪采用两个泵和两根柱.即洗脱液经泵1流经分离柱,泵压14.522
kPa,流速0.45mL/min,柱温70℃;茚三酮经泵2流经反应柱,泵压1.098kPa流速0.35mL/min,反应
柱,(4.6mm×60mm)柱温135℃.
色氨酸的测定采用对二甲氨基苯甲醛法[10].
2.4 脂肪的测定
2.4.1 粗脂肪含量的测定(SZF-06A粗脂肪测定仪)
用烘盒称取2~5g粉碎的样品,在105℃下烘30min,趁热倒入烘至恒重的研钵中,研磨到出油后,
用脱脂棉蘸少量乙醚擦净研钵上的试样和脂肪,用滤纸包好后全部置入抽提器内,称重m1.在抽屉瓶内注
入无水乙醚约50mL,安装好装置后,打开电源,设置温度到60℃,从溶剂挥发后开始计时,大约3h后
关闭调节旋塞,进行溶剂回收,回收结束后,把抽提器置入烘箱内烘去水分,称重m2,最后计算含油量.
2.4.2 脂肪酸的测定
取样品0.2g左右,放入研体中研碎后转入15mL离心管中,加入混合液(石油醚∶乙醚=1∶1)
4mL,氢氧化钾-甲醇溶液(0.4mol/L)2mL;常温(25℃)超声提取15min;加入纯水4mL,静置
30min;吸取上清液1mL转入进样瓶,用气相色谱仪(岛津GC2100)测定.以标准脂肪酸色谱确定样品中
的脂肪酸种类,以峰面积确定其含量.
511第8期        李素红,等:决明毛状根、实生根及决明子的化学成分比较研究
2.5 碳水化合物的测定
2.5.1 还原糖和总糖的测定
3,5-二硝基水杨酸法[9].
2.5.2 可溶性糖的测定
蒽酮法[9].
2.6 矿质元素的测定
称取样品0.5g置入25mL锥形瓶中,加入混酸(硝酸∶高氯酸=3∶1)15mL,静置过夜,电热板上适
当温度下加热硝化直至液体澄清,未澄清者反复加入适量混酸,使其澄清为止,转移入25mL容量瓶用
1%硝酸定容(Ca,Mg再稀释12.5倍),上TA5-990型原子吸收分光光度计测定其含量.
3 结果及分析
3.1 蒽醌含量及分析
经混合碱液法测得决明毛状根、实生根及决明子中的游离蒽醌含量分别为0.119%,0.232%,0.629%,
结合蒽醌的含量分别为0.112%,0.187%,0.286%.无论是结合蒽醌还是游离蒽醌,毛状根中的含量均低
于实生根和决明子.经Duncans新复极差法(spss18.0)检测,3种材料中结合蒽醌的含量差异已经达到显
著水平(*p<0.05),决明子中的游离蒽醌含量显著高于毛状根和实生根,但毛状根和实生根中的游离蒽
醌含量差异没有达到显著水平.
3.2 可溶性蛋白含量及分析
用考马斯亮蓝法测得决明毛状根、实生根及决明子中的可溶性蛋白含量分别是40.96,18.60和130.38
mg/g,毛状根中的可溶性蛋白含量高于实生根但低于决明子,约为实生根的2.2倍,但仅为决明子的
31.4%.经Duncans新复极差法(spss18.0)检测,3种材料中的可溶性蛋白含量差异都已达到显著水平
(*p<0.05).
3.3 氨基酸含量及分析
氨基酸分析仪测得决明毛状根、实生根及决明子中的氨基酸含量见表1.
