全 文 ：第 35卷第 2期
2004年 4月
东　北　农　业　大　学　学　报
Journal of Northeas t Agricultural University
35( 2): 129～ 134
April 2004
文章编号　 1005- 9369( 2004) 02- 0212- 04
高丛越橘离体叶片再生植株研究初报
马怀宇 1 ,李亚东1* ,刘庆忠 2 ,赵红军 2 ,孙清荣 2
( 1.吉林农业大学园艺学院　长春　 130118; 2.山东省果树研究所　泰安　 271000)
摘要: 用越橘组培苗的叶片作为外植体 ,进行不定芽再生植株的研究。以改良的 WPM为其基本培养基 ,添加玉米素
5 mg· L- 1,不定芽再生率高达 90%。所用品种中除乔治亚姆外均有相当高的再生率。培养基中的玉米素浓度低于 5
mg· L- 1时 ,不定芽的再生率也随之下降 ;基本培养基中加入 TDZ和 BA,再生率只为 0% ～ 30%。不定芽的增殖、生
根、温室锻炼、大田移栽均已获得成功。
关　键　词: 赵橘 ; 离体叶片 ; 再生 ; 不定芽
中图分类号: S666. 2; S601; Q949. 772. 3　　　文献标识码 A
　　越橘 ,又名蓝莓 ,为杜鹃花科 ( Ericaceae)越橘属
( Vaccinium )〔1〕。 其 高 丛 类 型 ( Vaccinium
cor ymbosum L. )原产于美国〔2〕。高丛越橘果为蓝色 ,
直径可达 1 cm以上。果实富含 VE ,VA ,VB , SOD花
青苷等其它果品少有的特殊成分以及丰富的钾、铁、
锌、锰等微量元素。据研究 ,越橘果实具有防止脑神
经衰老 ,增强心脏功能 ,明目及抗癌等独特功效。因
此 ,国际粮农组织将其列为五大健康食品之一〔 1〕。正
是越橘的独特风味及营养保健价值 ,其果实和产品
风靡世界 ,供不应求 ,在国际市场上售价昂贵。 越橘
的人工栽培始于上世纪初 ,现今主要集中在欧美各
国。在美国已成为仅次于草莓的第二大小浆果类果
树。关于越橘微繁和再生的研究早已开始。国内的
研究主要停留在微繁和工厂化育苗方面〔 3〕 ,国外在
微繁的基础上 ,开展了大量的不定芽再生研究。由于
越橘喜强酸性土壤的特性 ,限制了其栽培范围。在育
种研究中 ,如果想通过细胞工程和基因工程等育种
技术对其进行改良 ,则必须建立起高效、高频再生体
系和可靠的筛选体系。为此 ,我们从 1999年开始 ,引
进高丛越橘 10个品种〔2〕 ,并成功的运用组织培养方
法进行了扩繁〔4〕。 目前 ,越橘栽培在国内面临的一
收稿日期: 2003- 05- 21
基金项目:长春市科委项目 ,项目号:长科合字第 01- 063N 23号 ;国
家外国专家局项目 ,项目号: Y2001220009
作者简介:马怀宇 ( 1978- ) ,女 ,吉林人 ,现为吉林农业大学园艺学院
研究生 ,从事果树栽培生理的研究。
* 通讯作者
大问题是对土壤条件的选择。 越橘要求在强酸性且
高有机质的土壤上才能生长良好。 高丛越橘要求土
壤 pH值在 4. 0～ 5. 5之间 ,在钙质土壤和 pH值较
高的土壤类型上越橘叶片易发生缺铁失绿症〔1〕、植
株矮小、生长缓慢等不良状况 ,大大影响越橘果实的
产量和品质。如能采用生物技术将外源耐盐基因导
入越橘品种中或在逆境条件下进行变异植株的耐性
筛选 ,从而获得耐高 pH值的株系 ,将会扩大越橘的
栽培范围 ,推动越橘产业的迅速发展 ,但无论是进行
转基因还是变异植株的筛选都需要一个高频、高效
的再生体系。并且高的再生率会相应的提高转化率
或筛选几率。本试验基于此目的 ,研究如何建立一个
高效、高频的再生体系 ,为进一步的转基因和变异株
系的筛选奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　材料
供试材料为日出 ( Sunrise) ,塞艾罗 ( Sierra ) ,都
克 ( Duke) ,埃利奥特 ( Elliot ) ,乔治亚姆 ( Gem )的试
管苗〔 4〕。
1. 2　方法
1. 2. 1　试材繁殖
将试管苗切成长约 1. 50 cm的茎段 ,水平接种
在增殖培养基上。 1980年 Lloy and McCown将培
