全 文 ：越橘叶斑病病原菌的鉴定
收稿日期:2006-10-16
作者简介:冯璐(1982-),女,湖北人,硕士研究生,主要从事
植物病害诊断与防治方面的研究。E-mail:fenglu12345@163.com
*通讯作者E-mail:luanyush@dlut.edu.cn
冯 璐,栾雨时*,范永强,仲 晗
(大连理工大学环境与生命学院,辽宁 大连 116023)
摘 要:文章在辽东地区越橘叶斑病发生严重的种苗繁育圃场采集病叶标本,经分离纯化获得一株真菌,
用涂抹法回接健康植株的叶片,与自然发病症状相同。根据该病原菌在光学显微镜下的形态特征以及对其 ITS
和 β-tubulin的核酸序列分析,结果表明,确认辽东地区发生的越橘叶斑病的病原菌是柯氏帚梗柱孢霉(Cylindro-
cladiumcolhouniPeeraly)。
关键词:越橘;叶斑病;病原菌鉴定
中图分类号:S663.9 文献标识码:A
越橘(Vacciniumspp.)俗称蓝莓,属杜鹃花科
越橘属植物,不仅是一种果品,更是一种保健和
功能食品[1],在国际市场上的价格一直居高不下,
且供不应求。国内诸多单位争先发展越橘产业,
仅辽东地区目前的栽培面积已超过 67公顷,发展
势头强劲。
在越橘种植历史长达百年的美洲地区,各种
病害报道已经十分详尽,其中发生在越橘营养生
长期间的叶斑病主要有两种类型,分别是由
Gloeosporiumminus引起的炭疽型 [2]和由 Septoria
albopunctata引起的壳针孢型[3]。叶斑病会使植株花
芽减少,进而降低果实产量,在大部分越橘种植
地区都有发生,危害十分严重。2005年和2006年
夏季,在越橘种苗繁育地—辽东地区发现了一种
为害严重的叶斑病[4],对营养生长期间的幼苗危害
极大,严重地制约了栽培面积的扩大。
为了清楚的认识该病害,从源头上减轻其造
成的损失,同时也为其他同行及时提供可靠的信
息,本文对该病病原菌进行了分离鉴定。
1 材料与方法
1.1 病原的鉴定
1.1.1 病原菌的分离
在越橘叶斑病发生严重的大连(庄河)、丹东
等地的种苗繁育圃场进行田间调查并采集病株,参
照方中达[5]的常规方法分离获得纯培养物。
1.1.2 病原菌的鉴定
先将分离得到的病原物用方中达[5]的涂抹法接
种无病的当年生越橘种苗,再按照柯赫法则进行
鉴定。
形态特征观察:纯培养物置于 PDA平板上生
长4d后,描述菌落形态,测量菌落直径。取菌落
边缘小块菌丝制片,置光学显微镜下观察。描述器
官的形态特征,同时测量大小。
致病性的测定:将涂抹有病原物的健康越橘种
苗叶片套袋保湿48h后,去袋后在26℃(14h光
照)及 20℃(10h黑暗)条件下交替培养,观察叶
片发病情况。并以无菌水涂抹叶片为对照。每个处
理2株(每株5片叶),重复2次。
1.2 ITS及 β-tubulin基因部分序列的 PCR扩增
与测序
1.2.1 基因组DNA的提取
用LEE[6]的方法提取真菌基因组DNA。
1.2.2 ITS及β-tubulin基因部分序列扩增与测序
本实验用真核生物核糖体 DNA通用引物 ITS1
(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-
TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对 ITS进行扩增;
用 Crous[7]报道的引物 T1(5′-AACATGCGTGAGATT
GTAAGT-3′)及 Bt2b(5′-ACCCTCAGTGTAGTGACC
CTTGGC-3′)对 β-tubulin基因部分序列进行扩增。
PCR反 应 体 系 为 25μL, 其 中 包 括 10×bufer
第38卷 第5期 东 北 农 业 大 学 学 报 38(5):614~618
2007年 10月 JournalofNortheastAgriculturalUniversity Oct.2007
文章编号 1005-9369(2007)05-0614-05
(Mg2+Plus)2.5μL,dNTPMixture0.2mmol·L-1,引
物各10pmol·L-1,DNA模板10ng,ExTaqDNA聚
合酶1.5U;反应程序为96℃预变性2min,96℃
15s,退火(温度设4个梯度,50,55,58,60℃)
30s,75℃延伸35s,共35个循环,最后75℃延
伸 2min。PCR产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测;
产物测序委托TaKaRa(大连)公司完成。
1.2.3 序列分析
将获得的病原菌的ITS及β-tubulin基因部分序
列与GenBank中的核酸数据库进行同源性(BLAST)
比较,用MEGA(Molecularevolutionarygeneticsana-
lysis,Version3.0)软件计算遗传距离,进一步采用NJ
(Neighbor-joining)法聚类分析构建分子系统树。自
举法(Bootstrap)为500次检测(Repliction)。
2 结果与分析
2.1 病原物的分离
此次从越橘叶斑病部位仅分离得到一株病原
