全 文 ：　2010年 20(2) 生　物　技　术　
技术与方法
TECHNIQUEANDMETHODS
齿肋赤藓中半定量 RT-PCR方法的探讨
杨红兰1 ,张道远 1＊ ,马瑞2 ,刘燕 1(1.中国科学院干旱区生物地理与生物资源重点实验室 , 中国科学院新疆生态与地理研究所 , 新疆 乌鲁木齐 830011;
2.中南林业科技大学生命科学学院 , 湖南 长沙 412006)
摘要:目的:建立一种半定量 RT-PCR方法 , 用于齿肋赤藓(Syntrichiacaninervis)基因表达研究。方法:比较常用的几种内参
照基因 actin、tubulin及 18SrRNA在齿肋赤藓中的表达情况 ,以确定表达稳定的内参基因;分析 PCR扩增动力学 , 确定内参和靶
基因的 PCR体系。结果:琼脂糖凝胶电泳检测分析表明:18SrRNA作为齿肋赤藓的内参基因更稳定;同管扩增试验表明:18SrRNA的引物滞后 6个循环加入 PCR扩增体系中 ,至第 26个循环 , 二者同时处于指数扩增期 , 且靶基因 RT-A的扩增效率不受
影响。结论:18SrRNA与 RT-A可以同管扩增 , 18SrRNA可以作为半定量 RT-PCR的内参照 , 为齿肋赤藓基因表达研究奠定
基础。
关键词:齿肋赤藓;半定量 RT-PCR;18SrRNA;内参基因
中图分类号:Q789　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2010)02-0023-03ResearchofSemi-QuantitativeRT-PCRinSyntrichiacaninervis
YANGHong-lan1 , ZHANGDao-yuan1＊ , MARui2 , LIUYan1
(1.KeyLaboratoryofBiogeographyandBioresourceinAridland, XinjiangInstituteofEcologyandGeograph, ChineseAcademyofSciences,
Urumqi830011;2.ColegeofLifeandScience, CentralSouthUniversityofForestryandTechnology, Changsha412006, China)
Abstract:Objective:MakesureakindofmethodofSemi-QuantitativeRT-PCR, sothatitcanbeusedtoanalyzethegeneexpressioninSyntrichiacaninervis.Method:Comparedtheexpressionofsomeusualinternalstandardgenes, containingactin, tubulinand18SrRNAandmakesuretheinternalstandardgeneinSyntrichiacaninervis.Atthesametime, analyzedthePCRdynamicsandmakesurethePCR
system.Result:Theanalysisofagarosegelelectrophoreticshows18SrRNAasinternalstandardgeneismoreconstant.Theexperimentofamplificationinthesametuberevealsthattheprimesof18SrRNAasinternalstandardgenewereaddedafter6 cyclesthatofinteresting
geneInternalstandardgene, whenthe26thcycles, theyarivedtheexponentialperiodatthesametime, andthePCRefficiencyofRT-
Aisnotdecline.Conclusion:18SrRNAcanbeamplifiedwithtargetedgeneinthesametube.The18SrRNAcanbeasinternalstand-ard, theresearchprovidetheoreticreferenceinstudyinggeneexpressioninSyntrichiacaninervis.
