全 文 ：抗生素对 2个越橘品种叶片再生的影响
邢瑞丹1 , 刘庆忠2 , 陈　新2 , 李亚东1
1.吉林农业大学园艺学院 , 长春130118;2.山东省果树研究所 山东省果树生物技术重点实验
室 , 泰安 271000)
摘　要:以 Sunrise和Geo组培苗幼叶为试材 , 研究了卡那霉素 、头孢霉素和羧苄青霉素对越橘叶片再生不定
芽的影响。用继代约 20 d 的新梢顶部新展开叶片制备外植体 , Sunrise 接种在 WPM+ZT 4.0 mg/L+TDZ
1.0 mg/ L+IBA 0.3 mg/L+蔗糖 20.0 g/ L+琼脂 6.0 g/L 的再生培养基上 , Geo接种在 WPM+ZT 4.0 mg/ L+
IBA 0.3 mg/L+蔗糖 20.0 g/L+琼脂 6.0 g/L的再生培养基上 ,添加不同浓度的抗生素。结果表明:10 mg/ L卡
那霉素能极显著地抑制越橘叶片再生 , 600 mg/ L头孢霉素能完全抑制叶片再生 , 500 mg/ L羧苄青霉素能完全
抑制叶片再生。
关键词:越橘;离体叶片;再生;抗生素
中图分类号:S663.9　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2009)05-0524-04
Effects of Antibiotics on Regeneration of Leaves of Two Blueberry Culti-
vars
XING Rui-dan1 , LIU Qing-zhong2 , CHEN Xin2 , LI Ya-dong1
1.College of Horticulture , J ilin Agricultural University , Changchun130118 , China;2.Shandong Insti-
tute of Pomology , Shandong Provincial Key Lab.of Orchard Biological Technology , Tai′an 271000 ,
China
Abstract:Young leaves of Sunrise and Geo were selected as experimental materials.Effects of
kanamycin , cefotaxime and carbenicillin on regeneration from leaves in vitro were studied.Leaves on the
top of shoots of Sunrise were cultured on WPM medium containing ZT 4.0 mg/L , TDZ 1.0 mg/L , IBA
0.3 mg/L , sucrose 20.0 g/L , agar 6.0 g/L , Geo were cultured on WPM medium containing ZT
4.0 mg/L , IBA 0.3 mg/L , sucrose 20.0 g/L , agar 6.0 g/L , and several kinds of doses of antibiotics
respectively.Results showed that Kanamycin strongly inhibited regeneration even at a dose of 10 mg/L ,
and at a dose of 20 mg/L adventitious buds could not grow as usual and died , cefotaxime at a dose of
600 mg/L and while carbenicillin at a dose of 500 mg/L inhibited regeneration.
Key words:blueberry;leaves in vitro;regeneration;antibiotic
　　越橘是一种新兴的小浆果类果树 ,其果实中
含有较多的花色素 、黄酮等生物活性成分 ,营养和
保健价值极高 。但是由于越橘喜酸性土壤 ,在偏
碱性的土壤中不易种植 ,大大地限制了其发展。
由于果树高度的杂合性及漫长的世代周期 ,所以
通过常规杂交育种对其改良很困难 ,而体细胞诱
变育种和基因转移等生物技术手段为越橘品种改
良提供了新手段 ,叶盘法是基因转移技术中常用

通讯作者
基金项目:公益性行业(农业)科研专项基金项目(nyhyzx07-028 , 2006-G25),吉林省科技发展重点项目(2007-5013),山东省农业科
学院自主创新基金项目(2007YCX010)
作者简介:邢瑞丹 ,女 ,硕士研究生 ,主要从事果树生物技术方面研究。
收稿日期:2008-12-20　　修回日期:2009-02-28
吉林农业大学学报　2009 ,31(5):524 ～ 527 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