菌,编号为B.cn1,回接发病实验表明,该真菌可
以引起越橘叶斑病,与苗圃自然发病症状相同,接
种4d后叶片出现圆心灰色,边缘紫褐色的红褐色
圆斑(见图版Ⅰ-A),最终病斑穿孔导致整个叶片
枯萎死亡(见图版Ⅰ-B)。对照植株生长正常,无
染病症状,并且从发病植株的病斑重新分离得到该
病原真菌,其培养特征与接种用菌株完全一致。
2.2 病原菌的鉴定
病原菌在 PDA培养基上,25℃培养 2d即可
生长出白色丝绒状菌落,4d后产厚垣孢子,并有
色素渗透至培养基内部。分生孢子梗无色,有分
枝,长 305~420μm(包括不孕枝的顶端泡囊),初
级分枝(9~45)μm×(5~6.3)μm,次级分枝(9~17.3)
μm×(3.1~4.5)μm。产孢细胞桶形,无色,(7.8~
17.5)μm×(2.5~6)μm。厚垣孢子浅红棕色,聚集状,
直径 15~20μm。不孕枝无色,有 4个隔膜,其顶
端为膨大的棍棒状泡囊,(13~30)μm×(2~4.5)μm。
分生孢子圆柱形,两端半圆形,无色,有1~3个隔
膜,(50~72)μm×(4~5.5)μm(见图版Ⅰ-C~G)。以上
形态特征与 Watanabe[8]描述的柯氏帚梗柱孢霉
(Cylindro-cladiumcolhouniPeeraly)最为相似,初
步判定该菌为柯氏帚梗柱孢霉。
A-叶斑病状;B-死亡的染病植株;C-分生孢子梗及顶端泡囊;D-瓶梗;E-厚垣孢子;F-顶端泡囊(不孕枝);G-分生孢子
A-Leafspots;B-Deathofinfectedplants;C-Conidiophoresandterminalvesicles;D-Phialides;
E-Chlamydospore;F-Terminalvesicles;G-Conidia
图版Ⅰ 越橘叶斑病症状及病原菌的形态特征
PlateⅠ Blueberryleafspotsandmorphologicalcharacteristicsofpathogen
2.3 rDNA-ITS及β-tubulin基因部分序列的分析
在培养获得了该真菌的特征器官-不孕枝的
基础上,为了从分子水平证明该病原菌为柯氏
帚梗柱孢霉,我们进一步对该菌的 rDNA-ITS
及 β-tubulin的基因部分序列进行了扩增,结果
表明,在退火温度为 50~60℃的范围内均得到
了约 500bp和 600bp长度的片段(见图 1,A,
B)。
冯 璐等:越橘叶斑病病原菌的鉴定 ·615·第5期
2.3.1 rDNA-ITS序列分析
PCR产物测序结果表明,该菌株 ITS序列长
度为 526bp(GenBank登录号:DQ869306)。将该
序列在 GenBank中进行 BLAST同源性比较,发
现与 GenBank报道的四株 C.colhouni(登录号:
AF231951,AF231952,AF231953,AF231954)的
ITS序列表现出极高的同源性,均为 99%,且仅
存在一个碱基的差异,结合形态学特征和 rDNA
-ITS序 列 分 析 , 借 助 软 件 CLUSTALX1.81和
MEGA3采用 NJ法建立与该菌株 ITS序列同源性
很高的不同种的系统发育树,结果表明,菌株
B.cn1的序列与 GenBank中的 C.colhouni(登录
号:AF231951,AF231952,AF231953,AF2319
54)的遗传距离最近,位于系统发育树的同一大
分支(见图 2,A),与柱孢霉属的其他种有所区
分。
A-用引物ITS1/ITS4扩增ITS的结果;B-用引物T1/Bt2b扩增β-tubulin的结果,其他细节同A
泳道1~2,3~4,5~6,7~8的退火温度分别为50,55,58,60℃;泳道CK是阴性对照;泳道M-DL2000DNAMarker
A-AmplificationresultsofprimerITS1/ITS4;B-AmplificationresultsofprimerT1/Bt2b,otherdetailsarethesamewithA.Lane1-2,3-4,5-6,7-8:
PCRproductsofisolate1withannealtemperature50,55,58,60℃,respectively;LaneCK-Negativecontrol;LaneM-DL2000DNAMraker
图1 rDNA-ITS和β-tubulin基因序列的扩增结果
Fig.1 AmplificationresultsofrDNA-ITSandβ-tubulingenepartialsequences
图 2 病原菌B.cn1及Cylindrocladium属其他种的系统发育树
Fig.2 PhylogenetictreesofisolateB.cn1andspeciesofCylindrocladium
·616· 东 北 农 业 大 学 学 报 第38卷
2.3.2 β-tubulin基因部分序列分析
测序结果表明,PCR扩增得到 601bp长度的
β-tubulin基因部分序列(GenBank登录号:DQ86
9305)。将该序列在 GenBank中进行 BLAST同源
性比较,发现与之同源性最高的 101个 β-tubulin
基因部分序列菌株全部为柱孢霉,同源性为88%~