表1 决明毛状根、实生根及决明子中的氨基酸含量
毛状根
(水解)
毛状根
(游离)
无菌实生根
(水解)
无菌实生根
(游离)
决明子
(水解)
决明子
(游离)
天门冬氨酸 12.338  159.184  3.255  20.324  1.610  27.899
*苏氨酸 0.075  125.34  0.555  46.475  0.631  52.888
丝氨酸 0.531  3164.71  0.605  379.795  0.862 -
谷氨酸 1.790  98.14  1.835  19.514  2.281  27.304
甘氨酸 0.726  15.055  0.712  6.215  0.792  3.527
丙氨酸 1.032  231.501  1.064  103.259  0.834  8.944
胱氨酸 0.141 - - 4.874  0.318  3.139
*缬氨酸 0.793  42.007  0.856  17.618  0.834  4.674
*蛋氨酸 0.123  0  0.115  3.656  0.164  2.078
*异亮氨酸 0.626  37.825  0.704  13.350  0.651  1.498
*亮氨酸 1.034  46.144  1.131  14.965  1.308  0.556
酪氨酸 0.467  72.397  0.387  17.850  0.473 -
*苯丙氨酸 0.657  63.269  0.660  23.634  0.844  6.870
*赖氨酸 0.742  29.084  0.784  12.043  0.987  4.292
组氨酸 - 210.322 - 13.629  0.698  4.819
精氨酸 1.295  470.859  0.679  29.020  1.211  6.634
脯氨酸 0.880  33.704  0.656  96.050  0.521 -
*色氨酸 0.312  79.259  0.214  118.688  0.197  85.392
总氨基酸 23.562  4878.800  14.212  940.959  15.216  240.514
  注:水解液氨基酸单位:g/100g;游离氨基酸单位:mg/100g;“-”未检测出的氨基酸;“*”必需氨基酸.
决明毛状根、实生根及决明子水解液总氨基酸含量分别为23.562,14.212和15.216g/100g,毛状根
中的氨基酸含量明显高于实生根和决明子;3种材料中的必需氨基酸含量分别为4.362,5.019和5.616g/
100g,毛状根中必需氨基酸含量最低,毛状根和实生根中含量最高的氨基酸都是天门冬氨酸,决明子中含
611 西南师范大学学报(自然科学版)     http://xbbjb.swu.cn    第38卷
量最高的却是谷氨酸
决明毛状根、实生根和决明子中游离氨基酸含量分别为4 878.800,940.959和240.514mg/100g.3种
材料中总游离氨基酸含量差别很大,其中毛状根中的含量最高,分别约为实生根和决明子中含量的5倍和
20倍.3种材料中的游离必需氨基酸含量分别为422.928,250.429和158.248mg/100g,毛状根游离必需
氨基酸含量最高,决明子含量最低.决明子中含量最高的游离氨基酸是色氨酸,毛状根和实生根中含量最
高的游离氨基酸均为丝氨酸.
3.4 脂肪及脂肪酸含量及分析
3.4.1 粗脂肪的含量
用SZF-06A粗脂肪测定仪测得决明毛状根、实生根及决明子中的粗脂肪含量分别为1.91%,2.32%和
15.69%,毛状根中的粗脂肪含量低于实生根和决明子.经Duncans新复极差法(spss18.0)检测,决明子中
的粗脂肪含量和其他两种材料中的粗脂肪含量差异已达到显著水平(*p<0.05),但毛状根和无菌实生根
中的粗脂肪含量差异没有达到显著水平.
3.4.2 脂肪酸的含量
用液相色谱测得的脂肪酸含量结果见表2.
从表2可以看出毛状根、实生根和决明子中的不饱和脂肪酸含量都相对高,分别占其总脂肪酸的
70%,75.4%和75.7%.可见,毛状根的不饱和脂肪酸含量低于实生根和决明子.
表2 决明毛状根、实生根及决明子中的脂肪酸含量
毛状根 实生根 决明子
棕榈酸含量/% 25.9  20.7  16.1
硬脂酸含量/% 4.2  2.2  5.1
油酸含量/% 15.4  6.5  33.8
亚油酸含量/% 39.4  28.9  40.4
亚麻酸含量/% 15.2  40.0  1.5
图1 决明毛状根、实生根
及决明子中的碳水化合物含量
3.5 碳水化合物含量
用3,5-二硝基水杨酸法和蒽酮法分别测得的3种
材料中总糖的含量分别为635.19,755.25,619.32
mg/g,还原糖的含量分别为58.88,84.46,45.53mg/g,
可溶性糖的含量分别为39.92,75.17,34.76mg/g,
可以看出3种材料中的3种碳水化合物含量均以实生
根含量最高,毛状根和决明子中含量相当.经
Duncans新复极差法(spss18.0)检测3种碳水化合物
在实生根中的含量与在毛状根和决明子中的含量差异
都达到了极显著水平,但毛状根和决明子的含量差异
没有达到显著水平.见图1,图中不同小写和大写字母表示经Duncan,s新复极差法(spss18.0)检测差异显
著(*p<0.05)和极显著(**p<0.01).
