全 文 ：第 16卷第 2期 上 海 水 产 大 学 学 报 Vo .l 16, No. 2
2007年 3月 JOURNAL OF SHANGHAI F ISHERIES UN IVERSITY M ar. , 2007
文章编号:1004 - 7271(2007)02 -0140 -04
条斑紫菜多糖脱蛋白方法与条件优化
收稿日期:2006-05-18
基金项目:上海科委重点科技攻关计划项目(054319936);上海教委优势(重点)学科资助项目(Y1101)
作者简介:刘　凤(1979 -),内蒙古包头人 ,硕士研究生 ,专业方向为海藻生物技术。 Tel:021 -65711601
通讯作者:何培民 , Tel:021 - 65710364, E-m ail:pmhe@ shfu. edu. cn
刘　凤 , 陶慧卿 , 何培民
(上海水产大学生命科学与技术学院 ,上海　200090)
摘　要:对紫菜多糖提取液中的杂蛋白质去除方法和条件优化进行了研究。采用 Sevag法与三氯乙酸(TCA)
法去除紫菜多糖中的游离蛋白质 ,分别研究了不同溶剂体积比 、用量 、处理温度 和时间等主要因子对蛋白质
去除的影响。结果表明 , Sevag法最佳脱蛋白条件为氯仿∶正丁醇 =3∶1,样品:氯仿 -正丁醇 =3∶1,振荡时间
为 30 m in;三氯乙酸法(TCA法)最佳脱蛋白条件为反应温度 80℃、三氯乙酸用量 4 %、反应时间 30 m in。两
种脱蛋白方法比较发现:三氯乙酸法去除蛋白质质的效果优于 Sevag法。
关键词:Sevag法;TCA法;紫菜;多糖;蛋白质去除率
中图分类号:S 985. 4　　　文献标识码:A
Protein remov ingmethod and cond ition optmi ization in the
polysaccharide extraction from Porphyra yezoensis
LIU Feng, TAO Hu i-qing, HE Pe i-m in
(College of Aqua-life S cience and Technology, Shanghai F isheriesUniversity, Shanghai　200090, China )
Abstract:In this paper, the protein remov ing methods and the ir effect fac to rs on po lysaccharide ex traction
from Porphyra yezoensis we re studied. Sevag method and TCA me thod w ere used to remove pro te in from
Porphyra po lysaccharide extrac tion respective ly, and e ffec ts o f diffe rent ra tio s of so lvent vo lume, dosages,
treating tempe ratu re and time and othe rmain fac to rs on prote in removing w ere studied respective ly. The results
show ed tha t the optimum conditions of prote in removing w ith Sevag me thod w ere:3∶1 ratio o f ch lo ro form:n-
butanol, 3∶1 ra tio o f samp le:chlorofo rm-n-bu tano l, 30 m in stirring time;and the op timum conditions o f
pro tein removing w ith TCA we re:80 ℃ temperature, 30 m in trea ting time, 4% trich loroace tic acid. The
comparison betw een Sevag method and TCA method indicated tha t pro tein remov ing efficieny w ith TCA me thod
w as higher than tha tw ith Sevag method.
Key words:Sevag method;TCA me thod;Porphyra yezoensis;po ly saccharide;pro te in removing
　　紫菜属于红藻门 (Rhodophy ta )、原红藻纲 (P ro to florideophyceae)、红毛菜科 (Bangiaceae )、紫菜属
(Porphyra),在我国沿海皆有分布 [ 1] 。紫菜多糖是紫菜中的重要组成部分 ,是含硫酸酯的杂多糖[ 2] 。不
