全 文 ：文章编号:　0490-6756(2006)01-0190-06
收稿日期:2005-05-12
基金项目:国家自然科学基金(2003CB114305);河南省高校杰出科研人才创新工程[ 2005KY(x010)] ;
河南大学自然科学基金
＊通讯作者.E-mail:songcp@henu.edu.cn
ABA 对拟南芥 los5-1突变体及其野生型保卫
细胞质膜内向 K +通道的调节
薛瑞丽 , 周 云 , 安国勇 , 江 静 , 吕 东 , 苗 琛 , 宋纯鹏＊
(河南大学生命科学学院 , 河南省植物逆境重点实验室 ,河南开封 , 475001)
摘要:以拟南芥(Arabidopsis thal iana)ABA 缺失突变体 los5-1 及其相应野生型为材料 ,用细
胞质膜钙离子通道的抑制剂 LaCl3和细胞内钙离子的螯合剂 EGTA处理 ,运用膜片钳技术探
讨在 ABA 调节突变体和相应野生型保卫细胞质膜内向 K+电流过程中 Ca2+的作用.实验结
果表明ABA均可以明显抑制拟南芥 C24野生型及其突变体 los5-1保卫细胞原生质体的内向
K
+电流 ,而且 ABA 对 los5-1突变体及其相应野生型保卫细胞质膜内向 K+通道的调节具有
不同的 Ca2+依赖性 ,说明ABA对突变体和野生型的 K+通道的调节可能通过不同的信号转导机
制.
关键词:膜片钳;内向 K+电流;ABA;Ca2+
中图分类号:Q942　　　文献标识码:A
干旱 、盐渍 、低温等多种环境胁迫均可导致植物细胞的渗透胁迫 ,影响植物正常的生长发育 ,许多证据
表明在植物感受众多胁迫(干旱 、低温 、盐渍等)时 ,植物会大量积累 ABA ,产生的 ABA作为植物逆境胁迫
应激激素从而启动细胞内特定的信号转导网络 ,调节许多生理生化过程使植物产生抗逆反应[ 1～ 4] .因而 ,
从理论上认识和研究植物 ABA的信号转导机制 ,并通过生物技术手段提高作物抗逆性是当前生命科学研
究领域中非常重要的基础研究课题和迫切需要解决的生产实践问题.
ABA可以诱导气孔关闭 ,抑制气孔张开[ 5] .在气孔开闭过程中 ,保卫细胞内的 K+扮演着重要的角
色 ,保卫细胞可以通过内向 K+通道吸收 K+导致气孔开放[ 6] .ABA可以引起保卫细胞内游离 Ca2+浓度
升高或细胞质碱化[ 7] ,胞质 Ca2+浓度升高抑制内向 K+通道活性 ,抑制 K+吸收[ 8] ,细胞质碱化也可抑制
保卫细胞内向 K+通道活性 ,降低保卫细胞的 K+吸收[ 9] .但是上述许多结果均是在外源 ABA 作用下取
得 ,对于内源ABA和外源 ABA如何调节保卫细胞质膜 K+通道活性仍然未知.los5-1是一个拟南芥内源
ABA合成缺失突变体[ 10] ,其突变基因 los5-1为拟南芥 aba3的等位基因.los5-1/ aba3编码一钼辅因子硫
化酶(MCSU),该酶催化 MoCo 的硫化 ,硫化的 MoCo 是ABA醛氧化酶(催化 ABA 合成的最后一步)发挥
功能所必需的.因而与正常野生型相比 ,突变体在生理功能上不能内源合成 ABA.本文以突变体 los5-1
及其野生型为材料 ,利用膜片钳技术分析了外源 ABA处理对突变体和相应野生型的保卫细胞质膜内向 K+电
流的影响 ,并进一步分析胞内Ca2+信使系统在外源ABA和内源调节气孔保卫细胞内向K+通道中的作用.
1　材料与方法
1.1　实验材料
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana C24)及 ABA缺失突变体 los5-1种子由美国 Arizona大学朱健康
教授提供.
2006年 2月
第 43卷第 1期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edi tion)
Feb.2006
Vol.43　No.1
1.2　实验方法
1.2.1　材料培养　野生型拟南芥种子播种于花卉营养土与蛭石比例为 1∶1的混合土壤中生长.生长条件
为:光/暗周期 8/16 h ,光照温度 22℃,黑暗温度 18℃,相对湿度 80%,光照强度 120 μmol·m-2·s-1 ,取正
常生长 4 ～ 6周 、莲座叶片的第三层平展叶片作为实验材料.
