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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):219-224
收稿日期 ：2015-04-14
基金项目 ：国家自然科学基金项目（81272350，81472999）
作者简介 ：苏甲林，男，学士，研究方向 ：泌尿系肿瘤与表观遗传学 ；E-mail ：sujialin125@126.com
通讯作者 ：纪卫东，男，博士，研究方向 ：泌尿系肿瘤与表观遗传学 ；E-mail ：wdji2008@163.com
建立 CRISPR/Cas9 慢病毒系统高效敲除人源
AIP1 基因
苏甲林1  阙彪1  张继勤2  李锦辉1  王敏2  纪卫东2
（1. 广州医科大学附属第一医院，广东省泌尿外科重点实验室，广州 510230 ；2. 中山大学附属第一医院，广州 510080）
摘 要 ： 旨在构建 AIP1 基因 CRISPR/Cas9 敲除体系，获得高效、稳定、永久性 AIP1 敲除的人胚肾细胞株（293T）。针对
AIP1 的外显子设计 3 个 20 bp 的 sgRNA（sp1、sp2 和 sp3）。与 PX458 载体连接，构建 PX458-sgRNA 敲除表达载体。T7E1 实验
评估敲除效率。将敲除效率最高的 sgRNA 与 lentiCRISPRv2 慢病毒载体连接，构建 lentiCRISPRv2-sgRNA 敲除表达载体，将阳性
重组质粒导入病毒包装细胞 293T 中，收集病毒上清液转染 293T 细胞。对敲除成功的 293T 细胞通过有限稀释法构建敲除 AIP1 基
因的稳定细胞株。Western blot 测定转染后 293T 细胞中 AIP1 蛋白的表达量。结果显示，测序证实 AIP1 的 3 个靶序列分别正确插
入 PX458 表达载体中，T7E1 实验证实 AIP1sgRNAsp2 靶向敲除效率最高 ；成功构建 lentiCRISPRv2-sgRNAsp2 AIP1 敲除表达载体，
并包装病毒，感染 293T 细胞 ；Western blot 证实获得稳定的 AIP1 基因表达缺失的 293T 细胞株。建立了能稳定敲除 AIP1 基因的
CRISPR/Cas9 慢病毒系统，成功获得 AIP1 敲除的 293T 稳定细胞株。
关键词 ： CRISPR/Cas9 ；慢病毒 ；AIP1 ；稳定细胞株
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.032
Establishment of a CRISPR/Cas9 Lentiviral System for Knockout Gene
AIP1 of Human
Su Jialin1 Que Biao1 Zhang Jiqin2 Li Jinhui1 Wang Min2 Ji Weidong2
（1. The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangdong Key Laboratory of Urology，Guangzhou 510230 ；
2. The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080）
Abstract ： This work aims to establish the CRISPR/Cas9 system of knocking out gene AIP1 for producing nephocyte cell（293T）of
human embryo in which gene AIP1 efficiently, stably and permanently is knocked out. Three 20 bp sgRNAs（sp1, sp2 and sp3）targeting
AIP1 exons were designed and inserted in PX458 vector to construct PX458-sgRNA expression vector for knockout. CRISPR/Cas9 efficiency
of knockout was assessed using T7E1 assay. sgRNA of the maximum knockout efficiency was inserted into lentiCRISPRv2 vector to construct
lentiCRISPRv2-sgRNA expression vector. The correct recombinant plasmid was transfected into 293T cells. The supernatant was collected and
filtered, and then infected the 293T cells. The stable 293T cell lines were generated by limiting diluting the cells in which genes AIP1 were
knocked out successfully. The expression level of AIP1 in the stable 293T cells were detected by Western blot. Three sgRNAs of AIP1 were
correctly inserted into PX458 vector respectively, T7E1 verified that the knockout rate of AIP1sgRNAsp2 was the maximum. LentiCRISPRv2-
sgRNAsp2 expression vector of AIP1-knockout was successfully constructed, and infected 293T cells. The stable 293T cell lines with AIP1-
expression-deficient were obtained by Western blot. In conclusion, the stable 293T cell lines of AIP1-knockout were successfully generated by
CRISPR/Cas9 system, which provides the foundation for further studying the functions of AIP1 gene.