养基主要成分为改良的 WPM基本培养基〔5〕 ,添加
玉米素 ( ZT) 0. 50 mg· L- 1 ,蔗糖 20 g· L- 1 ,琼脂 6
g· L- 1 , pH值调至 5. 4。培养基在 121℃ , 131 k P的
条件下灭菌 20 min。培养室温度为 23± 2℃ ,光照强
度为 2 000 lx ,光周期为 16 h光照 /8 h黑暗。
1. 2. 2　离体再生
培养 4～ 6周后在水平茎段上长出约 4 cm高的
新梢。 选取 1～ 4节的成熟叶片 ,用解剖刀在叶片中
脉处横伤两刀。然后把刻伤的叶片远轴面向上接种
到再生培养基上。因为不定芽从叶片远轴面发生 ,远
轴面向下会迫使不定芽向培养基中生长〔8〕。 再生培
养基为改良 WPM+ ZT( 1～ 5 mg· L- 1 ) , W PM+
BA( 1～ 5 mg· L- 1 )+ N A A, WPM+ TDZ( 1～ 3
mg· L- 1 )。添加蔗糖 20 g· L- 1 ,琼脂 6 g· L- 1 , p H
值调至 5. 4。接种后先黑暗处理 10 d,然后转移到光
下培养 (培养条件同前 )。接种 40 d后计算再生的不
定芽数和再生率。然后 ,把不定芽切下接到增殖培养
基上。待长到 4～ 5 cm高时转到生根培养基上诱导
生根 (培养条件同前 )。 生根培养基为 1 /2W PM+
IBA。 8周后调查生根率。最后将生根的小植株移栽
到温室中培养 ,基质为草炭土+ 细河沙 ( 1∶ 1) , 3个
月后调查成活率。
再生培养基: ( 1) WPM+ ZT　 ( 1 mg· L- 1 , 3
mg· L- 1 , 5 mg· L- 1 )
( 2) W PM+ BA　 ( 1 mg· L- 1 , 3 mg· L- 1 , 5
mg· L- 1 )+ N AA
( 3) WPM+ TDZ　 ( 1 mg· L- 1 , 2 mg· L- 1 , 3
mg· L- 1 )
生根培养基: 1 /2W PM+ IBA
温室培养基质:草炭土+ 细河沙 ( 1∶ 1)
2　结果和分析
2. 1　叶片再生不定芽
越橘离体叶片在暗培养 10 d后 ,叶片仍无明显
变化。接种 18 d后塞艾罗的离体叶片伤口处有少量
浅绿色不定芽形成 ;接种 20 d后其它品种均有不定
芽形成 ; 25～ 30 d不定芽丛大量形成 ;到 40 d后不
定芽数不再增加 ,再生数量基本稳定。此时调查不定
芽再生率和每个外植体产生不定芽数。结果表明 ,各
品种在添加不同激素的培养基上再生率有很大差
异。 WPM+ ZT的处理中各品种的再生效果要比在
WPM+ TDZ和 WPM+ BA+ NAA的处理中好的
多 ,W PM+ ZT( 5 mg· L- 1 )的处理中各品种的不定
芽再生率最高 ,可达 90%以上 ; ,而 WPM+ TDZ( 1
～ 3 mg· L- 1 )处理中各品种的再生率仅为 0% ～
30% ; WPM+ BA+ NAA处理中各品种仅分化出愈
伤组织 ,无不定芽形成。
不同激素水平同样影响不定芽再生。 WPM+
ZT ( 5 mg· L- 1 )处理的各品种再生率最高 ,而
WPM+ ZT( 1 mg· L- 1 )处理的各品种再生率则低
于 50% (数据未列出 )。WPM+ TDZ( 1 mg· L- 1 )处
理中各品种的外植体只有少数分化出不定芽 ,而在
WPM+ TDZ( 2 mg· L- 1 , 3 mg· L- 1 )处理中的各
品种的外植体无不定芽形成。
不同品种在同一激素浓度处理中分化时间和再
生率也有差别 ,塞艾罗开始分化的时间相对较早 ;日
出、都克次之 ;埃利奥特开始分化的时间较晚 ,分别
相差 1～ 2 d。但这 4个品种的再生率和单个叶片再
生不定芽数相差不大。在 WPM+ ZT的 3个浓度处
理中乔治亚姆的再生率最低 ,在培养过程中褐化较
严重 ,已影响了整体的再生率 (数据未列出 ) ,它的再
生体系仍需进一步探讨。 其它品种的再生体系基本
形成 ,能在试验和生产中应用。
表　 1　激素对高丛越橘不同品种再生的作用
Table　 1　Ef fect of hormones on regeneration of highbush blueberry cult ivars
编
号
No.