1.2.2　保卫细胞原生质体的制备　参照已发表的方法[ 11 , 12] 略加修改.取生长 4 ～ 6周的拟南芥叶片 ,
4℃冷水中冰浴10min ,转入100mL冷蒸馏水中打制 3次 ,速度约为 8000 ～ 10000r/min ,时间分别为1min ,
30s , 30s , 用 220μm 的尼龙网过滤 , 基本介质(5mmol/L M es 、0.5mmol/L CaCl2 、0.5mmol/L M gCl2 、
10μmol/L KH2PO4 、0.5mmol/L 抗坏血酸 ,pH 5.5)漂洗后转入酶液(1.3%纤维素酶 RS 、0.0075%果胶酶
(Pectoly ase Y-23)、0.25%牛血清蛋白 、0.5 mmol/L 抗坏血酸溶于基本溶液中 ,pH 5.5)中 ,在 23℃, 60r/
min的摇床上酶解约 50 ～ 60min , 用 20μm 的尼龙网过滤 , 然后在 450r/min的条件下 ,离心 2 ～ 3次 ,弃去
上清 ,用基本溶液将所得原生质体悬浮 ,4℃下保存备用.
1.2.3　保卫细胞原生质体质膜内向 K+通道电流的测定　采用常规全细胞记录技术(Hamail等 ,1981).
室温条件下 ,将悬浮备用的保卫细胞原生质体置于细胞外液(10mmol/L 谷氨酸钾 、10mmol/L Mes 、
1mmol/L CaCl2 、4mmol/L MgCl2 、pH 6.0(KOH),用甘露醇调渗透浓度为 540mOsmol·kg-1)中 ,在倒置显
微镜(Nikon-TE300)选择胞质清晰 、细胞膜厚实圆滑 ,直径在 4 ～ 5μm 之间贴壁的原生质体用于全细胞电
流记录.玻璃微电极在拉制仪(PC-10 ,Narishige)上拉制成尖端内径为1μm 左右 ,在膜片钳放大系统(德国
EPC9)下进行全细胞电流记录[ 13] .刺激电压从-190mV 逐渐去极化到+10mV ,每级为+20mV ,维持时
间 3s ,频率为 0.2 Hz ,全细胞封接形成 10min后采集数据.使用 PULSE+PULSEFIT 软件采集和分析全
细胞电流 ,每一实验结果重复 5 ～ 6次.
2　结果与分析
2.1　拟南芥保卫细胞原生质体内向 K+电流特征
在胞外溶液含10mmol/L K+、电极溶液(即细胞内液 , 80mmol/L谷氨酸钾 、20mmol/L KCl、10mmol/L Hep-
es , MgA TP-Tris先配成 1∶1的混合溶液 ,现用现加 ,使其终浓度为 5mmol/ L ,pH 7.8(KOH),用甘露醇调
渗透浓度为 560mOsmol·kg-1)含 100mmol/ L K+时 , 用全细胞膜片钳技术记录到拟南芥保卫细胞原生质
体全细胞 K+电流(图 1A).当全细胞封接形成后 ,膜电位钳制在-52mV(接近保卫细胞 K+的平衡电位)
,并根据记录结果对稳态电流作电流电压(I-V)曲线(图 1B).
图 1　拟南芥保卫细胞原生质体全细胞质膜内向 K +电流特征
Fig.1　Characteristic of the whole-cell inw ard K +cur rents of Arabidopsis thaliana guard cell pro toplasts
A 为电流图 , B为电流-电压曲线及刺激电压为(-190mV ～ +10mV)
　　离子通道尾电流为 0pA时的细胞膜电位称为反转电位(Erev),反转电位的大小和形成该通道电流的
离子平衡电位相同.图 2B表明记录到的通道尾电流反转电位为-50mV左右.根据能斯特方程对细胞内
191第 1期 薛瑞丽等:ABA对拟南芥 los5-1突变体及其野生型保卫细胞质膜内向K+通道的调节
外主要离子平衡电位的计算表明 ,拟南芥保卫细胞质膜的反转电位接近 K+的平衡电位(-58 mV),因此
实验记录到的通道电流主要是 K+电流[ 14] .拟南芥保卫细胞原生质体的大小一般在 4 ～ 5 μm ,全细胞封
接形成后 ,慢电容大小范围为 2 ～ 4 pF ,电流大小范围在100～ 600 pA左右 ,电流随刺激电压的变化稳定平滑.