Key words ： CRISPR/Cas9 ；lentiviral ；AIP1 ；stable cell lines
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8220
AIP1（Apoptosis signal-regulating kinase 1-intera-
cting protein-1，又称为 DAB2IP）是近来鉴定的 Ras-
GTP 酶活化蛋白家族新成员，其基因定位于人染
色 体 9q33.1-9q33.3 上， 含 有 1 个 开 放 阅 读 框 架，
cDNA 全长 6.3 kb，编码 1 065 个氨基酸、分子量为
120 kD 左右的蛋白质。AIP1 蛋白的 N 端有参与膜蛋
白定位的 PH 结构域、细胞信号凋亡调节酶 1 结合
有关 C2 结构域和抑制 Ras 信号通路的 GAP 结构域；
C 端有抑制核转录因子 NF-κB 信号通路有关的 PER
结构域和调控 PI3K-Akt 信号通路的 PR 结构域［1］。
AIP1 是新发现的一种抑癌基因，它通过介导多种肿
瘤相关信号通路，如 MAPK-ERK、PI3K-Akt、ASKl-
JNK 和 GSK-3β-β-catenin 等，影响细胞的增殖、存
活和凋亡［2-4］。研究发现 AIP1 在前列腺癌、肝细胞
癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤的发生发
展中起重要作用［5-9］。
目前，普遍使用基因敲减技术敲低目的细胞
AIP1 基因研究 AIP1 基因功能，但是基因敲减技术
仅影响 mRNA 降解，不能完全沉默目的细胞 AIP1
基因的表达，对充分研究 AIP1 基因功能有一定的局
限性。本实验利用 CRISPR/Cas9 系统构建 AIP1 基
因敲除质粒，并用慢病毒系统进行包装，旨在建立
CRISPR/Cas9 慢病毒系统敲除人源性细胞系 AIP1 基
因的方法，为深入研究 AIP1 基因功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
人 胚 肾 细 胞 株（293T） 购 于 美 国 ATCC 细 胞
库，PX458 和 lentiCRISPRv2 质粒购于 Addgene 公司，
Bbs I 酶、BsmB I 酶、T4 DNA 连接酶和 T7E1 酶购自
New England Biolabs（NEB）公司，质粒抽提试剂盒
购自 Qiagen 公司，DNA 提取试剂盒购自 TaKaRa 公
司，Lipofectamine® 2000 试剂、高糖 .DMEM 培养基、
胎牛血清和胰酶均购自 Gibco 公司，寡核苷酸序列
由上海捷瑞公司合成。
1.2 方法
1.2.1 sgRNA 寡核苷酸链合成 我们使用 CRISPR
在线设计工具（http ：//crispr.mit.edu/）根据评分系
统，分别在 AIP1 的外显子 6 和 16 设计 3 个 20 bp
的 sgRNA（sp1、sp2 和 sp3）（ 图 1）。 分 别 在 编 码
链模板 5 端添加 CACCG，非编码链模板 5 端添加
AAAC，3 端添加 C，设计 3 对 CRISPR 寡核苷酸链，
由上海捷瑞公司合成。设计 sgRNA 及序列见表 1。
~60 bp ~220 bp ~180 bp ~130 bp
exon16exon7exon6 intron
sp2 sp3
sp1
图 1 CRISPR/Cas 靶序列在 AIP1 基因的位点及扩增靶序
列位点引物示意图
表 1 AIP1 靶向位点及 sgRNA 寡核苷酸序列
名称 序列（5-3） 位置
AIP1sgRNAsp1oligo1 caccgAAGTACCTGCAGGACGCCCT exon 6
AIP1sgRNAsp1oligo2 aaacAGGGCGTCCTGCAGGTACTTc
AIP1sgRNAsp2oligo1 caccgCCTGCAGGACGCCCTAGGTA exon 6
AIP1sgRNAsp2oligo2 aaacTACCTAGGGCGTCCTGCAGGc
AIP1sgRNAsp3oligo1 caccgGGACCCAGGCGCTGCATACA exon 16
AIP1sgRNAsp3oligo2 aaacTGTATGCAGCGCCTGGGTCCc
1.2.2 载体构建 将两条 sgRNA 寡核苷酸单链化学
合成双链，连接至 Bbs I 酶切线性化的 PX458 质粒 ；
转化到 stbl3 感受态细胞中，挑取阳性单克隆菌落抽
