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芫荽软腐病病原菌分离与鉴定



全 文 :黑龙江农业科学2015(6):48~51
Heilongjiang Agricultural Sciences
芫荽软腐病病原菌分离与鉴定
张立微,张景涛,李小梅
(哈尔滨市农业科学院,黑龙江 哈尔滨150029)
摘要:为有效防治芫荽软腐病,提高其产质量,通过对引起芫荽腐烂而绝产的病害的病原菌进行分离、纯化,
对19个菌株进行17项生理生化指标测定。结果表明:根据伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)以Ecc为对照进行
鉴定,确定E1(Ames24923)、E3(Ames24927)、E4(CORI107)、E7(CORI139)、E8(CORI140)、E10(CORI147)、
E12(CORI289)、E13(CORI318)、E18(PI664510)为芫荽胡萝卜欧文氏杆菌属胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜
软腐病亚种(Erwinia carotovora ssp.carotovora,Ecc)细菌,而其余供试菌株通过测定可确定为细菌,但属何
种还需进一步鉴定。
关键词:芫荽;软腐病;生理生化
中图分类号: 文献标识码:A 文章编号:1002-2767(2015)06-0048-04 DOI:10.11942/j.issn1002-2767.2015.06.0048
收稿日期:2014-10-08
第一作者简介:张立微(1982-),女,黑龙江省绥化市人,硕
士,农艺师,从事蔬菜遗传育种研究。E-mail:307832795@
qq.com。
通讯作者:张景涛(1963-),男,硕士,高级农艺师,从事蔬菜
遗传育种研究。E-mail:702444364@qq.com。
  芫荽软腐病是芫荽栽培尤其是育种上的重要
病害。植株受此病菌感染后,轻度影响产品质量,
重度可使植株成片腐烂。目前有关软腐病病原研
究大多在马铃薯、甘蓝、大白菜、胡萝卜等蔬菜作
物上,而关于芫荽软腐病的研究很少。软腐病主
要由软腐欧文氏菌引起,起主要作用的是Ecc。
通过文献检索,预备试验的观察,病原菌培养,基
本可以确定芫荽软腐病病原菌是软腐欧文氏菌。
本研究针对引进的芫荽在栽培中发生的软腐病进
行病原菌鉴定,对染病植株进行病原分离纯化与
鉴定研究,明确病原菌是否为Ecc,为防治该病提
供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为2013年7~8月在哈尔滨市农业
科学院作物研发基地芫荽育种棚内采集发病植株
病样(见表1)。NA培养基为牛肉膏3g、蛋白胨
5~10g、葡萄糖10g、琼脂15~20g、蒸馏水
1 000mL;pH7.2±0.2,温度为25℃。121℃灭
菌20min。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离、纯化与保存 把预先配制
好的NA培养基熔化倒入灭菌培养皿中,凝成平
板,倒置放入30℃恒温箱中2~4h,使其表面无
冷凝水[1]。
表1 供试菌株及采集时间
Table 1 Strains and colected time
编号
No.
名称
Strains
采集时间
Time
编号
No.
名称
Strains
采集时间
Time
E1 Ames23623 2013年7月 E11 CORI28 2013年7月
E2 Ames23624 2013年8月 E12 CORI289 2013年7月
E3 Ames24927 2013年7月 E13 CORI318 2013年7月
E4 CORI107  2013年7月 E14 CORI36 2013年8月
E5 CORI137  2013年8月 E15 CORI42 2013年8月
E6 CORI138  2013年7月 E16 CORI82 2013年8月
E7 CORI139  2013年7月 E17 CORI86 2013年7月
E8 CORI140  2013年8月 E18 PI664510 2013年8月
E9 CORI142  2013年7月 E19 PI664512 2013年7月
E10 CORI147  2013年7月