图 2　拟南芥保卫细胞原生质体尾电流记录
F ig.2　Reco rding of tail cur rents for guard cell pro toplasts
A.刺激电压(-190 mV ～ +10 mV);B.尾电流图
2.2　胞外 ABA对拟南芥保卫细胞原生质体内向 K+电流的影响
图 3　胞外 ABA处理对拟南芥保卫细胞原生质体质膜内向 K+通道电流的影响
Fig.3　Effects of exogenous ABA on the inward K+ channel currents of guard cell protoplasts in C24 and los5-1
A.C24野生型在 10μmol/ LABA 处理前后K +电流变化的 I～ V 曲线图;B.los5-1突变体在 10μmol/ LABA 处理前后 K +电
流变化的 I ～ V 曲线图;C.C24野生型和 los5-1突变体在 10μmol/ L ABA 处理前后 K +最大电流百分比变化图
　　全细胞封接形成后 , 静置 10 ～ 15 min ,待电流稳定后 ,在胞外液中加入 ABA ,使 ABA 终浓度达到
10μmol/L ,并在处理后 ,跟踪记录全细胞 K+电流变化情况.实验结果表明 ,外源 ABA处理 20min 后 ,突
192 四川大学学报(自然科学版) 第 43卷
变体 los5-1及其野生型 C24的内向 K+电流均受到明显抑制(图 3A ,B).以单位电容电流变化表示 ABA
对质膜 K+通道的影响 ,作电压-电流曲线(I～ V曲线),发现 10μmol/L 的外源 ABA对突变体 los5-1保卫
细胞质膜内向 K+电流的抑制程度明显大于野生型 ,ABA 对突变体 los5-1及其野生型 C24内向 K+电流的
抑制程度同对照相比分别为 51.5%和 31.5%(图 3C).
2.3　LaCl3对胞外 ABA 抑制拟南芥保卫细胞原生质体内向 K+电流的影响
为研究Ca2+信使系统是否参与了外源 ABA对突变体 los5-1及其野生型 C24保卫细胞内向 K+通道
的调节 ,我们在外源 ABA 处理实验前通过电极液预先用 LaCl3处理.实验结果表明 ,10μmol/L LaCl3处理
对ABA引起的拟南芥突变体 los5-1保卫细胞原生质体内向 K+电流的减小影响不大 ,其内向 K+电流减
小程度达到 51.3%(图 4B ,C),但却抑制了 ABA对 C24野生型的内向 K+电流的作用(图 4 A ,C),说明在
野生型中胞内 Ca2+参与了 ABA 对质膜内向 K+通道的调节 ,而在突变体 los5-1中是通过不依赖 Ca2+的
途径完成的.
图 4　LaCl3对 ABA抑制的野生型和 los5-1 保卫细胞原生质体质膜内向 K+通道电流的影响
F ig.4　Effects of LaCl3 on exogenous ABA-induced inhibition of inward K + currents(Ikin)in C24
　　　　　　and los5-1 guard cell pro toplasts
A.C24野生型在 10μmol/ L LaC l3+ 10μmol/ L ABA处理前后 K +电流变化的 I ～ V曲线图;B.los5-1突变体在 10μmol/ L
LaCl3+ 10μmol/ LABA处理前后 K +电流变化的 I ～ V 曲线图;C.C 24野生型和 los5-1突变体在 10μmol/ L LaCl3 +
10μmol/ L ABA 处理前后 K +最大电流百分比变化图
2.4　EGTA对胞外 ABA抑制拟南芥保卫细胞原生质体内向 K+电流的影响
进一步用 EG TA 处理 ,试验结果表明 ,在外源 ABA 处理实验前通过电极液预先用 EGTA 处理.
2mmol/L EGTA处理对 ABA 引起的拟南芥突变体 los5-1保卫细胞原生质体内向 K+电流的减小影响不
大 ,其内向 K+电流减小程度达到 44%(图 5B ,C),但却抑制了 ABA 对C24野生型的内向 K+电流的作用
(图 5A ,C ).
193第 1期 薛瑞丽等:ABA对拟南芥 los5-1突变体及其野生型保卫细胞质膜内向K+通道的调节
图 5　EGTA 对 ABA 抑制的野生型和 los5-1 保卫细胞原生质体质膜内向 K +通道电流的影响
Fig.5　Effects of EGTA on exogenous ABA-induced inhibition of inward K+ currents (I kin)in C24
　　　　　　and los5-1 guard cell pro toplasts
A.C24野生型在 2mmol/ L EGTA+ 10μmol/ L ABA处理前后 K +电流变化的 I ～ V 曲线图;B.los5-1突变体在 2mmol/
LEGTA+ 10μmol/ LABA 处理前后K +电流变化的 I ～ V 曲线图;C 、C24野生型和 los5-1突变体在 2mmol/ L EGTA+
10μmol/ L ABA 处理前后 K +最大电流百分比变化图
3　讨论
气孔运动依赖于保卫细胞的收缩与膨胀.质膜 K+通道在这一过程中起着重要的作用[ 15 , 16] .K+内
流和外流可调节胞内渗透压 ,引起气孔张开或关闭.外源 ABA 处理可以引起 K+通道活性的变化 ,从而导
致气孔的关闭[ 17 ～ 19] .我们用 ABA合成缺失突变体 los5-1及其野生型为实验材料 ,发现外源 ABA 处理
均能抑制突变体和野生型中保卫细胞质膜内向 K+电流(图 3).但是当我们进一步研究胞内 Ca2+在外源
ABA抑制保卫细胞内向 K+通道活性中的作用时 ,得到了一个非常有趣的实验结果:质膜 Ca2+通道的抑
制剂 LaCl3和细胞内 Ca2+离子螯合剂可以恢复野生型中外源 ABA对质膜内向 K+通道的抑制作用 ,但却
不能恢复突变体中外源 ABA对质膜内向 K+通道的抑制作用.