的方法[ 1-6] 。本试验在已建立的越橘再生体系的
基础上[ 7-13] ,探讨了越橘遗传转化过程中常用抗
生素类物质卡那霉素(Kan),头孢霉素(Cef), 羧
苄青霉素(Carb)对叶片离体再生的影响 ,从而为
进一步利用转基因转移技术对越橘品种进行改
良 、获得抗寒新品种奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
Sunrise和Geo 2个越橘品种试管苗由山东省
果树研究所育种室保存。2个试管苗在WPM+
ZT 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L培养基上继代培养。
1.2　方法
1.2.1　叶片接种培养　在继代培养 20 d 的试管
苗顶部取幼嫩平展的叶片 ,叶片的大小 、形状 、色
泽基本一致。每个叶片横切两刀 ,作为再生不定
芽的外植体 ,叶片远轴面向下(不同接种方式比较
试验除外),接种在培养基上 。培养基的 pH值为
5.2 ～ 5.4 ,设置不同的抗生素梯度 ,每瓶接种 5个
叶片 ,每处理 20瓶 ,重复 3次。
1.2.2　培养条件　叶片接种后先暗培养 14 d ,再
移至光照条件下培养 28 ～ 35 d。光强 2 000 lx ,每
日光照时间16 h ,培养温度(25±2)℃。
1.2.3　调查及数据统计分析方法　叶片在再生
培养基上培养 50 d后 ,调查叶片和植株再生不定
芽频率。设2个指标:再生频率=(再生不定芽的
外植体/接种外植体)×100%;每个外植体再生芽
数=外植体再生不定芽总数/再生不定芽的外植
体数 。
2　结果与分析
2.1　卡那霉素对越橘叶片再生的影响
外植体先在再生培养基上预培养 2 d 后 ,接
种于含不同质量浓度卡那霉素的再生培养基上 ,
每14 d转接 1次。先暗培养约 14 d ,再移至光下
培养 30 d后 ,统计再生率和再生芽数 ,结果见表
1。
表 1　不同质量浓度卡那霉素对叶片再生的影响
Table 1.The effects of different kanamycin concentrations on regeneration
ρ(卡那霉素)/
(mg·L -1)
Kanamycin
concentration
外植体数
No.of
explant
Sunrise
分化率/ %
Frequency of
regeneration
不定芽/外植体
No.of shoots
per responding
explant
不定梢生长状况
Situat ion of
adventitious
shoots
Geo
分化率/%
Frequency of
regeneration
不定芽/外植体
No.of shoots
per responding
explant
不定梢生长状况
Situation of
adventitious
shoots
0 100 100.00 5.63 叶片浓绿 97.80 4.86 叶绿
5 100 77.89 2.35 叶片黄化 81.30 2.13 叶色正常
10 100 1.21 0.54 叶小黄化 0.68 0.23 叶小黄化
15 100 　0 0 0 0
20 100 　0 0 0 0
25 100 　0 0 0 0
30 100 　0 0 0 0
　　卡那霉素是遗传转化过程中转化体常用的选
择剂 ,从表 1中可以看出 2个越橘品种对卡那霉
素极为敏感 , 10 mg/L 就能使叶片再生率显著降
低 ,质量浓度为 15 mg/L 即能完全抑制叶片的再
生。
2.2　头孢霉素对叶片再生的影响
外植体接种于含不同质量浓度头孢霉素的再
生培养基上 ,每 14 d转接1次 。先暗培养约14 d ,
再移至光下培养 30 d 后 ,统计再生率和再生芽
数 ,结果见表 2。头孢霉素是农杆菌的有效抑制
剂 ,在农杆菌介导的遗传转化过程中 ,在共培养结
束后用于杀灭或抑制农杆菌 ,其适宜的浓度既要
保证杀灭农杆菌 ,又要最大限度地减少对叶片再
生的抑制作用 。研究发现 ,低浓度的头孢霉素能
促进越橘叶片的再生 ,但是随着浓度的升高 ,再生
率逐渐降低 ,当质量浓度达到 600 mg/L 时 ,再生
率为 0。
525邢瑞丹等:抗生素对 2个越橘品种叶片再生的影响
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
表 2　不同质量浓度头孢霉素对叶片再生的影响
Table 2.The effects of different cefotaxime concentrations on regeneration
ρ(头孢霉素)/
(mg·L -1)
Cefotaxime
concentration
外植体数
No.of
explant
Sunrise
分化率/ %
Frequency of
regeneration
不定芽/外植体
No.of shoots
per responding
explant
不定梢生长状况