  在NA培养基上采取划线分离法。取芫荽染
病组织病健交界处,在超净工作台上切成小块,置
于70%酒精中浸2~3s,移入0.1%升汞中浸泡
0.5~2.0min,再用灭菌水冲洗3次,再将病组织
放在加灭菌水无菌培养皿中,用灭菌玻璃棒研碎,
让病组织碎块在灭菌水中浸泡20~60min后,使
细菌充分释放到灭菌水中,制成菌悬液,用灭菌接
菌环蘸取菌悬液在干燥的培养基平板上划线分
离,封口膜封口,倒置培养皿于28℃恒温箱中培
养,1~3d后观察菌落生长情况。每个病样3次
重复。用接菌环挑取不同单菌落在NA培养基上
进行3~5次纯化培养。最后一次于试管斜面培
养,放入-20℃条件下密封保存菌株,用于致病性
测定和病原菌的鉴定。
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6期   张立微等:芫荽软腐病病原菌分离与鉴定
1.2.2 病原菌致病性测定 将在 NA固体培养
基上培养18~24h的菌株,用无菌水配成3×108
cfu·mL-1的菌悬液,选取健康芫荽植株,进行针
刺接种。用灭菌接种针蘸菌液分别接种于植株叶
片,每个叶片接种3个点,每个点针刺3次。用灭
菌脱脂棉蘸无菌水覆盖,保鲜膜保湿置于26~
28℃条件下,24和48h后观察发病情况,以接种
无菌水作对照,发病后对发病组织进行病原菌再
分离。
1.2.3 病原菌形态观察与染色 将纯化的菌株
接种于NA培养基平板培养18~24h,观察菌株
生长状况及形态特征。制备菌悬液,进行鞭毛染
色———赖夫生(Leifson)染色法[2]。于显微镜下
观察细菌鞭毛并拍照,革兰氏染色反应用3%
KOH测定,用牙签挑取菌落放在载玻片上与3%
KOH液滴搅拌,静止1~2min,然后慢慢拉起,
看有无黏丝状物出现。
1.2.4 病原菌的生理生化指标测定 参照方中
达、杨革等的方法,对病原菌进行耐盐性、葡萄糖
氧化发酵、硝酸盐和亚硝酸盐还原、吲哚产生、硫
化氢产生、柠檬酸盐利用、丙二酸盐利用、甲基
红(M.R.)、乙酰甲基甲醇(V.P.)、明胶液化、淀粉
水解、过氧化氢酶、细菌在37℃下生长、脲酶测
定、马铃薯腐败、NA培养基上色素的产生等生理
生化指标的测定[2-4]。根据伯杰细菌鉴定手册(第
八版)以Ecc为对照进行鉴定,所用菌株为在NA
固体培养基试管斜面上培养18~24h的幼
龄菌[5]。
2结果与分析
2.1 致病性分析
接种4~6片叶的幼龄植株(见图1),48h后
见明显发病症状(见图2),接种菌株的叶片出现
水浸状,且湿度越大病害发生越严重,伴有恶臭
味。接种无菌水对照正常生长,接种发病症状与
田间自然发病症状一致。对接种植株发病部位进
行分离,纯化后获得与原菌株相同的典型菌落及
病原菌,则初步证明接种菌为致病菌。
2.2 病原菌的形态观察与鞭毛染色
在NA培养基上28℃培养48h的样品分离
菌(见图3),菌落大都呈圆形,全缘,淡奶油色或
白色,中央凸起,非水溶性色素(E5可使培养基呈
黄色),质地均匀,表面光滑发亮,略带透明状,用
牙签从溶有菌体的KOH挑起观察到有丝状物出
现,说明供试菌为革兰氏阴性细菌;在显微镜下观
察(800×)菌体为单生或双生(见图4);赖夫生染
色法在光学显微镜下(1 600×)观察鞭毛为2~8
根,周生(见图5)。
图1 健康幼龄植株
Fig.1 Healthy young plant
图2 接菌后发病叶片
Fig.2 Disease leaves after inoculation
图3 分离菌培养性状
Fig.3 Culture characteristics
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     黑 龙 江 农 业 科 学 6期
图4 分离菌显微形态
Fig.4 Morphology of isolates
2.3 生理生化指标分析
结果表明,能导致芫荽腐烂并发出恶臭气味
的病原菌为细菌,可以利用葡萄糖发酵产酸,能还
原硝酸盐和亚硝酸盐,能利用柠檬酸盐,可产生硫
化氢和过氧化氢酶,不能产生吲哚,不能使淀粉水
解,不能够产生脲酶,可使明胶液化,在37℃下能
正常生长,可使得马铃薯腐败,M.R.和 V.P.反
应均表现为阴性,不能使培养基变色,产生此反应
的细菌为胡萝卜欧文氏杆菌属胡萝卜软腐欧文氏
杆菌胡萝卜软腐病亚种(Erwinia carotovora ssp.