同的紫菜所含的多糖种类及生物学活性也有所区别[ 2] 。大量研究初步表明紫菜多糖具有抗肿瘤[ 3] 、抗
凝血[ 4] 、抗病毒[ 5]等多种生物活性 。最近本实验室研究表明 ,紫菜多糖还具有抗氧化 、抗疲劳 、提高免
疫力和促使生殖支持细胞增殖等活性[ 6, 7] 。为了进一步明确多糖的结构与功能关系 ,多糖纯化过程中
蛋白质去除是制备紫菜多糖的必要步骤 ,一般去除蛋白质过程中紫菜多糖损失量较大 [ 8] ,所以有必要
对紫菜多糖脱蛋白方法进行研究。本实验在紫菜多糖分离提取研究的基础上 [ 9] ,进一步采用 Sevag法
与三氯乙酸法去除紫菜多糖提取液中的蛋白质 ,并对去除蛋白质的影响因子进行了检测和分析 ,以确定
去除蛋白质质的最适条件 ,为大规模紫菜多糖提取和制备规范工艺奠定基础 。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
本实验材料为条斑紫菜(Porphyra yezoensisUeda), 2005年 1 - 3月采自江苏吕泗紫菜栽培海区 ,经
阴干密封后放入 -20 ℃冰箱中保存 。
1. 2　紫菜粗多糖提取方法
紫菜洗净 ,用高速组织捣碎机捣碎 ,乙醇回流去脂肪 ,在 100℃恒温水浴 3 h ,收集提取液 ,剩余部分
重复提取步骤 ,合并两次提取液 。将提取液蒸发浓缩至原体积的 1 /3,离心 (5 000 r /m in, 10 m in),取上
清液 ,放入 4 ℃冰箱中备用 。
1. 3　脱蛋白方法及实验设计
脱蛋白方法采用 Sevag法[ 10]和三氯乙酸法 [ 11] 。 Sevag法实验设计:氯仿与正丁醇混合液体积比分
别为 2∶1、3∶1、4∶1、5∶1等 4个梯度;样品溶液与氯仿 -正丁醇混合液体积比分别为 2∶1、3∶1、4∶1、5∶1
等 4个梯度;振荡时间分别为 10 m in , 20 m in, 30 m in, 40 m in等 4个时间梯度。每个实验设置 3个平
行 。三氯乙酸法 (TCA法)实验设计 :设置不同反应温度 20 ℃、45 ℃、60℃、70 ℃、80℃、90 ℃等 6个
梯度;设置三氯乙酸浓度为 1%, 2%, 3%, 4%, 5%等 5个梯度;设置 10 m in、20 m in、30 m in、40 m in、
50 m in等 5个时间梯度。每个实验设置 3个平行 。
1. 4　测定方法
多糖含量的测定方法为苯酚 -硫酸法[ 12] ,多糖损失率 =(M1 -M 2) M/ 1 (M1:去除蛋白质前原液
中多糖的含量 , M2:去除蛋白质质后原液中多糖的含量)。蛋白质含量测定采用 Brodfo rd法 [ 13 , 14] ,蛋白
质的去除率 =(N 1-N2) /N1 (N1:去除蛋白质前原液中蛋白质的含量 , N2:去除蛋白质后原液中蛋白质
的含量 )。
2　结果
2. 1　Sevag法去除紫菜多糖提取液中蛋白质的条件优化
2. 1. 1　氯仿与正丁醇体积比对蛋白质去除的影响
表 1为不同氯仿与正丁醇体积比对蛋白质去除及其多糖损失进行比较。由表 1得知 ,当氯仿与正
丁醇比率为 2∶1或 3∶1时 ,经 4次 Sevag法脱蛋白后 ,多糖提取液均能基本去除游离蛋白质。但当比率
为 2∶1时 ,多糖损失较大 ,故 3∶1为最佳 。
2. 1. 2　样品与氯仿 -正丁醇混合液体积比对蛋白质去除的影响
表 2为不同样品与氯仿 -正丁醇混合液体积比对蛋白质去除效果和多糖损失的影响比较 。由表 3
数据分析可知 ,虽然样品与氯仿 -正丁醇混合液比率为 2∶1或 3∶1时 ,多糖损失率相近且均有较好去除
游离蛋白质的效果 ,但比率为 3∶1所耗费有机溶剂用量少 、较为经济 ,因此 3∶1为最佳选择。
2. 1. 3　振荡时间对蛋白质去除的影响
表 3为样品与氯仿 -正丁醇混合液体积为 3∶1时不同振荡时间对蛋白质去除效果的影响。由实验
结果可知 ,在振荡时间达到 30m in后 ,再增加时间对蛋白质去除已无明显提高效果 ,故每次振荡时间为
30 m in时效果最好 。
1412期　　　　　　　　　　　　　　刘　凤 , 等:条斑紫菜多糖脱蛋白方法与条件优化
表 1　不同氯仿 -正丁醇混合液体积比
对蛋白质去除率的影响(n=3)
Tab . 1　Effec t of the ra tio of ch loroform volum e to
n-Butanol volum e in the ir m ixed solu tion
on rate of protein rem ov ing(n=3)
氯仿与正丁醇
体积比
(v /v)
脱蛋白次数
(次)
蛋白质去除率
(% )
多糖损失率
(% )
2∶1
3
4
5
49. 8±0. 8
58. 4±0. 29
-
44. 3±0. 21
54. 9±0. 24
56. 3±0. 17
3∶1
3
4
5
46. 9±1. 45
57. 9±0. 55
-
39. 0±0. 11
46. 9±0. 37
50. 7±0. 25
4∶1
3
4
5
42. 7±0. 49
52. 4±1. 29
57. 9±0. 63
34. 1±0. 49