Situat ion of
adventitious
shoots
Geo
分化率/%
Frequency of
regeneration
不定芽/外植体
No.of shoots
per responding
explant
不定梢生长状况
Situation of
adventitious
shoots
0 100 100.00 5.63 叶片浓绿 97.80 4.86 叶绿
100 100 47.89 4.35 叶片黄化 71.20 3.65 叶色正常
150 100 31.21 2.54 叶正常 53.10 2.56 叶小黄化
200 100 24.30 1.75 叶正常 41.40 1.86 叶正常
250 100 17.90 1.35 叶正常 35.60 1.45 叶正常
300 100 11.20 1.05 叶小瘦弱 15.60 1.13 叶黄化
350 100 7.61 0.84 叶黄化 7.36 0.47 叶片瘦小
400 100 4.32 0.35 叶黄化 4.63 0.24 叶小黄化
500 100 1.34 0.12 叶瘦小 1.32 0.02 叶瘦小
600 100 　0 0 0 0
700 100 　0 0 0 0
2.3　羧苄青霉素对叶片再生的影响
外植体接种于含不同质量浓度的羧苄青霉素
的再生培养基上 ,先暗培养约 14 d ,再移至光下培
养 30 d后 ,统计再生率和再生芽数 ,结果见表 3。
表 3　不同质量浓度羧苄青霉素对叶片再生的影响
Table 3.The effects of different carbenicillin concentrations on regeneration
ρ(羧苄青霉素)/
(mg·L -1)
Carbenicillin
concentration
外植体数
No.of
explant
Sunrise
分化率/ %
Frequency of
regeneration
不定芽/外植体
No.of shoots
per responding
explant
不定梢生长状况
Situat ion of
adventitious
shoots
Geo
分化率/%
Frequency of
regeneration
不定芽/外植体
No.of shoots
per responding
explant
不定梢生长状况
Situation of
adventitious
shoots
0 100 100.00 5.63 叶片浓绿 97.80 4.86 叶绿
100 100 77.89 4.71 叶片浓绿 65.20 3.45 叶色浓绿
150 100 61.21 3.54 叶正常 43.10 2.99 叶小黄化
200 100 44.30 1.75 叶正常 31.40 2.86 叶正常
250 100 37.90 1.35 叶正常 27.60 1.83 叶正常
300 100 21.20 1.05 叶小瘦弱 16.60 2.13 叶黄化
350 100 17.61 0.84 叶瘦小 6.36 1.47 叶片瘦小
400 100 2.38 0.26 叶瘦小 1.63 0.18 叶小黄化
500 100 0 0 0 0
600 100 0 0 0 0
　　羧苄青霉素与头孢霉素一样 ,也是主要在共
培养结束后用于杀灭或抑制农杆菌的一种常用抗
生素 。研究发现 ,与头孢霉素相比 ,越橘叶片对羧
苄青霉素更加敏感 ,当羧苄青霉素质量浓度达到
500 mg/L 时 ,再生率即为 0。
2.4　卡那霉素对组培苗新梢增殖的影响
将组培苗离体新梢接种在含不同质量浓度卡
那霉素的继代培养基上 , 30 d后统计白化率和增
殖系数。由表 4可知 ,新梢对卡那霉素的耐受能
力略高于叶片 ,在 20 mg/L 下 ,新梢完全白化 ,并
且新梢在含卡那霉素的继代培养基上增殖系数大
526　　　吉林农业大学学报　2009年 10月
Journal of Jilin Agricultural University 2009 , October
大降低 ,在 10 mg/L 下 ,新梢分蘖即被完全抑制。
表 4　不同质量浓度卡那霉素对越橘增殖的影响
Table 4.The effects of different kanamycin concentrations on proliferation of shoots
ρ(卡那霉素)/(mg·L-1)
Kanamycin
concentration
外植体数
No.of
explant
Sunri se
白化率/ %
Frequency of
albinism
增值系数
Prolif eration
modulus
Geo
白化率/ %
Frequency of
albini sm
增殖系数
Proliferation
modulus
0 100 0 5.32 0 6.34
5 100 9.63 2.14 8.87 1.78
10 100 89.30 1.12 93.12 1.10
15 100 2.31 1.03 1.42 1.10
20 100 100.00 0 100.00 0
