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DeproteinizationandantitumoractivityofPhelinusigniarius
crudepolysaccharides
LIANGDayong,HUANGFang,ZHAOChen,YUPeng,QINDan,SONGAirong
(ShandongProvincialLaboratoryofAppliedMycology,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao266109,China)
Abstract:TheoptimumtechnologyofSevagmethodwasstudiedtoremoveproteinfromPhelinusigniari
uscrudepolysaccharides,andtestantitumoractivityofpolysaccharidesbyMTTmethod.Onthebasisof
singlefactorexperiment,includingtheamountofSevagreagent,thevolumeratioofchloroformandbuta
nol,extractiontimesandshakingtime,anorthogonalexperimentwasdesigned.Afteranalysisofvari
ances,theoptimumtechnologyofSevagmethodwasdetermined.Then,antitumorexperimentinvitro
wastested.TheresultsshowedthattheoptimumtechnologyconditionsofSevagmethodwereasfolows
theamountofSevagwas50mL,thevolumeratioofchloroformtobutanolwas3,theextractiontimeswas
6,andtheshakingtimewas20min.Theresultofcelexperimentinvitroshowedthattheinhibitionto
wardcancercelEC109andSiHabetweenthecrudeanddeproteinizativepolysaccharideshadnosignifi
cantdiference.
Keywords:Phelinuslinteus;polysaccharides;Sevagmethod
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Table2 Analysisoforthogonalexperimentresults i A B C D K1 61013 57222 56854 56315 K2 56522 58041 60613 62743 K3 57752 60026 57821 56230 4491 2804 3759 6513 /z 1 ~z 2 òÅ : ë,¿0¨©KØ?@ >b@ ( S1ò ):D、A、C、B, X>ÎÙEYí A1B3C2D2。~^EY"Èæ>so§s s , ÚYØió 68055, û*,¿§s~eÙ§ sµÚ>">ÚYØi 。 ,^ , ¦§© K>ÎÙª} :Sevag G 50mL, dóýe ;P?þ 3, ¢bì 6 b , º»<Ê 20min, ~ ÎÙ" , ©K>Øó 648%。 26 ÆÇÈÁEC109 °±iÒ9S½ ¦§©K0 EC109 >âbGÂÃçY 5 µè 。 /Y 5 òÅ : È©K
Uó 375μg/mL < , ª}Þ©K>âb (26%) û*¨©K>â b (24%); È©K
Uó 750μg/mL<,ª }Þ©K>âb (31%) þ¨©K>âb q 5 ÈÁÒEC109 ·°±iÒ9, Fig.5 Efectsofdiferentpolysaccharideconcentrations oninhibitiverateofcancelcelEC109 (28%) ûå 3%, òÄ~s
U" , 0¨©K>B Xû10 EC109 ; >âbG ; È©K
Uó 1500μg/mL<,ª}Þ©K>âb 95 ! 3 # 1yø : ¦§¨©Kª}«¬®¯ (48%) ÿ*¨©K>âb (40%)。 ìæi zÞ , sû
U>¨©Kýª}Þ©K0 EC109 >âbAÞêB , /^zÞ Sevag æÔQ7g©K>®¯ , ÈY¦§¨©K}> hª 。 27 ÆÇÈÁSiHa °±iÒ9S½ ¦§©K0 SiHa >âbGÂÃçY 6 µè 。 q 6 ÈÁÒSiHa ·°±iÒ9, Fig.6 Efectsofdiferentpolysaccharideconcentrations oninhibitiverateofcancelcelSiHa /Y 6 òÅ : È©K
Uó 375μg/mL < ,¨ ©K>âb (24%) û*ª}Þ©K> âb (23%); È©K
Uó 750μg/mL<, ª}Þ©K>âb (28%) þ¨©K>âb (26%) ûå 2%, òÄ~s
U" , 0¨©K> BXû10 SiHa ; >âbG , M}> hªH¦§©K>«¬íÃÕÊÞê ; È©K
Uó 1500μg/mL<,ª}Þ©K>âb (46%) *¨©K>âb (42%)。 ìæi zÞ , 、 s 、 û
U>¨©Kýª}Þ©K 0 SiHa >âbAÞêB , /^zÞ Sevag æQF*¦§©K>BX~0¦§©KÈA Âu>ÆÇ 。 3 ) ~,¿§s>)Ù , ËeÙ~so§s Îü£ Sevag ª¦§¨©K}>ÎÙ : Sevag G 50mL、V( dó )/V( e;P )=3、 ÎÙ¢ bì 6 b 、 ÎÙº»<Ê 20min, ~ÎÙ" , ©K>Øó 648%。 Ë MTT þ¹££ª}Þ¦§© K>«¬®¯ , §szÞª}Þ©Ký¨©K 0¬ EC109 ~ SiHa >âbÔQÞê B ,Sevag ÈY¦§¨©K}>hª 。 M©6u : [1] Ü! . sÍÀGd4 [M]. Òa : à#ãöå9: ,1974:7173. [2] Uòq , "BZ . sÍd4N : !<_#" ( ÛÜ4Ñ ) [M]. 8j : Ñoå9: ,2005. [3] þ×
,
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,
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.
%ÆÀGd4¦§>ÆÇ&á
[J].
L
áZpÑo
,2007(8):1920.
[4] HwangHJ,KimSW,ChoiJW,etal.Productionandcharacter
izationofexopolysaccharidesfromsubmergedcultureofPheuinus
linteusKCTC6190[J].EnzymMicrobTech,2003,33(2/3):
309319.
[5] KimYS,ParkKS,ParkHK,eta1.Compositionalsugaranalysis
ofantitumorpolysaccharidesbyhighperformanceliquidchroma
tographyandgaschromatography[J].ArchPharmRes,1994,17:
337342.
[6]
((
,
A)h
.
¦§©K>ÆÇÈÉ
[J].
W*joÑo4
4
,2008,32(2):175178.
[7]
z3
,
Av©
,
+Bð
,
ø
.
ÀGd4¦§>ÆÇÈÉ
[J].
+pÑo
,2009,35(1):204210.
[8]
uþ
,
AÉ2
,
J , ø . ½Ïa4 ( ¦§ )¨ ©K0½ ò¨>è,.ùÆÇ [J]. 4¶o* ,2009,28(2):295298. [9] +NW , §© , J
,
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.
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ÆÇ
[J].
0G4
,2009,31(4):7376.
[10]
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,
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,
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[J].
¥/ZpÑo
,2010,38(28):15517-15521.
[11]
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