提质粒并送广州艾基生物测序验证。将重组质粒分
别 命 名 为 ：PX458-sgRNAsp1、PX458-sgRNAsp2 和
PX458-sgRNAsp3。将 sgRNAsp2 与 BsmB I 酶切后的
lentiCRISPRv2 载体使用上述方法连接，并测序验证。
1.2.3 敲除效率验证 细胞培养和细胞转染 ：293T
细胞用含 10% 胎牛血清的高糖 DMEM 培养基于 5%
CO2，37℃恒温培养。转染前 24 h，取对数期细胞以
5×105/ 孔接种到 6 孔板培养，将其分组为 ：PX458
（阴性对照组）、PX458-sgRNAsp1、PX458-sgRNAsp2
和 PX458-sgRNAsp3。将相应的敲除质粒及阴性对照
质粒各 2 μg 经 Lipofectamine® 2000 试剂瞬时转染到
293T 细胞中，转染 48 h 后消化收集各组细胞，提取
基因组 DNA。采用 T7E1 实验进一步验证敲除效率 ：
根据 BLAST 分别设计 3 条靶向序列的引物（表 2）。
PCR 扩增目的片段，纯化后使用 PCR 仪进行变性退
火。加入 10 U T7E1 酶，37℃水浴 15 min，加入 2 μL
0.5 mol/L EDTA 终止反应。使用 2% 的琼脂糖凝胶
DNA 电泳，检测敲除效率。
1.2.4 慢病毒载体包装 将重组质粒 lentiCRISPRv2-
sgRNAsp2 和 lentiCRISPRv2 空载体各 1.2 μg 分别与
2015,31(8) 221苏甲林等：建立 CRISPR/Cas9 慢病毒系统高效敲除人源 AIP1基因
包装质粒 pCMV-R8.2 0.6 μg 及辅助质粒 VSV-G 1.2
μg 混合，分别稳定转染 293T 细胞 ；转染 12 h 后，
弃去培养基，加入 3 mL 培养基置 37℃继续培养 ；
48 h 后收集，0.45 μm 滤器过滤并分装病毒上清液。
加入新鲜培养基继续培养 ；24 h 后再次收集含病毒
上清液的培养基。-80℃保存。
1.2.5 嘌呤霉素对 293T 细胞的最小致死量筛选 将
293T 细 胞 种 入 6 孔 板 培 养， 待 细 胞 融 合 度 达 到
70%-80% 时，按照下列浓度加入嘌呤霉素（μg/mL）：
0、0.5、1.0、1.5、2.0 和 2.5，隔天换液，并保持培
养基的嘌呤霉素浓度恒定。第 3 天能够使 293T 细胞
全部死亡的最小浓度为 1.0 μg/mL。
1.2.6 构建稳定细胞株 待 293T 细胞融合度达到
50% 时更换 1 mL 培养基，加入 1 mL 病毒上清液和
1.6 mL polybrene（终浓度 8 μg/mL），6 h 后换正常培
养基培养。48 h 后重复感染一次，感染完毕后换正
常培养基培养。48 h 后加入嘌呤霉素（1.0 μg/mL），
维持嘌呤霉素浓度 7 d，对于筛选出的阳性克隆，消
化收集各孔细胞并计数，采用有限稀释法稀释至终
浓度为每 100 μL 培养基 0.5 个细胞，按每孔 200 μL
细胞稀释液加至 96 孔板［10］。显微镜下观察只含有
单个细胞的孔并标记。待单个细胞生长至细胞团时
逐级扩大培养，取少量细胞提取基因组 DNA，经
PCR 扩增后测序与野生型基因组对比，检测 AIP1 是
否成功敲除。对缺失突变碱基最多的细胞株进行扩
大培养，提取细胞蛋白，Western blot 检测单克隆细
胞 AIP1 蛋白表达量。
2 结果
2.1 重组质粒载体的检测结果
分别在 AIP1 的 3 条靶序列添加粘性末端，化
学 合 成 sgRNAsp1、sgRNAsp2 和 sgRNAsp3 与 酶 切
后的 PX458 质粒连接，转化到 stbl3 感受态细胞中，
挑取阳性单克隆菌落抽提质粒。广州艾基生物公司
测 序 结 果（ 图 2） 显 示，sgRNAsp1、sgRNAsp2 和
sgRNAsp3 分别正确插入 pX458 载体中。
2.2 AIP1靶向序列的筛选
将 PX458 空 载 体 及 PX458-sgRNAsp1、PX458-
sgRNAsp2 和 PX458-sgRNAsp3 分别瞬时转染至 293T
细胞，转染 48 h 后，荧光显微镜下观察 4 组 293T
细胞都有绿色荧光蛋白表达（图 3），消化收集各组
细胞，提取基因组 DNA。PCR 扩增含有 sgRNA 的
目的片段，纯化后加入 T7E1 酶反应，琼脂糖凝胶
DNA 电泳发现与对照组比较 sgRNAsp1、sgRNAsp2
和 sgRNAsp3 都有两条切开的条带，其中 sgRNAsp2
