全 文 ：果 树 学 报 2009，26（5）: 725～728
Journal of Fruit Science
不同激素和黑暗处理对泰山红石榴
离体叶片再生的影响
陈海燕 1，陈延惠 2*，李东伟 3，李洪涛 4，达龙珠 1
（1河南省农业科学院农业与经济信息研究中心，； 2河南农业大学，郑州 450002；
3新郑市林业局，河南新郑 451100； 4郑州市园林科学研究所，郑州 450003）
摘 要: 以泰山红石榴为试材，研究了不同激素配比、黑暗处理时间等关键因素对泰山红石榴离体叶片愈伤组织诱
导和不定芽再生的影响。 结果表明，细胞分裂素是离体叶片再生不定芽所必需的。 生长素 2，4-D 与 IBA 组合诱导出
的愈伤组织生长量大，但不定芽再生率低。 黑暗处理时间以 2 周为宜。 适宜的再生培养基为 MS + KT 1.0 mg·L-1+BA
2.0 mg·L-1+ GA3 0.5 mg·L-1，不定芽再生率达 57.0％，每片叶再生芽数为 3.0 个。
关键词: 石榴； 泰山红； 离体叶片； 再生； 激素； 黑暗处理
中图分类号：S665．4 文献标识码：A 文章编号：1009－9980(2009)05－725－04
Effects of different hormone content and dark treatment on adventitious
bud regeneration of leaves in vitro from Taishanhong pomegranate culti-
var
CHEN Hai-yan1，CHEN Yan-hui2*，LI Dong-wei3，LI Hong-tao4
（1Research Center of Agricultural Economy and Information，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou，Henan 450002 China；
2Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan 450002 China； 3Xinzheng Forestry Bureau，Xinzheng，Henan 451100 China； 4Zhengzhou
Institute of Urban Landscape and Architecture，Zhengzhou，Henan 450003 China）
Abstract: The effects of different hormone contents and dark treatment time on the callus induction，adventitious bud regen-
eration of leaves in vitro from Taishanhong pomegranate cultivar were studied． The result showed that cytokinin was necessary
for leaves in vitro to regenerate adventitious buds and shoots． In the medium with 2，4-D and IBA，the leaves in vitro could be
induced to form abundant callus from which regeneration rate of adventitious buds was lower． Dark treatment was also an im-
portant factor for callus induction and the effect of two-week dark treatment after inoculation was the best． The optimum dif-
ferentiation medium was MS + KT 1.0 mg·L-1 + BA 2.0 mg·L-1+ GA3 0.5 mg·L-1，and the regeneration rate of adventitious
bud reached up to 57.0％，one leaf could be cultured to get 3.0 shoots averagely．
Key words: Punica granatum L．； Taishanhong cultivar； Pomegranate leaves in vitro； Regeneration； Hormone； Dark treat-
ment
石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica L.）植物，作
为栽培的只有一个种，即石榴（Punica granatum L.）。
泰山红石榴是山东省果树研究所 1984 年在泰山南
麓发掘出的优良地方品种，1996 年通过山东省农作
物品种审定委员会认定， 是目前国内优良石榴品种
之一。石榴离体培养比一般草本植物困难[1]。目前，石
榴组织培养研究取得一定进展，如胚培养 [2]、茎尖培
养[3]、生根培养[4]等，而关于石榴离体叶片再生的研究
较少。 离体叶片再生体系的建立是开展果树生物技
术育种的重要基础[5]。 为此，我们选用泰山红石榴为
试材，在前期研究泰山红石榴组织培养快速繁殖 [4]试
验的基础上，进一步从激素组合、黑暗处理等方面对
影响石榴离体叶片不定芽再生因素进行研究， 建立
了石榴离体叶片再生系统， 旨在为石榴生物技术育
收稿日期： 2009－02－26 接受日期: 2009－06－26
基金项目： 河南省科技攻关项目（072102150001）
作者简介： 陈海燕， 女， 助理研究员， 硕士， 主要从事果树生物技术研究和科技期刊编辑工作。 Tel: 0371-65739041， E-mail: chen-
haiyany@163．com
觹 通讯作者。 Author for correspondence． E-mail: chenyanhui188@163．com
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2009.05.012
果 树 学 报 26 卷
注： 不同小写字母表示差异显著 P<0.05，不同大写字母表示差异显著 P<0.01。
Note: Different small letters mean significant difference P<0.05. Different capital letters mean significant difference P<0.01.