Keywords:Syntrichiacaninervis;Semi-QuantitativeRT-PCR;18SrRNA;Internalstandard
收稿日期:2009-10-27;修回日期:2009-12-04
基金项目:新疆自治区重大专项(200731138-3);国家重点基础研究
发展 计划 (2009CB825104)和 农业部 转基 因科技 重大 专项
(2009zx08005-022B)资助
作者简介:杨红兰(1982-),女 ,重庆人 , 硕士 ,专业方向:生物化学与
分子生物学 , Email:yhlan-163@ 163.com;＊通讯作者:张道远(1973
-),女 ,博士 ,研究员 ,硕导 ,研究方向:从事干旱区资源保育与分子生
物学研究 ,发表论文 40余篇 , Email:daoyuanzhang@163.net。
　　齿肋赤藓(Syntrichiacaninervis)隶属于丛藓科(Pottiaceae)
赤藓属(Syntrichia)[ 1] , 是荒漠苔藓中的主要成员之一。它作
为环境演替过程中主要的先锋植物 , 参与土壤生物结皮形成 ,
在防风固沙中起重要作用。它还是一种变水植物 , 在极端干
旱 、贫瘠 、强风沙的自然条件下 ,呈休眠状态 , 似一层灰黑色的
“壳”覆盖在沙漠表面 , 形成有重要生态意义的苔藓生物结皮;
一旦遇到降水 , 能迅速通过再水化过程而 “复原”呈鲜活的绿
色 , 并开始执行光合作用 [ 2] 。 由于它这些特殊的生命现象而
备受关注 , 它的耐旱进化也许与水合作用密切相关。因此本
文选用一个耐旱相关基因 ALDH21的一个片段 RT-A作为靶
基因来探讨半定量 RT-PCR方法 [ 3] , 以寻求齿肋赤藓半定量
RT-PCR体系。
半定量逆转录多聚合酶链式反应(RT-PCR, Reverse
transcriptionpolymerasechainreaction)技术是近年来发展起来
的探讨基因转录水平的有效手段 [ 4] 。与传统的 Northernblot
法比较 , 它具有灵敏 、简捷 、特异性高 , 对试验条件的要求不高
等优点 , 因此在检测基因的表达水平上得到了广泛应用。它
的主要特点是选择一个比较标准(control)-内参 , 以消除试验
误差。样本间用于比较的值不是绝对值 , 而是相对值 , 因此称
半定量 RT-PCR。
内参基因大多来自于表达稳定 , 维持细胞正常生命活动
的持家基因。 目前常用的植物体内参照物有肌动蛋白(ac-
tin)、微管蛋白(tubulin)、18SrRNA等 [ 5-7] 。肌动蛋白和微管
蛋白是真核生物细胞中普遍存在的一种重要的蛋白质 , 是细
胞骨架系统的基本组分 , 参与真核生物细胞的许多重要的生
命活动。而 18SrRNA在组织细胞中的量较为恒定 , 受细胞内
外环境和功能状态变化的影响较小 , 因此也被选作内参基因。
反转录聚合酶链反应用于基因表达分析越来越显示出其
重要性 ,其中合适的内参基因选择很重要 ,目前并没有适合于
所有体系可作为内参的管家基因 , 且尚未见齿肋赤藓的内参
基因序列的报道 , 因此本文通过筛选稳定的内参基因 , 建立齿
肋赤藓的半定量 RT-PCR体系 ,为进一步从转录水平研究齿
肋赤藓基因表达提供方法参考。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
以采自新疆古尔班通古特沙漠的齿肋赤藓(Syntrichiaca-
ninervis)为材料 ,提取 RNA前先去除假根。
1.1.2　试剂
RNA提取试剂盒 , cDNA第一链合成试剂盒和 PCR预混
液均购自 TIANGEN。 DNAmarker购自大连宝生物公司 , 其他
生化试剂均为进口或国产分析纯。
1.1.3　仪器
恒温水浴锅 、低温离心机 、分光光度计 、温控摇床 、小型离
心机 、PCR仪 、超低温冰箱 、超净工作台 、电子天平等。
1.2　方法
1.2.1　PCR扩增引物合成与设计
参考 GenBank中公布的相关序列设计内参照引物(Actin,
Tubulin, 18SrRNA)。参照实验室已获得的 ALDH21基因序
列 ,设计目的基因引物 RT-A引物。利用 PrimerPremier5.0
和 DNAman软件 ,按照引物设计的基本要求设计以上引物(见
表 1)。引物由上海生工合成。
1.2.2　总 RNA提取及反转录
RNA提取所用器皿和试剂均经 0.1%的 DEPC(焦碳酸二
乙酯)水溶液去 RNase处理。 取适量的齿肋赤藓植株在液氮
