全 文 ： 药理药化
收稿日期:2010-03-10;　修订日期:2010-09-25
基金项目:天津市科委攻关项目(No.033121411);
天津市应用基础及前沿技术研究计划项目
(No.08JCYBJC27800);
天津农学院科研基金(No.2008N010)
作者简介:王庆奎(1978-),男(汉族),山东青岛人 ,现为中国海洋大学在
职博士研究生 、讲师 ,硕士学位 ,主要从事水生生物生态学研究工作.
＊通讯作者简介:邢克智(1956-), 男(汉族),天津人 ,现任天津农学院教
授 ,学士学位 ,主要从事养殖水域生态学研究工作.
当归多糖除蛋白质的方法与条件优化
王庆奎1, 2 ,邢克智 2＊ ,赵海运2 ,吴　蓉 2 ,吕宝刚2
(1.中国海洋大学 海水养殖教育部重点实验室 ,山东 青岛　266003;
2.天津农学院 水产科学系 ,天津市水产生态及养殖重点实验室 ,天津　300384)
摘要:目的 研究 Sevag法去除当归粗多糖中蛋白质的最佳条件 ,并比较 Sevag法和反复冻融法的除蛋白质效果。方法
采用单因素实验法 , 以蛋白质去除率和多糖损失率为指标 , 研究 Sevag法不同试剂比例 、用量 、处理时间的除蛋白质效果 ,
并与反复冻融法相比较 。结果 Sevag法除蛋白质最佳条件为氯仿∶正丁醇 =4∶1, 多糖溶液∶Sevag试剂 =3∶1, 搅拌时
间 35min。Sevag法除蛋白质的最适次数为 6次 ,反复冻融法为 4次 , 后者除蛋白质效果优于前者。结论 优化了 Sevag
法除当归粗多糖中蛋白质的方法 ,反复冻融法除蛋白质效果优于 Sevag法。
关键词:Sevag法;　反复冻融法;　当归多糖;　蛋白质去除率;　多糖损失率
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2011.02.122
中图分类号:R284.2　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2011)02-封 3-02
　　当归多糖(AngelicasinensisPolysaccharides, ASP)是从伞形科
植物当归 Angelicasinensis(Oliv.)Diels根部提取出的多糖组分 ,
由 D-葡萄糖 、D-半乳糖 、D-木糖 、L-阿拉伯糖 、葡萄糖醛酸
及半乳糖醛酸等组成 , 多糖含量约占原干燥生药的 85% [ 1] , 具
有调节免疫力 、影响造血系统 、抗肿瘤及抗辐射等功效和抗病毒
作用 [ 2] 。为确切了解当归多糖结构与功能的关系 , 先要获得提
纯的多糖。去除多糖中的蛋白质是当归多糖精制过程中的重要
一步。目前除多糖中蛋白质的常用方法有 Sevag法 [ 3] 、三氯醋酸
法 [ 4] 、蛋白酶法 、透析法和 732树脂法 [ 5]等。杨铁虹 [ 6]报道用反
复冻融法除当归粗多糖中蛋白质效果较好 ,但未见详细报道。本
研究通过单因素试验方法建立了 Sevag法去除当归粗多糖中蛋
白质的最佳条件 , 并与反复冻融法相比较 , 为大规模提纯当归多
糖提供参考。
1　材料与仪器
当归多糖粗提取物(多糖含量 75.8%)购于山东旺圣药业股
份有限公司。
无水乙醇 、丙酮 、苯酚 、浓硫酸 、氯仿 、正丁醇均为国产分析
纯。
离心机(AnkeTDL-40B, 上海安亭科学仪器厂), 紫外可见
分光光度计(UV-mini1240, 日本岛津公司), 试管混匀器(SK-
1天津华北实验仪器有限公司),分析天平(FA2004, 上海精科天
平有限公司),冷冻干燥机(FD-1A-50,北京博医康实验仪器有
限公司),磁力搅拌器(HJ-4A,天津市华北实验仪器有限公司)。
2　方法
2.1　当归粗多糖去杂质 、脱色 当归粗多糖溶于水 , 4 000 r/min