41. 4±0. 55
44. 7±0. 33
5∶1
3
4
5
37. 5±0. 70
46. 7±1. 34
53. 7±1. 18
28. 8±0. 11
34. 9±0. 08
38. 8±0. 49
　　注:- 表示没有蛋白析出
表 2　样品溶液与氯仿 -正丁醇混合液体积比
对蛋白质去除率的影响(n=3)
Tab. 2　Effec t of the ra tio of samp le volum e to
ch loroform n-Butanol solut ion volum e
on rate of protein rem ov ing(n=3)
氯仿与
正丁醇体积比
(v /v)
脱蛋白次数
(次)
蛋白质去除率
(% )
多糖损失率
(% )
2∶1
2
3
4
50. 9±0. 44
57. 9±0. 14
58. 6±0. 17
42. 9±0. 40
48. 2±0. 34
49. 3±0. 16
3∶1
2
3
4
41. 2±0. 16
57. 5±0. 24
58. 3±0. 51
35. 0±0. 53
47. 5±0. 28
48. 5±0. 33
4∶1
2
3
4
33. 7±0. 21
46. 7±0. 55
57. 7±0. 23
28. 5±0. 48
39. 0±0. 26
47. 8±0. 40
5∶1
2
3
4
27. 9±0. 86
38. 8±0. 36
49. 6±0. 70
24. 0±0. 20
32. 9±0. 47
41. 6±0. 29
2. 2　三氯乙酸法(TCA法)去除多糖提取液中蛋白的最佳条件选择
2. 2. 1　反应温度对蛋白质去除率的影响
表 3　不同振摇时间对蛋白质去除率的影响(n=3)
Tab. 3　Effect of trea ting t ime on rate
of prote in rem oving(n=3)
处理时间
(m in)
脱蛋白次数
(次)
蛋白质去除率
( % )
10
1
2
3
9. 9±0. 10
19. 1±0. 42
28. 0±0. 34
20
1
2
3
16. 6±0. 11
32. 2±0. 44
49. 4±0. 78
30
1
2
3
23. 3±0. 07
43. 4±0. 22
58. 2±0. 22
40
1
2
3
26. 9±0. 24
47. 0±0. 24
58. 4±0. 10
图 1为加入了浓度为 3 %三氯乙酸的提取液 ,
在不同反应温度下静置 20 m in后 ,测得的蛋白质去
除率。由实验数据可知 ,去除率随温度升高而升高 。
当温度低于 50℃时蛋白质基本上没有被去除 ,当温
度高于 60 ℃时 ,容易去除 。当温度超过 80℃后 ,蛋
白质基本大部分被去除 ,故反应温度以 80 ℃为宜。
2. 2. 2　三氯乙酸用量对蛋白质去除的影响
图 2为提取液中加入不同浓度三氯乙酸 ,在 80
℃下静置 20 m in后对蛋白质去除效果的影响 。从
图 2中可以看出 ,三氯乙酸用量对去除蛋白质的影
响主要有两个方面:增加三氯乙酸的用量可以提高
蛋白质去除率;另一方面随着用量的增加 ,多糖的损
失也在同时上升 。在此实验中当三氯乙酸浓度达到
4 %时 ,蛋白质去除率增加缓慢 ,多糖的损失率仍在增加;因此 , 4 %的三氯乙酸浓度较为适宜 。
图 1　不同反应温度对蛋白质去除率的影响(n=3)
F ig. 1　E ffec t o f temperature on rate o f
pro tein rem oving(n=3)
图 2　不同三氯乙酸用量对蛋白质去除率
和多糖损失率的影响(n=3)
F ig. 2　Effect of the amount of TCA on ra te o f pro te in
rem ov ing and on ra te o f po ly saccharide lost(n=3)
142 上　海　水　产　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　16卷
图 3　不同反应时间对蛋白质去除率的影响(n=3)
F ig. 3　Effects o f reaction tim e
on the rate of prote in rem oving(n=3)
2. 2. 3　反应时间对蛋白质去除的影响
图 3为加入浓度 4 %三氯乙酸提取液 ,在 80℃
静置不同时间后 ,测得的蛋白质去除率 。从图 3可
看出 ,蛋白质去除率随反应时间增加而上升 。但当
时间达到 30 m in后 ,蛋白质去除率提高较缓慢 ,反
应时间为 30m in时较佳。
3　讨论
影响 Sevag法脱蛋白的外界因素主要有振摇时
间 、氯仿与正丁醇体积比 、样品溶液与氯仿 -正丁醇
混合液体积比因素[ 15, 16] 。用 Sevag法脱蛋白 ,除了
达到去除蛋白质的目的外还需尽量缩短去除时间 ,
表 4　Sevag法与 TCA法脱蛋白的比较
Tab. 4　Compar ison between Sevag and
