全 文 ：分子植物育种，2014年，第 12卷，第 1期，第 162-167页
Molecular Plant Breeding, 2014, Vol.12, No.1, 162-167
研究报告
Research Report
拟南芥 AtFtsHi4基因 RNA干扰载体的构建及转基因植株的表型分析
周翠燕 1,2 温泽文 1,3 柴国华 1 曹英萍 1 于昌江 1 张东远 1,3*
1中国科学院青岛生物能源与过程研究所,青岛, 266101; 2中国科学院大学,北京, 100049; 3中国科学院天津工业生物技术研究所,天津, 300308
*通讯作者, zhang_dy@tib.cas.cn
摘 要 拟南芥 AtFtsHi基因家族在叶绿体的发育中具有重要作用。它的成员 AtFtsHi4 T-DNA突变体胚胎
致死，这严重制约了对其生物学功能的研究。为了研究 AtFtsHi4的功能，本文构建了 AtFtsHi4的 RNA干扰
载体并通过转化拟南芥获得转基因植株。对转基因植株的表型进行分析，结果表明：与野生型相比，T3代
RNAi转基因植株的子叶、叶片和果荚均出现了不同程度的黄化；叶绿素含量仅为野生型的一半；叶绿体的
基粒垛叠数和基质片层数减少。这些结果表明，AtFtsHi4基因表达量的降低会抑制叶绿体类囊体的形成，进
而影响叶绿体的发育。
关键词 AtFtsHi4, RNA干扰,叶绿体发育
Construction of RNA Interference Vector for AtFtsHi4 and Phenotype
Analysis of Transgenic Arabidopsis thaliana
Zhou Cuiyan 1,2 Wen Zewen 1,3 Chai Guohua 1 Cao Yingping 1 Yu Changjiang 1 Zhang Dongyuan 1,3*
1 Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao, 266101; 2 University of Chinese Academy of
sciences, Beijing, 100049; 3 Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin, 300308
* Corresponding author, zhang_dy@tib.cas.cn
DOI: 10.13271/j.mpb.012.000162
Abstract AtFtsHi family plays an important role in chloroplast development in Arabidopsis thaliana. However, its
member AtFtsHi4 T-DNA knockout line exhibits the embryonic lethality, which restricts the functional characte-
ristics of this gene. In order to investigated the function of AtFtsHi4, in this paper we constructed AtFtsHi4 RNA
interference vectorand produced its transgenic Arabidopsis thaliana. Phenotype analysis revealed that AtFtsHi4
RNAi transgenic plants had the etiolated cotyledons, leaves, siliques, one half of the chlorophyll content, and fewer
grana stacks, stroma lamellae compared with the wild type. These results suggest that decreasing of AtFtsHi4
expression inhibits thylakoid membranes formation, thereby affects the chloroplast development.
Keywords AtFtsHi4, RNA interference, Chlorplast development
收稿日期：2013-04-01 接受日期：2013-05-18 网络出版日期：2013-07-22
URL: http://5th.sophiapublisher.com/abstract-1544-mpbopa