25 100 100.00 0 100.00 0
30 100 100.00 0 100.00 0
3　讨　论
在农杆菌介导的越橘遗传转化过程中 ,抗生
素主要有 2个方面的作用:一是用于转化体的筛
选 ,二是在共培养后用于杀灭残留在叶片上的农
杆菌。由于抗生素大都对叶片有毒 ,因此筛选适
宜的抗生素浓度对遗传转化过程中转化体的获得
至关重要 。
目前关于越橘遗传转化的研究主要集中在
“蓝丰”等较易遗传转化的品种 ,有关 Sunrise 和
Geo的遗传转化体系建立方面的研究还未见报
道。本研究发现越橘叶片对卡那霉素非常敏感 ,
5 mg/L 即能抑制大部分芽的再生 ,显著抑制植株
的分蘖;10 mg/L 抑制大部分芽的伸长 , 15 mg/L
时完全抑制芽的再生和植株分蘖 , 20 mg/L 时完
全抑制芽的伸长生长。研究发现 ,低浓度的头孢
霉素和羧苄青霉素对叶片再生的影响不大 ,在低
浓度时 ,头孢霉素对叶片的再生还略有促进作用 ,
随着浓度的升高其对叶片再生的抑制作用逐渐表
现出来 。相比而言 ,越橘叶片对羧苄青霉素的敏
感程度高于头孢霉素 ,完全抑制叶片再生的羧苄
青霉素浓度要低于头孢霉素 ,并且在羧苄青霉素
和头孢霉素浓度相同的情况下 ,愈伤组织的生长
量和生长状态 ,添加头孢霉素的培养基要好于添
加羧苄青霉素的 ,而且大量研究表明 ,头孢霉素的
抑菌效果要好于羧苄青霉素 ,所以在越橘的遗传
转化过程中 ,使用头孢霉素要好于羧苄青霉素 ,也
可以选择低浓度的头孢霉素和羧苄青霉素混用以
达到较好的抑菌效果 ,同时又不影响叶片的再生。
参考文献:
[ 1] 　周盛梅 ,宿红艳 ,王磊 ,等.苹果 apetala2同源基因的克隆和
转化研究[ J] .园艺学报 , 2006, 33(2):239-243.
[ 2] 　李洪清 , 李美茹.影响农杆菌介导植物基因转化的因素问
题[ J] .植物生理学通讯 , 1999 , 35(2):145-151.
[ 3] 　Holefors A , Xue Z T , Zhu L H , el al.The Arabidopsis phy-
tochrome B gene influcences growth of apple root stock M26[ J] .
Plant Cell Rep , 2000 , 19:1049-1056.
[ 4] 　Yao J L , Cohen D , Atkinson R.Regeneration of transgenic plants
from the commercial apple cultivar Royal Gala [ J] .Plant cel l Rep ,
1995, 14:407-412.
[ 5] 　Cao X , Liu Q , Rowland-L J , et al.GUS expression in blue berry
(vaccinium spp.):factors influeneing A grobacterium-mediated
gene transfer effi ciency[ J] .Plant Cel l Reports , 1998, 18:3-4 , 266-
270.
[ 6] 　Graham J ,Greig K ,MeNieol-R J.Transformation of blue berry with-
out antibiotic selection[ J] .Annals of Applied Biology , 1996, 128:
3 ,557-564.
[ 7] 　黄文江 ,刘庆忠 , 阚显照.高灌蓝莓离体繁殖的研究[ J] .安
徽师范大学学报:自然科学版 , 2004 , 3(9):314-316.
[ 8] 　刘庆忠 赵红军.高灌蓝莓的组织培养及快速繁殖[ J] .植物
生理学通讯 , 2002 , 38(3):253.
[ 9] 　陶建敏 ,耿其芳 , 庄智敏.等.蓝浆果叶片高效再生体系的
建立[ J] .西北植物学报 , 2006 , 26(3):610-614.
[ 10] 　孙阳 ,刘庆忠.3个蓝莓品种叶片离体再生及生根技术研
究[ J] .安徽农业科学 , 2008, 36(11):4411-4412.
[ 11] 　马怀宇, 李亚东 , 刘庆忠 ,等.高丛越橘离体叶片再生植
株研究初报[ J] .东北农业大学学报 , 2004 , 35(2):129-134.
[ 12] 　刘树英 , 安伟 , 孔令学 , 等.兔眼越橘芽的诱导及再生
[ J] .吉林农业大学学报 , 2004 , 26(6):632-635.
[ 13] 　刘庆忠, Salih S , Hammerschlag F A.茎段外植体白化处理促
进皇家嘎拉苹果不定芽再生[ J] .落叶果树 ,2001(1):4-7.
527邢瑞丹等:抗生素对 2个越橘品种叶片再生的影响
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University