中充分研磨 , 然后用 TIANGEN总 RNA提取试剂盒提取 RNA,
操作方法参照说明书进行。提取完成之后 , 于 1%非变性及甲
醛变性琼脂糖凝胶电泳进行检测 , 同时用紫外分光光度计测
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定总 RNA纯度和含量。反转录时 ,按照 TIANGEN公司的 cD-
NA第一链合成试剂盒的方法进行。
表 1　引物序列
Table1　Theprimersequences
Primername Primersequence(5′-3′) Productsizes(bp) Tm
ACT-1
ACT-2
TATGCCAGTGGTCGTACA
CCTTGATCTTCATGCTGCT 432
55.02
55.41
RT-A1
RT-A2
CGGGCGGAGGAGATTGCT
CAGTCCATAATGCGTGTTGTT 900
61.86
56.06
18sf
18sr
GGAGAGGGAGCCTGAGA
CACCAGACTTGCCCTCCAA 198
59.42
57.89
Tub-1
Tub-2
GACATTGAGCGCCCAAC
GGCACCAGTCCACAAAC 489
57.01
57.01
1.2.3　确定内参基因
扩增内参基因, 以齿肋赤藓 cDNA第一链为模板 ,以 ACT-
1和 ACT-2为引物, 扩增 actin基因;以 18sf和 18sr扩增 18S
rRNA基因;以 Tub-1和 Tub-2为引物扩增 tubulin基因。
PCR反应体系为:2 ×Taq预混液 10μL, 上下游引物各
0.5μL, cDNA2.5μL, 加双蒸水至 20μL体系;反应程序如下:
94℃ 5min;94℃ 30s, 55 ～ 58℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30 ～ 36个循
环后;72℃终延伸 10min。 PCR产物用 1%琼脂糖电泳观察结
果。
1.2.4　PCR扩增指数增长期的确定
以齿肋赤藓 cDNA第一链为模板 , 分别以 18sf和 18sr为
引物扩增 18SrRNA内参基因 , 以 RT-A1和 RT-A2为引物扩
增 RT-A目的基因。 PCR反应体系同上 , 反应程序如下:94℃
5min;94℃ 30s, 58℃ 30s, 72℃ 1min, 18SrRNA内参基因运行
30个循环 , 从第 18个循环开始取样 , 每两个循环取出 3μL,
ALDH21目的基因运行 36个循环 , 从第 24个循环开始取样 ,
每两个循环取出 3μL;72℃终延伸 10min。 PCR产物用 1%琼
脂糖电泳观察结果。电泳结果用 synGene基因软件扫描分析
电泳条带峰面积积分值 ,数据用 Excel2003处理并作图。
1.2.5　目的基因与内参基因同管扩增试验
根据 1.2.4的结果 ,确定 RT-A与内参的循环数 ,然后用
将两对引物于同一 PCR反应体系中行双扩增 , 其中内参引物
滞后加入。为保证 RT-PCR反应过程中条件的一致性 , 反应
底物采用含有 DNA聚合酶的 TaqMasterMix(购自 TIANGEN
公司), 反应条件如下:94℃ 5min;94℃ 30s, 58℃ 30s, 72℃
1min。取等量的 RT-PCR产物进行凝胶电泳。
2　结果与分析
2.1　总 RNA提取结果
提取的总 RNA经 1%琼脂糖凝胶电泳 , 紫外凝胶成像仪
下照像(如图 1)。同时用紫外分光光度计测定 RNA的浓度和
纯度。从齿肋赤藓中提取的 RNA质量符合后续分子生物学
实验要求。
图 1　齿肋赤藓 RNA电泳结果
Fig.1　TheRNAresultofSyntrichiacaninervis
2.2　内参基因的确定
通过 RT-PCR和电泳检测 , 结果表明以 18sf和 18sr扩增
的 18SrRNA基因条带较亮 , 受 Tm值的影响较小 ,且可重复性
强(见图 2)。从图中可以看出 Actin和 Tubulin的 RT-PCR条
带很弱 ,且引物二聚体很严重 ,而 18SrRNA条带整齐单一 ,无
引物二聚体 , 因此 ,选用 18SrRNA作为齿肋赤藓的内参基因。
图 2　齿肋赤藓内参基因 RT-PCR结果
Fig.2　ResultsofRT-PCRofactin, tubulinand18SrRNAgenes
LaneM1:250bpMarker;Lane1:actin;Lane2:Tubulin;LaneM2:
DL2000Marker;Lane3, 4, 5, 18SrRNA.