表 1 不同激素配比对泰山红石榴离体叶片再生率的影响
Table 1 Effects of different hormone ration on adventitious bud regeneration of
leaves in vitro from Taishanhong pomegranate
种研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
供试材料为泰山红石榴试管苗的幼嫩叶片，为
河南农业大学园艺学院（原林学园艺学院）果树实验
室保存。试验于 2006年在河南农业大学园艺学院果
树实验室进行。
1.2 方法
试管苗继代培养基[4]为 MS + BA 1.0 mg·L-1+ IBA
0.1 mg·L-1， 蔗糖 30 g·L-1， 琼脂 6 g·L-1， 椰汁 200
mL·L-1，pH为 5.8。 取继代培养 20～30 d的组培苗顶
部 1～4 叶位正在伸展或已完全展开的幼嫩叶片，用
解剖刀切去叶尖和叶柄，并在叶片中脉处横切 2 刀，
但保持叶片完整， 然后把刻伤的叶片平铺在分化培
养基上，叶背面向下。 每个处理接种叶片 30枚，3次
重复。接种后先黑暗处理 2～3周（黑暗处理对石榴叶
片再生率的影响试验除外）， 然后转移到光下培养，
光强约为 1 500～2 000 lx，光照时间为 16 h·d-1，培养
温度为（25±1）℃，培养条件下同。
1.2.1 叶片再生率测定 以 MS 为基本培养基，附
加不同种类和质量浓度的激素 （细胞分裂素为 BA、
KT，生长素为 IBA、2，4-D，赤霉素为 GA3）组成离体
叶片再生培养基配方，不同处理配比见表 1。 70 d统
计叶片再生率和每片叶再生芽数， 芽以高度≥0.5
cm 为准。 叶片再生率（%）=（再生芽叶片数 ／接种叶
片数）×100；每片叶再生芽数（个）=叶片再生不定芽
总数/再生不定芽的叶片数。
1.2.2 愈伤组织诱导率测定 以 MS为基本培养基，
附加 BA 2.0 mg·L-1+ KT 1.0 mg·L-1+ GA3 0.5 mg·L-1，
在不同的光照条件下进行培养。 黑暗处理的时间分
别为 1，2，3，4 周，然后转为光照培养。40 d统计愈伤
组织诱导率。 愈伤组织诱导率（%）=（诱导出愈伤组
织的叶片数/接种的叶片数）×100
1.2.3 再生植株生根成苗 当幼梢长到 3～5 cm时，从
基部切下，转入生根培养基 1/2MS+NAA1.2 mg·L-1[4]
上，先暗培养 7 d，然后放入光照培养箱培养，培养温
度（26±1）℃。
1.3 数据处理
试验数据采用邓肯氏新复极差测验法进行比
较。
2 结果与分析
2.1 泰山红石榴离体叶片诱导不定芽的形态分化
过程
离体叶片暗培养 1周后，叶片呈黄绿色，切伤处
颜色加深，叶片膨胀发皱，此时易褐变和污染。 培养
3周后，叶片极度膨胀皱缩（图版-A）。 培养 30 d后，
叶片继续膨大，产生大量绿色颗粒状、不透明的愈伤
组织，有微小的芽眼出现（图版-B）。 继续培养 60 d
后，愈伤组织成绿白色，其上分化不定芽（图版-C）。
叶片不定芽发生的部位和方式不一样， 有的芽直接
处理编号
No.of treatment
激素配比 Hormone ration/mg·L-1 每片叶再生芽数（个）
No. of adventitious bud per leaf
再生率
Regeneration rates/%BA KT 2，4-D IBA GA3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
3.0
3.0
3.0
3.0
4.0
4.0
4.0
4.0
5.0
5.0
5.0
5.0
-
-
-
2.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3.0
3.0
4.0
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3.0
4.0
0.1
0.1
0.3
0.3
0.1
0.1
0.3
0.3
0.1
0.1
0.3
0.3
0.1
0.3
0.1
-
0.1
0.3
0.3
-
0.3
-
0.3
-
0.3
-
0.3
-
0.3
-
0.3
-
-
0.5
-
-
2.8 dCD
2.6 eDE
2.6 eDE
0.0 jI
1.8 gF
1.1 iH
3.5 bB
1.0 iH
2.5 eE
2.0 fF
1.0 iH
1.5 hG
5.0 aA
1.0 iH
1.0 iH
3.0 cC
2.0 fF
1.0 iH
18.5 iI
43.0 dD
44.0 cC
0.0 o O
37.0 eE
32.0 fF
52.0 bB
5.6 mM
25.0 hH
11.0 jJ
5.5 mM
6.5 lL
9.0 kK
27.0 gG
44.0 cC
57.0 aA
5.0 nN
5.0 nN
726
5 期 陈海燕等: 不同激素和黑暗处理对泰山红石榴离体叶片再生的影响
从叶片再生出来，有的芽从愈伤组织长出。不定芽大
多数发生在叶基部、叶脉和切口处。不定芽生长的方
向也不一致，有的向上、有的向下、有的侧向生长，但