基金项目：本研究由国家自然基金项目(31070217)和中国科学院知识创新工程重要方向项目(KSCX2-EW-Q-22)共同资助
FtsH (Filamentation temperature-sensitive H)是广
泛分布于原核和真核生物中的一类整合膜蛋白，它
属于 AAA (ATPase associated with various cellular ac-
tivities)蛋白酶，兼具蛋白酶活性和分子伴侣的功能
(Adam and Clarke, 2002)，能够调节线粒体和叶绿体
中膜蛋白的质量平衡，避免膜蛋白的有害积累(Jans-
ka et al., 2013)。高等植物当中的 FtsH不仅在植物叶
绿体蛋白的合成和降解过程中起作用，而且也参与
叶绿体的生物发生和结构维持(Lindahl et al., 2000;
Zaltsman et al., 2005)。因此 FtsH对植物叶绿体的发
生和稳定至关重要。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)包含 17 个 AtFtsH
蛋白，其中 12个有蛋白酶活性(García-Lorenzo et al.,
2006; Sokolenko et al., 2002)，分别定位于叶绿体和
(或)线粒体。例如，AtFtsH1、AtFtsH2、AtFtsH5、AtFts-
H6、AtFtsH7、AtFtsH8、AtFtsH9和 AtFtsH12分别定位
于叶绿体(Ferro et al., 2010)，AtFtsH3、AtFtsH4和 At-
FtsH10 分别定位于线粒体(Janska, 2005)，而 AtFts-
H11同时定位于这两种细胞器(Urantowka et al., 2005)。
目前研究发现，AtFtsH蛋白通过叶绿体参与了众多
生物学过程：AtFtsH1参与 PSII反应中心蛋白 D1的
周转过程(Lindahl et al., 2000)；AtFtsH5 和 AtFtsH2
参与光保护过程，与类囊体发育密切相关，基因突变
后对光抑制的敏感性提高，形成典型的叶片花斑表
型(Zaltsman et al., 2005)；AtFtsH6参与捕光色素复合
体 LHCⅡ的降解，以适应对高光胁迫的调节(Zelis-
ko et al., 2005)；AtFtsH11则有可能在热胁迫下保护
光合作用器官，提高植物的耐热性(Chen et al., 2006)。
拟南芥中还有 5个与 FtsH同源的蛋白，因其缺少
Zn2+结合结构域而没有蛋白酶活性，故称之为 FtsHi
(FtsH inactive)，可能扮演分子伴侣的角色(Sokolenko et
al., 2002)。这 5个 AtFtsHi 蛋白都与 AtFtsH12 共表
达，推测它们可能与 AtFtsH12形成蛋白复合体起作
用(Ferro et al., 2010; Garcia-Lorenzo et al., 2008)。最
近研究发现，这些 AtFtsHi可能与胚胎发育过程中的
叶绿体发育有关，叶绿体的发育又往往会直接影响
到胚胎的发育。例如，AtFtsHi1参与质体分裂，影响
了叶绿体的发育和胚胎的发生(Kadirjan-Kalbach et
al., 2012)；而 AtFtsHi2、AtFtsHi4和 AtFtsHi5基因的
T-DNA插入突变体都表现出胚胎致死的现象(Wag-
ner et al., 2012)。
由于 AtFtsHi4 T-DNA 突变体胚胎致死制约了
对其功能的研究，故本研究利用 RNA干扰(RNAi)技
术，通过降低 AtFtsHi4基因的表达量，初步研究了
AtFtsHi4基因的生物学功能。
1结果与分析
1.1拟南芥AtFtsHi家族的进化分析
为了研究 AtFtsHi4蛋白的生物进化关系，搜索
拟南芥 TAIR (http://www.arabidopsis.org/)网站获得
AtFtsH和 AtFtsHi家族 17个成员的氨基酸序列，利
用MEGA5.1软件构建系统进化树。聚类分析显示：
AtFtsH和 AtFtsHi 家族成员大体聚为两类。其中，
AtFtsHi4与 AtFtsHi2/3聚在一起，意味着 AtFtsHi4
蛋白可能与这两个蛋白功能类似(图 1)，均在叶绿体
发育中起作用。
1.2 AtFtsHi4 基因 RNA干扰(RNAi)载体的构建
为了解决拟南芥 ftshi4突变体胚胎致死的问题，
我们构建了 AtFtsHi4基因的 RNAi载体。在载体构
建过程中，我们比较分析了 AtFtsHi4与其进化关系
最近的 AtFtsHi2和 AtFtsHi3的 cDNA序列后，选取