2.3　PCR扩增指数增长期的确定
RT-PCR结果经 synGene分析软件和 Excel2003处理 ,根
据 PCR扩增公式 ,对数值取对数后作图(见图 3), 从图 3(a)
可以看出 18SrRNA从第 20个循环开始已能用 EB染色检出 ,
大约第 26个循环进入平台期;从图 3(b)可以看出 , RT-A在
第 26个循环处可以检测出 , 大约第 35个循环进入平台期。
图 3　RT-A与 18SrRNA的指数扩增期分析
Fig.3　TheanalysisofexponentialphaseaboutRT-Aand18SrRNA
2.4　同管扩增试验
根据 2.3的结果 , 在 RT-A运行 6个循环的时候加入 18S
引物 ,共运行了 32个循环。结果见图 4。从图中可以看出 ,同
管扩增没有抑制 RT-A的扩增效率 , 因此 , 18SrRNA和 RT-
A可以进行同管扩增 , 内参引物滞后加入。
图 4　RT-A与 18SrRNA的同管扩增结果
Fig.4　TheRT-PCRresualtofRT-Aand18SrRNAinthesametube
Lane1, 2, 3:ThedifferentcDNAsamplesofSyntrichiacaninervis;LaneM:
DL2000Marker.
3　讨论
18SrRNA作为一种核糖体 RNA, 具有较长的代谢周期 ,
使其在组织细胞中的量较为恒定 , 受细胞内外环境和功能状
态变化的影响较小 [ 8, 9] 。同时由于 18SrRNA在总 RNA中所
占的比例较大 ,只要保证参与反转录时的总 RNA量一致 , 即
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可保证 18SrRNA量的基本恒定。有资料显示 [ 7 , 10]其它内参
在不同的内环境情况以及不同的细胞周期时在组织细胞中的
量是变化的会导致半定量 RT-PCR实验结果的相对不稳定
性以及可重复性较差。在本实验中 , 其它内参的不可行 , 也许
是由于各物种的同源性相对较低 , 导致引物设计的不合适。
但从本实验也可以看出 , 18SrRNA的引物设计合适 , 无引物二
聚体 , 所以 ,以 18SrRNA为内参照的方法可行 [ 11, 12] 。
本文所用的同管扩增:内参照的滞后加入同管 , 避免了内
参引物与靶基因引物对模板的竞争 , 操作比较简便 , EB染色
又可以避免使用同位素 , 因此较适合多时相 mRNA水平的动
态定量。从图 4可以看出 , 内参引物没有抑制靶基因的扩增 ,
但本文所选择的循环数较多 ,应选择以指数增长期开始部位
的循环数作为最终试验的扩增循环数 , 即取指数增长期曲线
的切线。
众所周知半定量 RT-PCR是一种粗略地估计基因表达
的相对变化的方法 , 但多数研究的焦点并不是检测转录水平
微小的变化或确切的分子数目 , 而是检测其表达水平变化是
否显著。因此 , 半定量分析 mRNA水平的方法在各个研究领
域都有着非常广泛的应用 [ 13 , 14] 。
运用半定量 RT-PCR方法研究齿肋赤藓基因在转录水
平的表达 , 需注意以下几点:(1)总 RNA和 cDNA的质量:总
RNA未被降解。 (2)排除基因组 DNA的污染 。 (3)在反转
录之前 , 对总 RNA进行定量:作为起始模板各个样品中的总
RNA量一至 , cDNA模板量和电泳 PCR产物量也要一样 , 才能
保证 PCR扩增产物能真实反映基因表达的实际情况 。(4)引
物的设计:内参引物与靶基因引物之间不存在异源二聚体;同
时保证各引物对能扩出特异条带 , 保证引物结合效率;两对引
物在设计时应尽量保持 Tm值 、GC含量等一致。 (5)PCR循
环数的确定:前期的扩增产物量随循环数的递增而成比例增
加 , 与循环数之间有一线性关系 , 随着 DNA聚合酶活性的下