离心 10 min去除杂质 , 上清加 2倍体积的无水乙醇醇沉。离心
后沉淀用无水乙醇和丙酮反复洗涤至上清液无色 ,沉淀冻干后配
成 2 mg/ml的多糖溶液备用。
2.2　Sevag试剂中氯仿与正丁醇最适比例的确定 氯仿与正丁醇
体积比设以下 5个梯度 , 即 2∶ 1, 3∶ 1, 4∶ 1, 5∶ 1和 6∶1。
Sevag试剂与当归粗多糖溶液按 1∶3混合 , 搅拌 30 min后 , 4 000
r/min离心 10 min,取上层糖溶液测多糖和蛋白质含量。
2.3　粗多糖溶液与 Sevag试剂最适比例的确定 多糖溶液与
Sevag试剂的体积比分别为 1∶1, 2∶1, 3∶1, 4∶1和 5∶1。搅拌
30 min后 4 000r/min离心 10 min, 取上层糖溶液测多糖和蛋白
质含量 。
2.4　搅拌时间的确定 多糖溶液与 Sevag试剂的搅拌时间分别
设为 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 min。搅拌结束后 4 000 r/
min离心 10 min, 测上层糖溶液中多糖和蛋白质含量。
2.5　反复冻融法除蛋白质 将多糖溶液置 -20 ℃冰箱冷冻后 ,
室温溶解 , 4 000r/min离心 10 min, 再冷冻 ,再溶解。每次溶解 、
离心后测上层糖溶液中的多糖和蛋白质含量。
2.6　Sevag法与反复冻融法除蛋白质效果的比较 找出 Sevag法
除蛋白质的最适条件后 ,与反复冻融法比较 ,以确定除蛋白质的
最佳方法和次数。
2.7　测定方法与指标
2.7.1　当归多糖含量的测定 多糖含量用苯酚 -硫酸法 [ 7]测定 ,
用分析纯葡萄糖做标准曲线。多糖损失率(%)=100 ×(M1 -M2)÷M1。 M1:去除蛋白质前溶液中多糖的含量;M2:去除蛋白质后溶液中多糖的含量。
2.7.2　当归多糖蛋白质含量的测定 蛋白质含量用考马斯亮蓝
法 [ 8]测定 , 用牛血清白蛋白做标准曲线。蛋白质去除率(%)=
100×(N
1
-N
2
)÷N
1
。 N
1
:去除蛋白质前溶液中蛋白质的含量;
N2:去除蛋白质后溶液中蛋白质的含量。
2.8　数据处理 所得数据用 SPSS16.0统计软件做单因素方差分
析 , 差异显著的(P<0.05)用 Duncan法做多重比较。表中数据
用 x±s表示 , n=3。
3　结果
3.1　氯仿与正丁醇最适比例的确定 不同比例的氯仿与正丁醇
与多糖溶液混合后 ,搅拌 30 min, 测得的蛋白质去除率和多糖损
失率见表 1。由表 1得知 ,当氯仿与正丁醇比例为 4∶1时 ,蛋白
质去除率最高 ,多糖损失率最低。因此氯仿与正丁醇的最适比例
为 4∶1。
3.2　粗多糖溶液与 Sevag试剂最适比例的确定 氯仿与正丁醇
按 4∶1配成的 Sevag试剂与当归粗多糖溶液按不同比例混合 ,
磁力搅拌器搅拌 30 min后 , 测蛋白质去除率和多糖损失率。 结
果见表 2。结果表明 ,粗多糖溶液与 Sevag试剂按 3∶1和 4∶1
混合 , 蛋白质去除率均较高且二者间差异不显著 , 但 3∶1时的多
糖损失率显著低于 4∶1, 因此粗多糖溶液与 Sevag试剂的最适比
例为 3∶1。
表 1　氯仿与正丁醇不同比例对蛋白质去除率和多糖损失率的影响( x±s)
氯仿∶正丁醇 蛋白质去除率(%) 多糖损失率(%)
2∶1 49.89±2.30a 21.86±1.65a
3∶1 61.55±1.44b 7.31±0.23b
4∶1 64.54±1.76b 6.47±0.31b
5∶1 55.56±1.20a 7.31±0.67b
6∶1 55.22±1.76a 15.17±0.20c
　　同一列数据上标字母不同的表示差异显著(P<0.05)