AtFtsHi4 基因特异片段(265 bp)进行 PCR 扩增，连
图 1拟南芥 AtFtsH和 AtFtsHi基因家族成员的进化分析
Figure 1 Phylogenetic analysis of the AtFtsH and AtFtsHi gene
families
pGWC-T入门载体后，挑取阳性克隆测序验证其序
列正确性(图 2A)。然后利用 Gateway技术将 AtFtsHi4
基因特异片段插入目的载体 pH7GWIWG2(I)中形成
pH7GWIWG2(I)-AtFtsHi4 RNA干扰载体(图 2B)。
1.3 AtFtsHi4 RNAi转基因植株的筛选及鉴定
利用了花序浸染法(Clough and Bent, 1998)，将
AtFtsHi4 基因 RNAi 载体转入拟南芥野生型 Col-0
中。收获 T1代种子，铺种到含潮霉素(25 mg/L)的
图 2 AtFtsHi4基因 RNAi载体的构建
注: A: AtFtsHi4基因特异片段的扩增; M: DL2000 marker; B:
pH7GWIWG2(I)-AtFtsHi4 RNA干扰载体示意图
Figure 2 Construction of AtFtsHi4 RNAi vector
Note: A: Amplification of AtFtsHi4 specific fragment; M: DL2000
marker; B: Schematic diagram of pH7GWIWG2(I)-AtFtsHi4
拟南芥 AtFtsHi4基因 RNA干扰载体的构建及转基因植株的表型分析
Construction of RNA Interference Vector for AtFtsHi4 and Phenotype Analysis of Transgenic Arabidopsis thaliana 163
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
1.5 AtFtsHi4 RNAi 转基因植株的叶绿体亚显微结
构分析
为了验证 AtFtsHi4 基因是否影响叶绿体的发
育，利用透射电子显微镜(TEM)观察 3 周野生型及
T3代转基因植株的叶绿体显微结构。结果显示：野
生型类囊体的基粒和基质片层清晰规则、组织有序
(图 6A;图 6C)，而转基因植株基粒垛叠数和基质片
层数明显减少(图 6B;图 6D)，表明 AtFtsHi4 基因影
响了叶绿体类囊体膜的发育。
2讨论
拟南芥叶绿体的分化最早发生在球形胚向心形
胚转变期，此时叶绿素也开始合成，胚珠由无色转变
1/2MS平板上筛选，获得 5棵阳性苗。铺种 T2代种子
在无抗性 1/2MS平板上，通过性状观察，统计分离比。
结果显示，一号株系的分离比为 158:49 (图 3A)，基
本符合 3:1的比例，说明是单拷贝插入。继续在抗性培
养基上筛选，获得 T3代纯合子(图 3B)。RT-qPCR检测
表明，AtFtsHi4基因在 T3代转基因植株中的表达量
明显低于野生型(图 3C)。选取 AtFtsHi4基因受抑制
强烈的 1、2号株系，利用免疫印迹分析 AtFtsHi4蛋白
的变化情况。如图 3D所示，与野生型相比，AtFtsHi4
蛋白表达水平也受到不同程度的抑制。基于以上分
子检测，选定表达量最低的 2号株系用于后续试验。
1.4 AtFtsHi4 RNAi T3代转基因植株的表型分析
与野生型相比，AtFtsHi4 RNAi T3代转基因植株
的子叶白化(图 4A;图 4B)，叶片、果荚发黄(图 4C~
图 4F)，叶绿素含量下降至野生型的 50% (图 5)。这
些结果表明，AtFtsHi4基因可能影响叶绿体的发育。
图 3 AtFtsHi4基因 RNAi转基因植株的筛选及鉴定
注: A: T2代转基因植株的表型;黑色箭头指示野生型幼苗,红色
箭头指示转基因幼苗; B: T3代转基因植株的表型; C: Quantita-
tive realtime PCR (RT-qPCR)检测 AtFtsHi4基因的表达量; WT:
野生型; 1~5: T3代转基因株系; D:免疫印迹分析 AtFtsHi4蛋白
的表达水平; WT:野生型; 1~2: T3代转基因株系
Figure 3 Screening and identification of AtFtsHi4 RNAi trans-
genic plants
Note: A: Segregation of T2 transgenic plants; Black arrow repre-
sents wild type, and red arrow represents transgenic plant; B: T3
