全 文 ：第 25卷第 4期　　　　　　　　　　　　湖北民族学院学报(自然科学版)　　　　　　　　　 　　　　 Vol.25　No.4
2007年 12月　　 　　　　　　JournalofHubeiInstituteforNationalities(NaturalScienceEdition)　 　 　　　　　 Dec.2007
收稿日期:2007-08-15.
基金项目:国家科技攻关计划项目(2003BA901A057).
作者简介:马琼(1979-),女 ,硕士,讲师 ,主要从事植物病害及益生菌方面的研究.
魔芋软腐病拮抗菌的分离及抗性研究
马　琼
(湖北民族学院 生物科学与技术学院;湖北省生物资源保护与利用重点实验室 ,湖北恩施 445000)
摘要:从发病魔芋植株中分离筛选获得拮抗菌株 BJ-1,通过抑菌试验和抗菌粗蛋白提取物的制备 , 对该菌的
拮抗作用做了初步研究 ,发现菌株 BJ-1具广谱抗菌活性 ,对软腐病原菌有较强的抗菌作用.
关键词:魔芋;软腐病;拮抗;分离
中图分类号:S432.4+2 文献标识码:A 文章编号:1008-8423(2007)04-0455-03
魔芋(AmorphophalusRivieriDurieu)属天南星科魔芋属草本植物 ,是我国重要的经济作物之一 ,其种植
面积大 ,且魔芋产品前景广阔.但是 ,由于软腐病等主要病害逐年加重 ,导致魔芋面积和产量滑坡 ,魔芋软腐
病已成为魔芋高产的最大障碍.魔芋软腐病的防治一直是一个研究热点和难点 ,几十年来国内外研究者对此
都做了大量的研究.由于软腐病发病受内在和外在诸多因素的影响 ,而且病原多种多样 ,因此 ,找到有效的防
治方法十分困难.有关魔芋软腐病化学防治的报道较多 ,但生物防治研究较少 ,本试验从发病魔芋植株中分
离筛选出拮抗菌株 BJ-1,通过拮抗试验和拮抗物质的分离 ,对该菌的拮抗作用作了初步研究 ,现将试验方
法及结果报告如下.
1　材料与方法
1.1　材料
分离材料为魔芋植株 ,供试土壤为魔芋的根际土壤 ,均采自湖北民族学院魔芋种植园.
1.2　方法
1.2.1　拮抗菌的分离与筛选
1.2.1.1　分离拮抗菌　从植株中分离拮抗菌:将从田间采回的供试健康 、病魔芋植株洗净 ,再将植株的地下
球茎 、地上茎 、叶等组织分别取 2.5g,用无菌水漂洗 3次 ,研碎.分别挑取研碎组织适量 ,置于装有无菌水的
250ml的锥形瓶中 , 28℃下以 120r/min转速于摇床保温培养 12h.然后用移液管分别吸取 1ml培养液涂布
于 PDA平板上 ,将平板置于 28℃恒温培养箱中培养 , 48h后挑取培养特征相异的单个菌落纯化.
从根际土壤中分离拮抗菌:采集魔芋健康 、病株根际土壤 ,在 PDA(分离真菌和细菌的常用培养基)平板上 ,采
用稀释平板分离法对根际微生物进行分离.根据分离平板上菌落的大小 、形态和颜色 ,挑取单菌落纯化.
1.2.1.2　软腐病拮抗菌的初筛　采用对峙培养法 ,在 PDA平板上 ,用软腐病菌菌株作初步拮抗测定 ,每菌
株设 3个重复.培养 2 ～ 3d后 ,每天观测软腐病菌菌株和待测菌株的生长情况 ,根据拮抗带确定拮抗程度.
拮抗带大于 1mm的菌株记为有拮抗作用 ,拮抗带宽度大于 5mm的菌株记为强拮抗细菌 ,筛选出对软腐病菌
菌株有拮抗作用的菌株.
1.2.2　拮抗菌 BJ-1的拮抗广谱性试验
采用 PDA培养基 ,金黄葡萄球菌﹑枯草杆菌 ,大肠杆菌 3种细菌作指示菌 ,进行拮抗性广谱性试验 ,每
菌株设 3个重复.28℃下培养 3d后 ,每天观测指示菌和待测菌株的生长情况 ,根据拮抗带宽度确定拮抗程
度.