TCA m ethod for prote in rem oving
参数 S evag法 TCA法
蛋白质去除率 (%) 58. 3 76. 8
多糖损失率(%) 48. 5 22. 3
处理时间 (h) 3 0. 5
有机溶剂用量 较多 较少
选择适当的振荡时间具有一定意义 [ 8] 。氯仿与正
丁醇的比率与蛋白质去除率及多糖损失率的关系极
大 ,需选择合适的比率[ 16] 。另外 ,样品溶液与氯仿
-正丁醇混合液体积比不能忽略 ,试剂用量大 ,溶在
其中的糖就多 ,会影响糖的定量测定和多糖的收率 ,
但样品体积过大 ,又会影响蛋白质去除效果 [ 8] 。本
实验通过对上述影响因子的研究 ,选择出 Sevag法最
佳脱蛋白条件为:振荡时间为 30m in,氯仿∶正丁醇 =3∶1,样品:氯仿∶正丁醇 =3∶1。
影响三氯乙酸法 (TCA法 )脱蛋白的外界因素主要有反应温度 、三氯乙酸用量 、反应时间因素[ 16] ,
用三氯乙酸脱蛋白时发现 ,温度过低 ,不能除去蛋白质 ,并且随着三氯乙酸用量 、反应时间的不同 ,脱蛋
白效果也显著不同。通过对上述影响因子的研究 ,选择出三氯乙酸法 (TCA法 )最佳脱蛋白条件为:反
应温度 80℃、三氯乙酸用量 4 %、反应时间 30 m in。
　　通过对两种方法的比较(表 4),可以发现 TCA法脱蛋白的去除率高 、多糖损失量小 ,而 Sevag法所
需时间长 、有机溶剂消耗多 ,故三氯乙酸法去除蛋白质质的效果优于 Sevag法 。
参考文献:
[ 1] 　曾呈奎 ,王素娟 ,刘思俭,等.海藻栽培学 [M ] .上海:上海科学技术出版社 , 1984:135 - 137.
[ 2] 　周慧萍 ,陈琼华.紫菜多糖的提取 、分离和鉴定 [ J] . 中国药科大学学报 , 1989, 20(3):70 - 171.
[ 3 ] 　张伟云 ,周建峰 ,陈　颢 ,等.紫菜多糖对免疫细胞及肿瘤细胞生长的影响[ J] .生命科学研究 , 2002, 6(2):167 - 170.
[ 4] 　周慧萍 , 陈琼华.紫菜多糖的抗凝血和降血脂作用 [ J] .中国药科大学学报 , 1990, 21(6):358 - 360.
[ 5] 　肖美添 ,杨军玲 ,林海英,等.紫菜多糖的提取及抗流感病毒活性研究 [ J] . 福州大学学报(自然科学版), 2003, 31(5):631 - 635.
[ 6] 　T ingting Guo, Jiaw en G u, Luxi Zhang, et a l. M ices an ti-fatigue experim en t w ith crude po lysaccharide from Porphyra yezoen sis[ C ] / /
P roceed ings of 10 th In ternational Sym posium on the Ef ficien t App licat ion and Preservation of M arine B iological Resou rces. Yeosu
University, Korea, 2005:81 - 87.
[ 7] 　郭婷婷 ,张陆曦 ,顾佳雯,等.条斑紫菜多糖对淋巴细胞和支持细胞增殖作用 [ J] .生物技术通讯 , 2006, 17(2):359 - 361.
[ 8] 　倪德江 ,谭少波.脱蛋白工艺对多糖提取率及蛋白质含量的影响 [ J] .中国茶叶 , 2002, 24(4):6 - 7.
[ 9] 　刘　凤 ,顾中恺 ,何培民.几种因子对紫菜多糖粗提的影响 [ J] .上海水产大学学报 , 2005, 14(1):26 - 29.
[ 10] 　S taub A M. Rem oval of P ro tein s(SevagM ethod)[ J] . M ethod in Carbohydrate Ch em istry (V), 1965, 5:5 - 6.
[ 11] 　张文超.金针菇子实验体多糖的提取 、分离 、及鉴定研究 [ D ] . 华南理工大学硕士论文 , 2001.
[ 12] 　张惟杰.复合多糖生化研究技术 [M ] .上海:上海科学技术出版社 , 1987:124 - 128.
[ 13] 　郭敏亮 ,姜永明.考马斯亮蓝显色液组分对蛋白质测定的影响 [ J] .生物化学与生物物理进展 , 1996, 23(6):558 - 561.
[ 14] 　王多宁 ,赵雁武 ,田芙蓉.考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量 [ J] .第四军医大学学报 , 2001, 22(6):528 - 529.
[ 15] 　李　津 ,俞詠霆.生物制药设备和分离纯化技术 [M ] .北京:化学工业出版社 , 2002:390 -391.
[ 16] 　齐慧玲 ,高　波. Sevag法去除白及多糖中蛋白的研究 [ J] .天津化工 , 2000, (3):20 - 22.
1432期　　　　　　　　　　　　　　刘　凤 , 等:条斑紫菜多糖脱蛋白方法与条件优化