homozygous transgenic plants; C: Transcriptional levels of AtFts-
Hi4 detected by RT-qPCR; WT: The wild type; 1~5: T3 trans-
genic plants; D: Immunoblot analysis of AtFtsHi4 protein; WT:
The wild type; 1~2: T3 transgenic plant
图 4 AtFtsHi4基因 RNAi T3代转基因植株表型分析
注: A: 10 d野生型幼苗; B: 10 d转基因幼苗; C: 23 d野生型植
株; D: 23 d转基因植株; E: 7周野生型的果荚; F: 7周转基因
植株的果荚; A,B为 1/2MS培养基中生长的幼苗; C,D为营养
土中生长的植株
Figure 4 Phenotype of T3 AtFtsHi4 RNAi transgenic plants
Note: A: 10-day-old seedling; B: 10-day-old transgenic seedling;
C: 23-day-old wild type; D : 23-day-old transgenic plants; E:
Siliques of 7 week-old wild type; F: Siliques of 7 week-old trans-
genic plants; A and B are seedlings grow in 1/2MS medium; C
and D plants grow in soil
164
为绿色，叶绿体发育不良往往导致胚胎发育缺陷，因
而叶绿体的发育对胚胎的形成至关重要(Mansfield
and Briarty, 1991)。AtFtsH和 AtFtsHi是两类关键的
蛋白酶，其家族成员大部分定位于叶绿体，在叶绿体
的发生及稳定性维持中起关键作用(Janska et al., 2013)。
特别是，最近研究发现 AtFtsHi4 基因的 T-DNA突
变体胚胎致死，暗示了 AtFtsHi4基因可能在叶绿体
发育中起关键作用(Wagner et al., 2012)。本研究利用
RNAi技术初步分析了 AtFtsHi4基因的生物学功能，
发现 RNAi转基因植株的子叶、叶片和果荚黄化，叶
绿素含量明显降低，基粒垛叠数和基质片层数明显
图 5 10 d和 23 d幼苗的叶绿素含量测定
Figure 5 Measurement of chlorophyll content of 10, 23 day-old
wild type and AtFtsHi4 RNAi T3 transgenic plants
图 6 AtFtsHi4基因 RNAi T3代转基因植株(3 周)的叶绿体亚
显微结构分析
注: A,C:野生型; B,D:转基因植株;黑箭头指示基粒,白箭头
指示基质片层
Figure 6 Ultrastructures of plastids in the wild type and AtFtsHi4
RNAi T3 transgenic plants
Note: A,C: Wild type; B,D: Transgenic plants; Black arrow
shows grana, and white arrow shows stroma lamellae
减少。这些结果表明 AtFtsHi4基因可能参与了叶绿
体类囊体膜的发育，进而影响拟南芥叶绿体的形成。
RNAi转基因植株的子叶、真叶叶片均出现黄化，说
明 FtsHi4不仅参与胚胎发育过程中叶绿体的发育，
同时也影响真叶叶绿体的发育。这与 FtsH5突变体
var1 和 FtsH2 突变体 var2 真叶叶绿体发育受影响
(出现花斑)而子叶正常的表型不同(Liu et al., 2010)，
说明 FtsHi4和 FtsH5、FtsH2在参与叶绿体发育过程
中扮演的角色不同。
以前研究表明，拟南芥 AtFtsHi家族成员往往与
AtFtsH12蛋白形成功能复合体共同起作用(Ferro et
al., 2010; Garcia-Lorenzo et al., 2008)。而且，ftshi2、
ftshi4、ftshi5和 ftsh12均出现胚胎致死的表型，因而，
以 AtFtsHi4基因 RNAi载体为材料，进一步分析降
低 AtFtsHi4蛋白表达水平对 AtFtsH12及其它 AtFt-
sHi蛋白表达的影响，可能是揭示 AtFtsHi4基因参与
叶绿体发育分子机制的突破口。
3材料与方法