1.2.3　拮抗菌 BJ-1培养基的筛选
制备 5种不同的固体培养基:PDA培养基 、LB培养基 、魔芋精粉培养基 、魔芋精粉 +LB培养基 、蔗糖 +
LB培养基 ,进行 BJ-1培养基的筛选试验 ,为选择分离抗菌物质的培养基提供依据.
表 1　拮抗菌的粗筛
Tab.1　Theresultofscreening
菌株 拮抗带宽度/mm 菌落大小(长＊宽)/mm 软腐菌落大小(长＊宽)/mm
JBG-1 10 20＊25 10＊25
BJ-1 12 10＊20 18＊25
MQ-1 5 19＊20 20＊22
1.2.4　抗性研究
1.2.4.1　粗蛋白提取物的制备　植物内生菌的防病机理主要表现在通过产生蛋白质类 、抗生素类 、水解酶
类 、植物生长调节剂和生物碱类物质 ,与病原菌竞争营养物质 ,增强宿主植物的抵抗力以及诱导植物产生系
统抗性等途径抑制病原菌生长.本研究以抗菌蛋白类物质为研究对象 ,提取制备粗蛋白 ,制备方法如下:将
BJ-1接入装有 100ml发酵培养基的 250ml三角瓶中 , 28℃下 120r/min振荡培养.培养 96h后 ,取培养液于
5 000r/min离心 10min,得到上清液.上清液中加入硫酸铵至 70%饱和度 , 4℃静置过夜 ,于 5 000r/min, 4 ℃
下离心 10min,弃上清液 ,沉淀.沉淀物用 50mmol/L, pH8.0的 Tris缓冲液悬浮 ,加蒸馏水透析 2d,除盐 ,获
得抗菌物质粗蛋白溶液.
1.2.4.2　蛋白质浓度测定　采用考马斯亮蓝法制作蛋白质标准曲线.配制系列浓度牛血清蛋白标准溶液 ,
在 595nm处测出标准溶液的吸光度 ,然后以吸光度为纵坐标 ,标准溶液的蛋白质浓度为横坐标作图 ,得到 A
-C标准曲线.在完全相同的条件下测定待测样品的吸光度 ,并从标准曲线上读出其蛋白浓度.
1.2.4.3　粗蛋白抑菌效果研究　250ml三角瓶盛装 PDA培养液 ,分别接种大肠杆菌和软腐病原菌 ,于 28℃
摇床培养 24h.在无菌条件下 ,用移液管分别吸取大肠杆菌和软腐病原菌的培养物 3ml于 10ml试管中 ,各管
加入 1ml粗蛋白溶液 ,每组 3个重复 , 1个对照.将培养物置于 28℃摇床培养 24h后 ,用分光光度计测吸光
度 ,比较抑菌效果.
2　结果与分析
2.1　BJ-1拮抗菌的分离
从魔芋植株分离获得 BJ-1等培养特征相异的 13个菌株 ,从根际土壤分离获得的 28个菌株 ,所获菌株
均经 3次纯化后 ,移至斜面培养基上保存备用.
对分离出的菌种进行粗选 ,获得拮抗带宽度大于 5mm的
3个菌株:BJ-1、JBG-1、MQ-1.试验发现从发病植株
中分离获得的编号为 BJ-1的内生菌对魔芋软腐病有较
强的抑菌作用 ,其拮抗带宽度达到 10mm(表 1),而从发
病魔芋根际土壤筛选的菌种拮抗效果弱或无拮抗效果.
将初筛所得的 3个菌株再次进行复筛试验 ,经多次测定 ,获得拮抗效果好 ,拮抗带宽仍保持在 10mm以
上的拮抗细菌 BJ-1,将编号为 BJ-1的拮抗菌作为软腐病的生物防治菌株进一步研究.通过拮抗广谱性试
验 ,表明内生拮抗菌 BJ-1对金黄色葡萄球菌 、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌 3种指示细菌均有较强的拮抗作
用 ,拮抗带宽度均大于 5mm,说明 BJ-1具有广谱抗菌活性.其中 ,拮抗菌 BJ-1对大肠杆菌的拮抗作用最
强 ,拮抗带宽度为 11mm.