已知外源 ABA 调节保卫细胞质膜上内向 K+通道活性 ,诱导气孔关闭的信号转导机制目前有两种不
同的观点 ,分别是 Ca2+依赖的和 Ca2+不依赖途径[ 20] .在我们的实验结果中 ,在外源 ABA 处理气孔保卫
细胞原生质体前 ,我们预先用质膜 Ca2+通道的抑制剂 LaCl3[ 21 , 22]和细胞内 Ca2+的螯合剂 EGTA[ 21 , 23]处
理 ,结果发现二者均能恢复野生型中外源ABA对保卫细胞内向K+电流的抑制作用(图 4A ,C;图5A ,C).
说明对于野生型来说 ,在外源 ABA 抑制质膜内向 K+通道活性诱导气孔关闭过程中 ,胞内 Ca2+参与了外
源ABA对质膜内向 K+通道的调节 ,外源 ABA处理有可能是通过诱导保卫细胞内游离 Ca2+浓度的升高 ,
Ca2+作为第二信使从而调节质膜内向 K+通道活性 ,并且胞外 Ca2+通过质膜上的 Ca2+通道进入细胞是胞
内游离 Ca2+增加的一个主要原因.但是在突变体实验中 ,无论用 LaCl3还是 EG TA 处理均不能逆转外源
ABA引起的内向 K+电流的减小(图 4B ,C;图 5B ,C),说明在突变体中 ,由于 Los5的突变 ,内源 ABA 的
合成受阻 ,因而不能引起胞质内游离Ca2+浓度的升高.在这种情况下 ,ABA引起气孔关闭信号转导过程
194 四川大学学报(自然科学版) 第 43卷
中 ,可能不涉及 Ca2+信号系统.这种现象发生的详细机制尚待进一步的研究.其中一种可能是外源 ABA
抑制保卫细胞内向 K+电流是外源 ABA处理引起保卫细胞胞质碱化 ,胞质碱化可能作为 ABA 信号转导
过程中的另一个二级信号 ,参与了外源 ABA 对气孔运动的调节 ,但是仍需要确切的实验证据.另外 , abi1
和 abi2是对 ABA反应不敏感的突变体[ 24 , 25] ,它们编码一个 PP2C磷酸酶.在 ABA诱导的气孔关闭信号
转导途径的上游其[ Ca2+] c 被阻断 ,从而 ABA 调节的阴离子通道活性发生了变化 ,因而导致气孔不能关
闭[ 12] .也许在 los5-1突变体中 ABA 引起 K+通道活性机制类似于 abi1 和 abi2 突变体的机制 ,但是需要
进一步测定ABA处理后野生型和 los5-1突变体中[Ca2+] c变化.进一步实验正在进行中.
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Abscisic Acid Regulation of inward K
+
Current in the Plasma Membrane
of Guard Cells in Arabidopsis Wild-type and los5-1 mutant
XUE Rui-l i , ZHOU Yun , AN Guo-yong , J IANGJ ing , LV Dong , MIAO Chen , SONG Chun-peng
(College of Life Science , Henan University , Henan Kaifeng 475001 , China)
Abstract:Using patch-clamp techniques , af ter the treatment of LaCl3(inhibitor of Ca2+ channels in the plasma
membrane of guard cells)and EGTA(chelator of cy tosolic Ca2+), the ef fects of Ca2+on inward K+ channel
activi ty w hich regulated by ABA in the plasma membrane of guard cells from Arabidopsis thaliana(wild-ty pe
C24 and ABA deficient mutant los5-1)were examined.The results show ed that inw ard currents in the guard
cells of w ild-type and mutant were significantly decreased w ithin 20 mins af ter 10μmol/L ABA was perfused
to the bath solution , and the Ca2+ dependence of abscisic acid regulation of guard cell inw ard K+ currents in
Arabidopsis w ild-type and los5-1 mutant is different , this suggested that abscisic acid regulation of guard cell inward
K+current was mediated by different t ransduction pathways in Arabidopsis wild-type and los5-1 mutant.
Key words:patch clamp;inw ard K+currents;ABA;Ca2+
195第 1期 薛瑞丽等:ABA对拟南芥 los5-1突变体及其野生型保卫细胞质膜内向K+通道的调节