降和溶液中反应底物的消耗 ,扩增产物将达到一个平台 , 半定
量分析的循环数应确定在成比例的线性关系范围内。表达丰
度不同的基因 , 以及模板量不同的半定量分析的 PCR循环数
亦不同 [ 14 , 15] 。
齿肋赤藓具有耐旱力强 , 生命力强 , 可用于植被恢复等 ,
其潜在的价值正逐渐被发掘。随着分子技术的进步 , 对于齿
肋赤藓分子水平的研究会不断增多。本文获得以 18SrRNA
为内参照的 RT-PCR研究齿肋赤藓基因表达的一种稳定的
半定量体系 , 体系中不存在异源二聚体所带来的误差 , 内参引
物滞后加入 , 与靶基因同管扩增的方法可行 , 为研究齿肋赤藓
基因差异表达提供了方法参考。
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伞菌 DNA简易序列分析引出的思考
曾东方 1 ,陈玢 1 ,罗信昌2(1.武汉工程大学真菌生理学实验室 , 湖北 武汉 430074;2.华中农业大学应用真菌研究室 ,湖北 武汉 430070)
摘要:目的:伞菌物种以子实体形态特征为分类依据 ,研究以菌丝体代替子实体进行种质资源鉴定的遗传证据。方法:以常
见的食用伞菌香菇 、平菇子实体的不同部位组织及其分离菌丝体为供试材料 ,制备了 12个随机引物介导的 RAPD-PCR指纹 ,把DNA指纹图谱转化为简易的序列数据 , 经生物信息处理软件比较分析。结果:香菇不同菌株子实体 DNA相似性系数在 0.886 ～
0.986之间 ,平菇不同菌株子实体 DNA相似系数在 0.779 ～ 0.976之间。对于供试的单个子实体而言 , 香菇和平菇子实体的菌
盖 、菌褶 、菌柄及其组织分离菌丝体 ,与以此为菌种栽培得到的子实体相比较 , 所获得的有限 DNA指纹图谱全部相同。结论:揭
示了香菇和平菇不同菌株的遗传多样性 ,初步反映了伞菌不同发育阶段在分子水平上的遗传变异和亲缘关系 , 争论了以菌丝体
代替子实体使用 RAPD手段进行种质资源鉴定与系统发育分析引出的真菌遗传问题。
关键词:真菌遗传;伞菌;物种;菌株;DNA指纹;遗传多样性;系统发育关系;种质鉴定
中图分类号:Q933;Q935　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2010)02-0025-03SimpleDNASequencingofBasidiocarpsandTheirMyceliafromGilFungi
ZENGDong-fang1 , CHENBin1 , LUOXin-chang2(1.LaboratoryofFungalPhysiology, WuhanInstituteofTechnology, Wuhan430074, China;
2.LaboratoryofAppliedMycology, CentralChinaAgriculturalUniversity, Wuhan430070, China)Abstract:Objective:DNAhomogeneityintheediblefungiwasstudiedtoidentifygeneticrelationshipbetweenbasidiocarpsandtheirmy-celiafromgilfungi.Method:TheDNAfingerprintingswerecomparedmutualyamongdiferenttissuesofbasidiocarpsandtheirmycelialisolatesofLentinulaedodesandPleurotusostreatusmushroomsinthestudies.Result:TheresultsshowedthatthereweresameDNAfinger-
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