3.6 矿质元素的含量
决明毛状根、实生根及决明子中的重要矿质元素含量测定结果见表3.从表3可以看出,3种材料中含
量最高的元素都是 Mg,Fe,Mn,Zn在毛状根中的含量均高于决明子和无菌实生根中的含量,毛状根中的
Mg和Ca均显著低于决明子但高于实生根,毛状根和实生根中的Cu含量相当,但均低于决明子中的含量.
表3 决明毛状根、实生根及决明子中的部分矿质元素含量
毛状根/(μg·g
-1) 实生根/(μg·g
-1) 决明子/(μg·g
-1)
Mg 999.68  772.34  1 221.563
Fe  463.31  145.46  83.713
Ca  81.41  15.66  764.375
Mn  93.61  18.50  7.575
Cu  9.363  9.74  13.275
Zn  146.98  70.51  75.213
711第8期        李素红,等:决明毛状根、实生根及决明子的化学成分比较研究
4 讨论与结论
随着毛状根培养技术的完善,通过毛状根培养来获得大量的次生代谢产物已越来越普遍.本研究首次
系统比较了决明毛状根、实生根及决明子中的成分含量差异.结果发现,毛状根的可溶性蛋白、水解液氨
基酸、游离氨基酸、必需氨基酸、Fe、Mn、Zn的含量均显著高于实生根和决明子;其 Mg、Ca含量高于实
生根,Cu含量与实生根相当.毛状根的这些成分优于实生根和决明子,可能与培养基的营养物质成分组成
和培养条件有关.毛状根也存在一些不足,如其重要的药用成分蒽醌(结合蒽醌和游离蒽醌)、粗脂肪、不
饱和脂肪酸均低于实生根和决明子;其总糖、还原糖和可溶性糖含量低于实生根;矿质元素中 Mg、Ca、Cu
含量均低于决明子.而且蒽醌是决明子具有明目、泻下、降压等功效的主要成分,所以也是以后毛状根改
进的主要方向.该研究确定了毛状根成分含量的优点和不足,这为毛状根培养技术的改进提供了理论基
础,或许通过改变毛状根培养过程中的一些物理和化学因素,会使毛状根中的营养成分更接近决明子,从
而增加其药用价值,使决明的毛状根诱导培养体系更为完善和实用.
参考文献:
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Comparative Analysis on the Components of the Hairy Root,
Seedling Root and Seed of Cassia Obtusifolia L
LI Su-hong1,2, ZHANG Yan-ling3, TAN Yan1, MI Yao1,
HUANG Jing1, NAN Zhi-qi 1, LI Guan-rong1
1.Engineering Research Center of South Upland Agriculture,Ministry of Education,Southwest University,Chongqing 400716,China;
2.Shandong Tiandiyuanyi Company,Taian Shandong 271000;
3.Colege of Chemistry and Chemical Engineering,Xinxiang University,Xinxiang Henan 453003,China
Abstract:By comparison of the contents of the effective components in the hairy root,aseptic seedling root
and seed of Cassia obtusifolia L.,it has been found that the contents of soluble protein,hydrolysate and
free amino acids,Fe,Mn and Zn in the hairy root are al higher than those in the seedling root or in Cassia
semens;the contents of conjugated and free anthraquinones,crude fats and unsaturated fatty acids in hairy
root are lower than those in the seedling root or in Cassia semens;the contents of total sugar,reducing and
soluble sugar in the hairy root are significantly lower than those of the seedling root;the contents of Mg
and Ca in the hairy root are higher than those in the seedling root but lower than those in Cassia semens;
the content of Cu in the hairy root is comparable to that in the seedling root but lower than that in Cassia
semens.These results provide theoretical basis for the comprehensive utilization and potential directions
for the improvement of the hairy root culture.
Key words:hairy root;seedling root;Cassia semens;components;comparative analysis
责任编辑 汤振金    
811 西南师范大学学报(自然科学版)     http://xbbjb.swu.cn    第38卷