2.2　拮抗菌 BJ-1培养基的筛选结果
经 24h培养 ,拮抗菌 BJ-1在 5种培养基上的生长情况比较为:魔芋精粉 +LB培养基 >魔芋精粉培养
基 >PDA培养基 >蔗糖 +LB培养基 >LB培养基.
在魔芋精粉 +LB培养基上 ,拮抗菌生长旺盛 ,菌落为乳白色 ,呈丝状向周围延伸.随着培养时间的延长 ,
菌落逐渐长大 , 24h后菌落布满整个培养皿.菌落较厚 ,不光滑 ,有褶皱 ,用手指轻摸可将菌层抹起.
可见 ,所选用 5种培养基中 ,拮抗菌 BJ-1最适培养基为魔芋精粉 +LB培养基 ,故选用该种培养基做拮
抗菌 BJ-1的抗菌物质研究.
2.3　粗蛋白提取物的抑菌效果
发酵液通过离心 、盐析 、透析脱盐等预处理 ,获得粗蛋白提取物 ,考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度.图 1为
蛋白质标准曲线 ,线性方程为 y=39.156x+0.006,相关系数为 0.994 4.根据标准曲线计算粗蛋白提取物的
蛋白质浓度为 0.67mg/ml.
添加粗蛋白和不添加粗蛋白(对照)的大肠杆菌和软腐病原菌培养物在 595nm处分光光度计测定光浊
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图 1　蛋白质标准曲线
Fig.1　Standardcurveofprotein
度值 ,比较抑菌效果 ,添加有粗蛋白的软腐病
原菌培养物的光浊度值为 1.164,大肠杆菌培
养物的光浊度值为 1.923,未加粗蛋白的软腐
病原菌培养物的光浊度值为 1.865,大肠杆菌
培养物的光浊度值为 1.969 ,可见加入粗蛋白
的培养物光浊度值均小于未加粗蛋白的对照培
养物 ,说明粗蛋白提取物对软腐病原菌及大肠
杆菌均有拮抗作用.且粗蛋白提取物对软腐病
原菌有更强的拮抗作用.
3　结论与讨论
目前国内运用植株内生拮抗菌对魔芋病害进行生物防治的研究还处在起步阶段 ,本试验采用对峙培养
法对内生拮抗菌 BJ-1作了抗性研究和广谱拮抗菌实验 ,所获得的拮抗菌 BJ-1对软腐病原菌具有较强的
拮抗作用 ,拮抗菌 BJ-1具有广谱抗菌活性 ,是一种广谱性拮抗菌.从发酵液获得粗蛋白提取物 ,对拮抗菌
BJ-1的抗性物质进行初步研究 ,实验结果表明粗蛋白提取物对软腐病原菌及大肠杆菌有较强的拮抗作用.
本研究局限于在实验室进行 ,实验结果只能说明部分问题.当然 ,在农田生态系统中 ,其拮抗作用机制是
复杂的 ,所以要使用 BJ-1拮抗菌作为魔芋软腐病的生物防治菌株 ,还需大田实验进一步的研究.
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StudiesonSeparationandAntagonismofAntagonizingBacteriaagainst
AmorphophalusRivieriDurieuSoftRot
MAQiong
(SchoolofBiologicalScienceandTechnology, HubeiInstituteforNationalities;KeyLaboratoryofBiologicResources
ProtectionandUtilizationofHubeiProvince, Enshi445000, China)
Abstract:AntagonizingBacteria(BJ-1)wasisolatedsuccessfulyfromAmorphophalusRivieriDurieu.Westudied
theantagonismofBJ-1anddistiledantibacterialprotein.TheresultsshowedthatBJ-1 hadbroad-spectruman-
tibacterialefectandstronglyantagonizedagainstAmorphophalusRivieriDurieusoftrot.
Keywords:AmorphophalusRivieriDurieu;softrot;antagonism;separation
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