激素
Ho rmone concen tration
( mg· L- 1 )
ZT TDZ
塞艾罗
Sier ra
% (1) S /E( 2)
日出
Sunris e
% S /E
都克
Duke
% S /E
埃利奥特
Elliot
% S /E
1 3 0 81. 5b(3) 12. 7b 83. 3b 12. 0b 73. 3b 12. 0b 71. 9b 10. 2b
2 5 0 92. 5a 21. 5a 95. 0a 22. 1a 90. 0a 20. 0a 94. 7a 19. 8a
3 0 1 30. 0c 4. 6c 42. 5c 4. 6c 27. 4c 3. 0c 23. 0c 3. 1c
4 0 3 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d
5 0 5 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d
　　 ( 1)再生率 regen eration percent。 ( 2)平均每个外植体再生的不定芽数 mean num ber of sh oots per explant。 ( 3)数字后标记有不同字母的
为差异显著 (邓肯氏新复极差法 ) , p = 0. 05。
·213·第 2期 马怀宇等:高丛越橘离体叶片再生植株研究初报
2. 2　诱导不定芽生根及移栽
有研究者认为高丛越橘在试管内生根比较慢 ,
且生根率低。所以在以前的越橘微繁研究中 ,一般在
试管外生根或在弥雾条件下扦插试管幼枝生
根〔 4, 6, 7〕。 本试验中 ,将获得的不定芽接到增殖培养
基上进行增殖培养。 30 d后转移到生根培养基上诱
导生根。调查结果表明 ,供试的 4个品种其生根率各
不相同。 以日出生根率最高达 97% ;塞艾罗和埃利
奥特的生根率达 70% ;都克表现最差 ,生根率仅达
到 46% (表 2)。 最后把生根的植株移栽到温室中培
养 ,基质为草炭土+ 细河沙 ( 1∶ 1)。 3个月后的调查
结果表明 , 4个品种在温室中生长良好 ,成活率相差
不大 ,均达到 50%以上 (表 3)。
表　 2　高丛越橘品种离体叶片再生新梢的管内生根状况
Table　 2　 Rooting percent of adventitious shoots f rom leaves of h ighbush blueberry cultivars
品种
Cult ivars
接种数 No. of
ex plants
生根 Root ing
生根数 No. %　 ( P = 0. 05)
日出 ( Sun ri se) 100 97 97　 a　
塞艾罗 ( Sierra) 69 54 78. 3　 b
埃利奥特 ( Elli ot) 24 17 70. 8　 bd
都克 ( Duke) 92 43 46. 7　 c　
表　 3　高丛越橘不同品种的试管苗移栽成活率
Table　 3　 Survival percent of tube cultured plants f rom highbush blueberry leaves in greenhouse
品种
Cult ivars
移栽数 No. of
transplants
移栽成活 Tran splant survival
成活数 No. %　 ( P = 0. 05)
塞艾罗 ( Sierra) 100 520 63. 3　 a
日出 ( Sun ri se) 1 000 534 53. 4　 a
埃利奥特 ( Elli ot) 150 76 52. 5　 a
都克 ( Duke) 60 38 50. 7　 a
3　讨　论
　　越橘离体叶片再生在国外已有报道 ,国内仍无
相关报道〔6, 8〕。目前越橘离体叶片再生的研究所使用
的细胞分裂素类物质有 2ip、玉米素 ( ZT)、玉米素核
苷 ( ZT R)、 TDZ。 但不同的种和品种对以上各激素
的反应相差很大。例如 ,曾有人以日出、都克、蓝丰为
试材 ,对 2ip、玉米素、玉米素核苷促进越橘再生的效
果进行了比较〔6〕。结果表明 ,在添加 2ip和玉米素核
苷的处理中都克和蓝丰均未产生不定芽 ,但日出在
有玉米素核苷的处理中表现出色 ,不定芽数是添加
2ip处理的 5. 6倍 ,同样也好于添加玉米素的处理 ,
本试验的研究结果同样证明了这一点。以上 4种激
素中的任一种都不是对大多数种和品种的再生都有
良好的效果。从结果可以看出 ,添加玉米素 ( 5 mg·