以向上生长为主。 继续培养 70 d 后，部分不定芽长
成高约 1～2 cm的幼梢。 3 个月后，幼梢高约 4～6 cm
（图版-D）。
2.2 不同激素配比对泰山红石榴叶片再生率的影
响
从表 1可以看出， 细胞分裂素是离体叶片愈伤
组织分化不定芽所必需的。 在处理 1～12 中 BA 与
IBA 组合可以很好地诱导出愈伤组织并且分化出不
定芽，其中处理 7不定芽再生率高达 52.0%。随着细
胞分裂素质量分数的升高， 不定芽再生率呈先升高
后下降趋势。 处理 3，7，11 中 IBA 和 GA3质量浓度
保持不变 ， 不定芽再生率在 BA 3.0 mg·L-1时为
44%，在 BA 4.0 mg·L-1时上升为 52%，在 BA 5.0 mg·
L-1下降为 5.5%，差异极显著。 生长素 2，4-D与 IBA
组合也能诱导出愈伤组织，但不定芽再生率低，处理
17、18中不定芽再生率仅为 5.0%。
从处理 13，14，15 可以看出，随着 KT 质量浓度
提高，再生效率提高。 KT质量浓度为 3.0 mg·L-1时，
叶片再生率达到 27.0%；KT 质量浓度为 4.0 mg·L-1
时，再生率达 44%。 而 KT 1.0 mg·L-1，BA 2.0 mg·L-1
配合使用时效果最好，再生率可达 57.0%。
通过以上分析可以得出， 石榴叶片适宜的再生
培养基为 MS+KT 1.0 mg·L-1 +BA 2.0 mg·L-1 +GA3
0.5 mg·L-1 ，其再生率达 57.0%，每片叶再生芽数为
3.0个。
2.3 不同黑暗处理时间对泰山红石榴离体叶片愈
伤组织发生的影响
黑暗处理 1周，叶片产生的愈伤组织体积小，诱
导率为 20.1%（表 2）， 颜色呈暗绿色。 黑暗处理 2
周，愈伤组织体积较大，诱导率为 85.6%，颜色呈绿
色。 黑暗处理 3周，愈伤组织生长量最大，诱导率为
80.5%，颜色呈黄绿色。 黑暗处理 4 周，愈伤组织体
积较大，诱导率为 76.3%，颜色呈绿色。因此，泰山红
石榴黑暗处理时间以 2周为宜。
2.4 泰山红石榴离体叶片诱导再生植株生根成苗
幼梢转入生根培养基生长 30 d 后平均根数为
6～7 个·株 -1 ，根粗壮且发育整齐（图版-E）。 生长
45 d 的根系呈褐色、粗壮、木质化，移栽成活率较
高。 温室炼苗基质选用高温灭菌的蛭石+草炭土（1∶
2），存活率可达 80%。
3 讨 论
光对叶片愈伤组织的诱导有很大的影响[6]。在很
多植物中都发现黑暗处理可以促进不定芽的形成。
George[7]认为黑暗处理可减少外植体酚类物质的溢
出，有利于不定芽的分化。不同树种对黑暗处理的时
间长短要求不同。 黑暗处理时间过长或过短对叶片
的再生都会产生不利影响。 时间过短脱分化没有完
成，愈伤组织体积小，诱导率降低；时间过长离体叶
片因长时间不进行光合作用饥饿死亡，也会降低再生
率，且再生芽黄化、细弱，有待于进一步壮苗培养 [8]。
本试验中， 泰山红石榴离体叶片黑暗处理时间以 2
周为宜，当叶片由暗培养转至光下时，前期用弱光，
后期在强光下培养， 可以降低石榴离体叶片的褐化
率，提高愈伤组织诱导率。
细胞分裂素是离体叶片愈伤组织分化不定芽所
必需的。 本试验结果表明，KT、BA 组合诱导出的愈
伤组织质地略疏松，颜色浅绿至乳白色，不定芽分化
率较高；而生长素 2，4-D 与 IBA 组合诱导出的愈伤
组织生长量大，质地疏松，颜色发暗，呈黄褐色，不定
芽再生率低，仅为 5%。 GA3是否有利于愈伤组织的
诱导分化，还需要进一步的研究。
浆果类果树如葡萄、 石榴离体再生普遍较为困
难，再生率较低且重复性差。陶建敏等[9]研究表明，美
人指葡萄茎段外植体再生率达 75%，平均每个茎段
再生 1.94 个芽。 有关石榴离体叶片再生的研究较
少。 本试验中统计再生芽叶片数时，芽以高度≥0.5
cm 为准，泰山红石榴叶片再生率为 57.0％，平均每
叶再生 3.0个芽。 本试验中，从石榴离体叶片到形成
愈伤组织约 30 d， 但是愈伤组织分化出芽眼到不定
芽形成的过程历时较长， 而樱桃砧木 CAB-6p 的离
体叶片再生需 60 d [5]， 寒富苹果离体叶片再生仅需
40 d[10]，其原因有待进一步研究。 （本文图版见插 1）
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liferation in vitro[J]． HortScience，1986，21（3）: 516-518．
表 2 不同黒暗处理时间对泰山红石榴离体叶片
愈伤组织发生的影响
Table 2 Effects of dark treatment time on the callus
induction of leaves of Taishanhong pomegranate
黑暗处理时间（周）
Dark treatment time（week）
愈伤诱导率
Callus induction rate/%
1
2
3
4
20.1 dD
85.6 aA
80.5 bB
76.3 cC
727
《中国南方果树》是由农业部主管，中国农业科学院柑桔
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