图5 分离菌鞭毛染色
Fig.5 Flagela staining of isolates
表2 不同菌株生理生化指标测定结果
Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strains
菌株Strain  Ecc  E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16 E17 E18 E19
3%KOH - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
5%NaCl + + + + ± + + + + + + + + + + + ± + + +
葡萄糖发酵 + + + √ + + + + + + √ + + + + - - + + -
硝酸盐和亚硝酸盐 + + + + + + - + + + + + + + + + + + + +
吲哚 - - - - - + - - - - - - - - - - - - - +
硫化氢 + + ± + + + + + + + + + + + ± + + + + +
柠檬酸盐 + + + + + - + + + + + + + + - + + + ± ±
丙二酸盐 - - - - - + - - - + - + - - - - + + - -
M.R. - - + - - + - - - - - - - - + - - - - -
V.P. - - + - - + - - - - - - - - + - - - - -
明胶 + ± + + + ± + ± ± ± + + + + + + + + + +
淀粉 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
过氧化氢酶 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
37℃ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
马铃薯腐败 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
脲酶 - - - - - + - - - - - - - - - - + - - -
NA培养基产生色素 - - - - - + - - - - - - - - - - - - - -
  “-”:反应阴性;“+”:反应阳性;“±”:反应较弱;“√”:产酸又产气
“-”:NeGA3tive;“+”:Positive;“±”:Weaker;“√”:Production of gas and acid
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6期   张立微等:芫荽软腐病病原菌分离与鉴定
carotovora,Ecc)细菌。符合 此反应的菌株有
E1(Ames24923)、E3(Ames24927)、E4(CORI107)、
E7(CORI139)、E8(CORI140)、E10(CORI147)、
E12(CORI289)、E13(CORI318)、E18(PI664510),据
此可鉴定为芫荽胡萝卜欧文氏杆菌属(Erwinia
caratovora)胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜软腐
病亚 种 (Erwinia carotovora ssp.carotovora,
Ecc)细菌,E6(CORI138)在硝酸盐和亚硝酸盐反
应中以及E15(CORI42)和E19(PI664512)在葡
萄糖发酵反应中显示特别的弱,可通过分子鉴定
进一步确定,而E2(Ames23624)、E5(CORI137)、
E9(CORI142)、E11(CORI28)、E14(CORI36)、
E16(CORI82)、E17(CORI86)菌株的反应结果与
对照相比,不符合胡萝卜欧文氏杆菌属胡萝卜软
腐欧文氏杆菌胡萝卜软腐病亚种(Erwinia caro-
tovora ssp.carotovora,Ecc)细菌特征,为何种菌
还需进一步鉴定。
3 结论与讨论
软腐病是芫荽栽培中的普遍病害,在育种上
危害较严重,由于此病一般在芫荽生长中后期开
始发病,在生产上一般未等到病害来袭就已采收
上市了。在栽培中由于软腐病菌主要来源于田间
其它寄主,条件适宜时形成侵染,通过雨水、浇水
和昆虫传播。通过在哈尔滨市农业科学院作物育
种基地播种264份芫荽材料中共采集19份病样
的分离鉴定结果表明,引起芫荽细菌性软腐病病
原鉴定为芫荽胡萝卜欧文氏杆菌属胡萝卜软腐欧
文氏杆菌胡萝卜软腐病亚种(Erwinia carotovora
ssp.carotovora,Ecc)细菌,其中有9份供试菌鉴
定为此菌,其余10份供试菌需进一步做分子鉴
定。通过查阅参考文献可知,Ecc是欧文氏菌属
Erwinia carotovora中最复杂的亚种[6-8],据报已
有16个植物属,寄主范围广泛,该病原菌不仅致
病性强,且条件适宜时潜育期短,发病快。本试验
对田间病原菌的鉴定主要是基于生理生化方面上
进行的,如果从分子方面进行芫荽软腐病的鉴定
研究,效果会更直接,明确。
通过对19个菌株进行17项生理生化指标测
定,根据伯杰细菌鉴定手册(第八版)以Ecc为对照
进行鉴定得出:E1(Ames24923)、E3(Ames24927)、
E4(CORI107)、E7(CORI139)、E8(CORI140)、
E10(CORI147)、E12(CORI289)、E13(CORI318)、
E18(PI664510)为芫荽胡萝卜欧文氏杆菌属胡萝
卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜软腐病亚种(Erwinia
carotovorassp.carotovora,Ecc)细菌,E6(CORI138)
在硝酸盐和亚硝酸盐反应中以及E15(CORI42)
和E19(PI664512)在葡 萄糖发酵反应中显示
特别的弱,可通过分 子鉴定进一步确 定,而
E2(Ames23624)、E5(CORI137)、E9(CORI142)、
E11(CORI28)、E14(CORI36)、E16(CORI82)、
E17(CORI86)还需进一步鉴定。因此,针对该病
原菌,可以通过农业防治、生物防治和化学防治措
施控制病害的发生,减少损失,增加收益。
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Separation and Identification of Erwinia caratovora ssp.
caratovora Pathogen of Coriandrum sativumL.
ZHANG Li-wei,ZHANG Jing-tao,LI Xiao-mei
(Harbin Academy of Agricultural Sciences,Harbin,Heilongjiang 150029)
Abstract:In order to control the Erwinia caratovora ssp.caratovora of Coriandrum sativum L.,and improve
the quality,through the isolating and purificating of the pathogen which causes coriander decay,19strains were
isolated and purified.The results showed that according to Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(eighth
edition)and 17tests of physiology and biochemistry,9strainss were Erwinia carotovorassp.carotovora,inclu-
ding E1(Ames24923),E3(Ames24927),E4(CORI107),E7(CORI139),E8(CORI140),E10(CORI147),E12
(CORI289),E13(CORI318),E18(PI664510).Other strains should to be identified by other tools.
Keywords:Coriandrum sativumL.;Erwinia caratovora subsp.caratovora;physiology and biochemistry
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