99%,并且最高的前 6个菌株均为柯氏帚梗柱孢
霉,其中同源性达到99%的有 AF232854,AY578
982,AF232853,分别存在 1个、3个和 4个碱基
的差异。采用与 ITS相同的分析方法对 β-tubulin
基因部分序列分析发现,菌株 B.cn1的序列与
GenBank中的C.colhouni(登录号:AY578982,AF2
32853,AF232582,AF232584,AF232581)的遗传距
离较近,位于系统发育树的同一分支(见图2,B),
其中与 AY578982株 C.colhouni亲缘关系最近。
充分证明了此次从辽东越橘叶斑发病部位分离的致
病菌为柯氏帚梗柱孢霉(C.colhouni)。
3 结论与讨论
本文首次将辽东地区发现的越橘叶斑病病原菌
鉴定为柱孢霉,根据形态学特征结合 ITS序列及
β-tubulin基因部分序列进一步确定该病原菌是柯
氏帚梗柱孢霉(CylindrocladiumcolhouniPeeraly)。
帚梗柱孢霉属(Cylindrocladium)真菌迄今在全
世界共报道了22个种和一个变种。该病原菌的有
性态为柯氏丽赤壳原(Calonectriacolhouni)[9],此次
分离培养未观察到有性态。据Peeraly[10]和Roseman
等[11]报道,该真菌在毛里求斯、澳大利亚、印度等
地不仅危害茶树,还在花生、大叶桉、红叶层、无
花果等植物上造成严重的叶斑。据刘云龙等[12]和谢
昌平等[13]报道,该真菌侵染观赏植物鸡冠花和鹤望
兰的叶片,分别造成严重的褐腐和叶斑病。可见,
这种真菌的寄主范围很广,对环境适应能力极强,
危害极为严重。据我们两年来对庄河种苗繁育圃场
的调查,越橘叶斑病每年7月开始发生,8月末达
到发病高峰期,气候条件为潮湿高温。该病害主要
侵染当年生幼苗,多年生成熟植株的感染程度较
轻,接近土表的叶片发病严重。此次在越橘上发现
柯氏帚梗柱孢霉真菌在国内外尚属首次。
ITS是介于18SrDNA、5.8SrDNA和28SrDNA
之间的区域,该区域进化速度较编码区快,已有的研
究表明ITS在真菌的种间存在着丰富的变异,而在种
内不同菌株间却高度保守,可以被用来辅助形态学观
察鉴定种内新株系及区分种之间的差异,Crous等[7]在
利用ITS序列分析Cylindrocladium属内不同种间的差
别时发现,ITS序列并不能够提供足够的信息位点来
分析Cylindrocladium属下某些种间的差异。与此同
时,β-tubulin基因部分序列被越来越广泛地应用于真
菌分类[14-16]。Crous等[7]对Cylindrocladium属下若干种
进行β-tubulin基因序列分析的结果在证实了ITS分类
的基础上,更加清晰的区分了包括 Cylindrocladium
colhouni种下各个菌株之间的差异。本研究分析了
ITS序列及β-tubulin基因部分序列,结果表明病原菌
与C.colhouni同源性最高,为99%,不仅从分子水
平上鉴定了所分离的菌株为柯氏帚梗柱孢霉,而且通
过进化系统分析进一步证实了β-tubulin基因部分序列
在研究Cylindrocladium属下各个种之间差别时比ITS
序列具有更加丰富的信息位点。
国外报道的越橘叶斑病症状与我们发现的最为
相似的是由 S.albopunctata引起的壳针孢型[3]。但
是,其病原菌的 ITS序列及 β-tubulin基因序列与
我们分离得到菌株的相应序列迥然不同。根据
Watanabe[8]介绍,柯氏帚梗柱孢霉可随土壤传播,
由此推断发生在越橘幼苗上的病害来源可能为栽种
基质。但 Cylindrocladium型越橘叶斑病的传播途
径,还有待进一步考证。
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冯 璐等:越橘叶斑病病原菌的鉴定 ·617·第5期
Pathogenidentificationofleafspotdiseaseonblueberry
FENGLu,LUANYushi,FANYongqiang,ZHONGHan
(SchoolofEnvironmentalandBiologicalScienceandTechnology,DalianUniversityofTechnology,DalianLiaoning116023,China)
Abstract:ColectinginfectedleavesfromblueberynurserylocatedattheeastofLiaoningProvincewhere
hasbeenundergoneseriousleafspotdisease.Separatedandpurificatedonestrainfungifromlesionsofleafand
Kochspostulateswerefulfiled.Withmorphologicalobservation,ITSandβ-tubulinsequencesidentification,we
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·618· 东 北 农 业 大 学 学 报 第38卷