切开效果最显著，表明 AIP1sgRNAsp2 靶向敲除效
率最高（图 4）。
2.3 构建敲除AIP1基因的293T稳定细胞株
为 了 提 高 转 染 效 率， 将 sgRNAsp2 连 接 到
lentiCRISPRv2 慢病毒质粒，和空载体分别转染至
293T 细胞，收集病毒液，感染正常 293T 细胞，嘌
呤霉素筛选出阳性克隆，有限稀释法稀释至单个细
胞，逐级扩大培养，培养出 6 个单克隆稳定细胞株
与其野生型基因组 DNA 比较，发现目的片段中出现
了不同碱基数的缺失突变和插入突变（图 5）。
对缺失突变碱基最多的细胞株和转染空载体细
胞株进行扩大培养，提取细胞蛋白，Western blot 检
测敲除 AIP1 基因的 293T 细胞与对照组比较，发现
AIP1 蛋白表达缺失（图 6），表明已敲除 393T 细胞
中 AIP1 基因。
3 讨论
随着生物学研究的发展，基因组编辑技术为
了 解 特 定 基 因 的 功 能 提 供 了 基 础。 目 前 ZFNs 和
TALENs 技术突破了传统的基因组定点编辑，但其
具体操作对实验要求较高，耗时较长，较难广泛普
及。而 CRISPR/Cas9 系统可以对任何后面紧随 NGG
（PAM）的 20 bp 的序列进行编辑，能同时作用于多
个靶位点［11］。此外，载体构建简单，针对特定基
因位点只需要设计 sgRNA，不需要对每个基因编辑
位点都设计和组装两个核酸酶。CRISPR/Cas9 系统
具有简单灵活、特异性高、细胞毒性低等特点，可
以对特定基因组位点进行切割置换［12］。与 RNAi 技
术比较，CRISPR/Cas9 系统通过 RNA 识别 DNA 序
表 2 扩增靶序列引物
名称 序列（5-3）
AIP1 sgRNA（sp1/sp2）F ATCTTCCGGGAGAACACACT
AIP1 sgRNA（sp1/sp2）R GAGTTGATGATCTTGCAGAAG
AIP1 sgRNAsp3F GCATTAGAAACAAAAGCCCGC
AIP1 sgRNAsp3R AGGGCCTTTGCTCAGAATCTGCA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8222
列然后再改变 DNA 序列是可以遗传的［13］。本研究
构建的 lentiCRISPRv2-sgRNAsp2 质粒携带有化脓性
链球菌Ⅱ型 CRISPR/Cas9 系统的 Cas9 核酸内切酶
基因，在转染进细胞后可以表达该核酸内切酶。通
过 T7E1 实验检测 sgRNA 靶位点的切割效率，发现
sgRNAsp2 在 AIP1 基因目的位点产生切割的效率高
达 51.8%。 连 接 sgRNAsp2 到 慢 病 毒 lentiCRISPRv2
载体，更高效稳定的转入 293T 细胞。在细胞亚克隆
中，有 6 个单克隆细胞基因组在目的片段中出现了
CGAAACACCGAAGTACCTGCAGGACGCCCTGTTTTAGA
C G A A A C A C C G A A G T A C C T G C A G G A C G C C C T G T T T T A G A
CGAAACACCGCCTGCAGGACGCCCTAGGTAGTTTTAGA
C G A A A C A C C G C C T G C A G G A C G C C C T A G G T A G T T T T A G A
CGAAACACCGGGACCCAGGCGCTGCATACAGTTTTAGA
C G A A A C A C C G G G A C C C A G G C G C T G C A T A C A G T T T T A G A
PX458-sgRNAsp3
PX458-sgRNAsp2
PX458-sgRNAsp1
图 2 质粒序列测序图
A B
C D
A ：PX458 ；B ：PX458-sgRNAsp1 ；C ：PX458-sgRNAsp2 ；
D ：PX458-sgRNAsp3
图 3 PX458 空载及 3 组 PX458-sgRNA 转染至 293T 细胞
M 1 32 4 65 7 8 10 M
5000
bp
4000
3000
2000
1000
9
M ：DNA Marker ；1 ：sp1 ；2 ：sp1 无酶 ；3 ：sp2 ；4 ：sp2 无酶 ；5 ：空载 ；6 ：空载
无酶 ；7 ：sp3 ；8 ：sp3 无酶 ；9 ：空载 ；10 ：空载无酶 ；T7E1 酶切 PCR 产
物包含两个大小片段
图 4 检测 3 个 sgRNA 的靶向敲除效率