L
- 1
)的处理中各品种再生率在 3种激素处理中最
高 ,达到 90%以上。所以作者认为在塞艾罗、日出、
都克、埃利奥特的再生试验中玉米素是较好的选择。
但乔治亚姆在上述处理中的再生率则低于 50%。因
此 ,乔治亚姆再生体系建立仍需进一步探讨。
在前人的越橘微繁研究中 ,还没有关于越橘试
管苗内生根的报道。 刘庆忠在越橘的微繁研究中首
次采用管内生根的方法 ,并获得了成功〔 3〕。本实验也
采用此方法。结果表明 ,不同品种生根率相差很大 ,
日出、塞艾罗、埃利奥特的生根率都在 70%以上 ,都
克的生根率偏低 ,未达到 50%。 但管内生根的方法
得到了验证 ,说明此方法对部分品种是适用的。虽然
试验中所用的品种均为高丛类型 (塞艾罗、日出、埃
利奥特为北高丛类型 ;乔治亚姆为南高丛类型 ) ,但
对其他种和品种的再生与生根具有一定的借鉴价
值。
参　考　文　献
〔1〕　李亚东主编 . 越橘 (蓝莓 )栽培与加工利用〔M〕. 长春:吉林科
学技术出版社 . 2002.
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〔3〕　陈慧都 ,郝瑞 ,关爱年 ,等 . 越橘工厂化育苗研究〔 J〕 . 中国农
业科学 , 1990, 23( 3): 44- 50.
·214· 东　北　农　业　大　学　学　报 第 35卷
〔 4〕　刘庆忠 . 高灌蓝莓微体繁殖技术研究初报〔 J〕 . 落叶果树 ,
2001, ( 5): 1- 3.
〔5〕　 Luby J J. Blu eberries and Cranberries (V accinium)〔 A〕 . Moon
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Regeneration of highbush blurberry plantlets
from leaf section
M A Huai-yu
1 , LI Ya-dong
1* , LIU Qing-zh ong
2 ,
ZHAO Hong-jun
2 , SUN Qing-rong
2
( 1. Jilin Ag ricul tu ral Universi ty, Ch angchun , Ji lin 130118 PRC; 2. Shandong Ins ti tu te of Pomolog y, Taian , Shandong 271000 PRC)
Abstract: Shoo t reg eneration f rom in v it ro leaf segments o f highbush blueberry ( Vaccinium
cor ymbosum L. ) , including four no rthern highbush blueber ry ( Sierra, Sunrise, Duke, Elliot ) and one
southern highbush blueber ry ( Geogiag em ) . Modified WPM was used as basic medium supplemented w ith
the cy tokinin zeatin. High regeneration f requency w as obtained at 5 mg· L- 1 zeatin, accounted for 90% .
Conversely , medium containing TDZ at 1, 2 or 3 mg· L- 1 only go t v ery low regeneration percent ( 0% ～
30% ). And medium with BA at 1, 3 o r 5 mg· L- 1 promoted no adventi tio us shoo ts f rom leaf segments. The
adventi tio us shoots w ere multiplied and ro oted. The plant lets w ere t ransplanted into g reenhouse and
established in the field.
Key words: in vi tro leaves; regenera tion; adventitious bud
编辑: 裴雪昆
·215·第 2期 马怀宇等:高丛越橘离体叶片再生植株研究初报