表 2　样品溶液与 Sevag试剂的比例
对蛋白质去除率和多糖损失率的影响( x±s)
粗多糖溶液∶Sevag试剂 蛋白质去除率(%) 多糖损失率(%)
1∶1 57.09±2.41a 3.13±0.17a
2∶1 70.44±3.49b 1.52±0.08b
3∶1 86.60±3.14c 6.58±0.12c
4∶1 78.07±3.78bc 10.94±0.12d
5∶1 45.07±1.19d 16.05±0.12e
　　同一列数据上标字母不同的表示差异显著(P<0.05)
3.3　搅拌时间的确定 当归粗多糖溶液与 Sevag试剂(氯仿∶正
丁醇 =4∶1)按 3∶1混合 ,搅拌不同时间后测蛋白质去除率和多
糖损失率 , 结果见表 3。搅拌时间在 20 ～ 45min时蛋白质去除率
均高于 70%且差异不显著 。多糖损失率随搅拌时间的延长而显
著升高。因此搅拌时间为 35min时最佳。
表 3　不同搅拌时间对蛋白质去除率和多糖损失率的影响( x±s)
搅拌时间 t/min 蛋白质去除率(%) 多糖损失率(%)
10 32.42±4.32a 19.22±0.23a
15 45.72±3.62b 23.54±0.12b
20 74.81±2.49cd 23.36±0.12b
25 79.80±5.76d 21.61±0.05c
30 78.14±4.40d 31.54±0.17d
35 82.29±1.44d 39.08±0.18e
40 70.66±3.62cd 41.02±0.09f
45 71.49±3.00cd 48.97±0.21g
50 64.84±2.49c 49.99±0.05h
　　同一列数据上标字母不同的表示差异显著(P<0.05)
3.4　Sevag法与反复冻融法除蛋白质效果的比较 在 Sevag法除
蛋白质的最适条件下除蛋白质 8次 , 与反复冻融法比较 , 结果见
表 4 ～ 5。由表 4可以看出 , 除蛋白质 5 ～ 8次时的蛋白质去除率
较高且差异不显著 , 但多糖损失率随处理次数的增加而升高。因
此 Sevag法除蛋白质最适次数为 6次。由表 5可以看出除蛋白
质 3 ～ 8次时的蛋白质去除率相近且差异不显著 , 但多糖损失率
差异显著。因此反复冻融法除蛋白质最适次数为 4次。与 Sevag
法相比 , 反复冻融法除蛋白质虽然多糖损失率稍高 , 但蛋白质去
除率更高 , 而且处理次数少。因此反复冻融法除当归粗多糖中蛋
白质的效果优于 Sevag法。
表 4　Sevag法蛋白质去除率及多糖损失率( x±s)
除蛋白质次数 蛋白质去除率(%) 多糖损失率(%)
1 14.44±0.63a 17.67±0.08a
2 29.51±1.66b 27.26±0.08b
3 38.92±2.26c 30.93±0.19c
4 47.71±1.25d 35.94±0.12d
5 55.87±1.66e 41.31±0.14e
6 58.38±1.09e 43.07±0.05e
7 59.63±0.63e 48.50±0.04f
8 59.01±0.63e 48.43±0.00f
　　同一列数据上标字母不同的表示差异显著(P<0.05)
4　结论与讨论
影响 Sevag法除蛋白质的因素主要有氯仿和正丁醇的体积
比 、样品溶液与 Sevag试剂的体积比 、搅拌时间等 [ 9] 。 Sevag试
表 5　反复冻融法蛋白质去除率及多糖损失率( x±s)
冻融次数 蛋白质去除率(%) 多糖损失率(%)
1 59.36±1.38a 30.28±0.08a
2 65.15±3.86ab 44.74±0.12b
3 71.67±3.75bc 49.23±0.05c
4 76.24±3.66c 56.01±0.35c
5 73.57±1.45bc 61.44±0.32d