2015,31(8) 223苏甲林等：建立 CRISPR/Cas9 慢病毒系统高效敲除人源 AIP1基因
不同碱基数的突变。对缺失突变碱基最多的细胞株
进行扩大培养，建立稳定敲除 AIP1 的 293T 细胞株。
将目的基因连接到载体并转染至目的细胞是获
得长期稳定表达细胞株的关键步骤。目前，转染目
的细胞常用的基因导入载体主要是质粒载体和病毒
载体。质粒载体适用于短时间的活细胞示踪，转染
率相对较低，且对目的基因干预作用弱。与质粒载
体相比，病毒载体具有转染率高、目的基因长期稳
定表达及适用范围广等优势。因此，越来越多的研
究人员更倾向于使用病毒载体转染，包括腺病毒、
慢病毒和逆转录病毒 3 种表达系统，其中慢病毒载
体系统适用细胞类型广泛，可稳定转染目的基因，
能整合外源基因进入目的细胞达到稳定表达，是目
前基础和临床应用研究中使用最广泛的一类载体。
本实验利用慢病毒载体系统转染 293T 细胞具有较高
的转染率，成功的获得长期、稳定敲除 AIP1 基因的
细胞株。
最近研究发现，AIP1 作为一个新发现的抑癌
基因，不仅在肿瘤细胞的增殖存活和凋亡过程中扮
演着重要角色，还参与调控动脉硬化、腹主动脉瘤
及早发性心肌梗死等多种非肿瘤性疾病的发生发
展［14，15］。本研究构建目的细胞 AIP1 基因敲除的细
胞系，是深入研究 AIP1 基因功能的前提基础。
4 结论
本 研 究 结 合 慢 病 毒 系 统 的 稳 定 转 染 功 能 和
CRISPR/Cas9 系统的敲除功能，建立了 CRISPR/Cas9
慢病毒系统，充分发挥了慢病毒包装系统与 Cas9 系
统的优势，永久性敲除目的细胞 AIP1 基因，获得敲
TAGTGGGCCAGAAGTACCTGCAGGACGCCCTAGGGTAGGGAGTGGGCCAGCAGCAGGGC
TAGTGGGCCAGAAGTACCTGCAGGACGCCCTAGGTAGGGAGTGGGCCAGCAGCAGGGC
TAGTGGGCCAGAAGTACCTGCAGGACGCCCTT-----------------GTGGG--CA----C------CAGGGC
TAGTGGGCCAGAAGTACCTGCAGGACGCCCT-------------GGGCAGAGGGTGGG--GCAGGGC
TAGTGGGCCAGAAGTACCTGCAGGACGCCCTA----------GGGAGTGGGCCAGCAGCAGGGC
TAGTGGGCCAGAAGTACCTGCAGGACGCCC----------TAGGGAGTGGGCCAGCAGCAGGGC
TAGTGGGCCAGAAGTACCTGCAGGACGCC--------------------------------------AGCAGCAGGGC
T A G T G G G C C A G A A G T A C C T G C A G G A C G C C C T A G G G T A G G G A G T G G G C C A G C A G C A G G G C
T A G T G G G C C A G A A G T A C C T G C A G G A C G C C C T A G G T A G G G A G T G G G C C A G C A G C A G G G C
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T A G T G G G C C A G A A G T A C C T G C A G G A C G C C A G C A G C A G G G C
Insertion mutant
-18 bp
-4 bp
-4 bp
-7 bp
-13 bp
+1 bp
Deletion mutants
Deletion
mutants
Wild-type
Wild-type
Insertion
mutant
图 5 单克隆细胞在目的 sgRNA 位点的缺失突变
AIP1
Control KO-AIP1
GAPDH
图 6 稳定细胞株中 AIP1 蛋白的表达
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8224
除 AIP1 基因的稳定细胞株。证实了 CRISPR/Cas9 慢
病毒系统的可行性，为进一步构建其他 AIP1 基因敲
除的人源性细胞系提供了一种简单、高效的方法。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）