6 77.57±2.58c 67.00±0.42e
7 79.52±2.84c 67.57±0.58de
8 79.54±1.96c 67.64±0.60de
　　同一列数据上标字母不同的表示差异显著(P<0.05)
剂中氯仿和正丁醇的比例对蛋白质去除率和多糖损失率影响较
大 [ 10] ,需要选择合适的比例。本实验发现不同氯仿和正丁醇比
例对蛋白质去除率和多糖损失率均有显著影响(表 1)。样品溶
液与 Sevag试剂的比例也很重要 [ 11] 。本实验发现 , 粗多糖溶液
过多和过少均降低蛋白质去除率 ,多糖损失率随多糖溶液的增多
而升高。在尽可能去除蛋白质的前提下 , 还需尽量缩短处理时
间 , 因此选择适当的搅拌时间也很重要。 本试验发现 , 搅拌时间
过短和过长都会降低蛋白质去除率 ,多糖损失率随搅拌时间的延
长而显著升高(P<0.05)。本实验通过对上述影响因子的研究 ,
找出了 Sevag法除当归粗多糖中蛋白质的最佳条件 , 即 Sevag试
剂中氯仿∶正丁醇 =4∶ 1, 当归粗多糖溶液(2 mg/ml)与 Sevag
试剂的体积比为 3∶1,搅拌时间为 35 min。通过比较 Sevag法与
反复冻融法的除蛋白质效果 ,发现反复冻融法优于 Sevag法 。虽
然反复冻融法的多糖损失率稍高 , 但蛋白质去除率更高 , 处理次
数少 , 而且反复冻融法不需化学试剂 , 不产生化学污染 ,对热敏感
性物质没有损害。 Sevag法除蛋白质时有机试剂消耗量大 , 其中
氯仿是有毒物质 ,可能会造成多糖活性下降和试剂残留。目前反
复冻融法多用于破碎细胞壁 [ 12] , 用于除粗多糖中的蛋白质仅见
杨铁虹 [ 6]的报道。另外 , 反复冻融法是否会影响多糖的生物活
性尚待研究。
参考文献:
[ 1 ] 　吴燕成.当归多糖介绍 [ J].中草药 , 1983, 14(9):26.
[ 2 ] 　王亚平 ,祝彼得.当归多糖的药理学研究进展 [ J] .中西药结合杂
志 , 1991, 11(1):61.
[ 3 ] 　StaubAM.Removalofproteins(Sevagmethod)[J].MethodinCar-
bohydrateChemistry(V), 1965, 5:5.
[ 4 ] 　张文超.金针菇子实验体多糖的提取 、分离及鉴定研究 [ D].广州:
华南理工大学 , 2001.
[ 5 ] 　高美风 ,俞婷婷.黄芪多糖中脱蛋白方法的研究 [ J] .中华中医药学
刊 , 2008, 26(3):614.
[ 6 ] 　杨铁虹.当归多糖的分离纯化与免疫调节作用及其机理研究 [ D] .
西安:第四军医大学 , 2003.
[ 7 ] 　张惟杰.复合多糖生化研究技术 [ M].上海:上海科学技术出版社 ,
1987.
[ 8 ] 　BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmi-
crogramquantifiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dye
binding[J] .AnalBiochem, 1976, 7(72):248.
[ 9 ] 　李　津 ,俞詠霆.生物制药设备和分离纯化技术 [ M] .北京:化学工
业出版社 , 2002.
[ 10]　刘　凤 ,陶慧卿 , 何培民.条斑紫菜多糖脱蛋白方法与条件优化
[ J] .上海水产大学学报, 2007, 16(2):140.
[ 11]　马　钊.洋葱多糖提取及其提高免疫力和降血脂功能性质研究
[ D] .北京:中国农业大学 , 2005.
[ 12]　孙利芹 ,王长海 ,江　涛.紫球藻细胞破碎方法研究 [ J] .海洋通报 ,
2004, 23(4):71.