3.1实验材料
3.1.1植物材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚 0型(Col-0)
为本实验室保存。
3.1.2菌株及载体
大肠杆菌 DH5α、根癌农杆菌 GV3101由本实验
室保存。质粒载体 PGWC-T，RNAi 载体 pH7GWI-
WG2(I)购自 Invitrogen公司。
3.1.3实验试剂
rTap酶、T4 DNA连接酶、DNA marker DL2000、
SYBR誖Green PCR Master Mix 购自 Takara 公司。
cDNA反转录试剂盒购自 Fermentas公司。质粒小量
提取试剂盒、琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒和植物总
RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。
LR反应酶购自 Invitrogen公司。溴乙锭、琼脂糖和蛋
白电泳相关试剂购自 Sigma公司。AtFtsHi4蛋白一
抗为通过多肽合成制备，辣根过氧化物酶标记二抗
购自中山金桥公司。其它化学药品均为国产分析纯。
测序和引物合成由深圳华大公司完成。
3.2实验方法
3.2.1系统进化树分析
从 TAIR网站 (http://www.arabidopsis.org/)上获
得 AtFtsH 和 AtFtsHi 蛋白的氨基酸序列，应用
拟南芥 AtFtsHi4基因 RNA干扰载体的构建及转基因植株的表型分析
Construction of RNA Interference Vector for AtFtsHi4 and Phenotype Analysis of Transgenic Arabidopsis thaliana 165
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
MEGA5.1 软件 (http://www.megasoftware.net/)，基于
Neighbor-joining方法(SaitouandNei,1987)构建AtFtsH
和 AtFtsHi家族成员的系统进化树。为了增加聚类的
准确性，Bootstrap值设置为 1 000。
3.2.2 AtFtsHi4基因 RNAi载体的构建
利用 TRIZOL，按照 Invitrogen公司提供的操作
流程提取拟南芥幼苗的总 RNA，去除 DNA污染后，
利用反转录试剂盒反转录成第一链 cDNA。基于
AtFtsHi4 cDNA序列，选取特异区段设计引物(AtFts-
Hi4-F: 5-CAGACGGGAATGACTGCT-3;AtFtsHi4-
R: 5-CGACAGGTCTCACGGGTT-3)，以拟南芥幼
苗 cDNA为模板进行 PCR扩增，得到一个 265 bp的
产物。PCR反应参数为：95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃
30 s，72℃ 20 s，32个循环；72℃ 5 min。AtFtsHi4基因
RNAi载体利用 Gateway技术构建。首先将测序验证
过的 PCR扩增片段连接到入门载体 pGWC-T载体
上，随后经过 LR 反应将其连接到基因沉默载体
pH7GWIWG2(I)上，在壮观霉素抗性培养基上筛选阳
性克隆并进行 PCR鉴定及测序检测。测序无误后，
利用电击法将 RNAi载体转入农杆菌。
3.2.3拟南芥的侵染及转基因阳性苗的筛选
参照 Zhang等(2006)的方法，经农杆菌介导，将
RNAi载体转入拟南芥。大体过程为：(1)取农杆菌菌
液接入含 50 μg/mL利福平(Rif)的 YEP 培养基中，
28℃下 200 r/min培养至橘红色。用 50mL离心管收集
农杆菌菌体，以 200 mL 3%蔗糖溶液重悬，加入 60 μL
Silwet L-77。侵染前剪去开花期拟南芥的果荚，侵染
时将植株整个花序浸入菌体的蔗糖溶液中 10 s 取
出，平放于托盘并以不透光的袋子罩住植株约 20 h
后取出，在正常条件下培养。1周后重复侵染 1次，正
常生长条件一个月后收获种子。
收获的种子用 1%的 NaClO 处理 10 min，70%
的乙醇漂洗 1 min，无菌水清洗 4次后均匀地铺在
含 25 μg/mL潮霉素的 1/2MS培养基上。4℃暗中春
化 48 h后，移至光照培养箱(温度, 20℃;光周期, 16 h
光照 /8 h黑暗)中培养，转移阳性苗至土中，单株收获
种子。T2代种子继续铺到 1/2MS平板上统计性状分
离比例。将具有表型的转基因苗移至土中收获种子，
得到 T3代纯合子。
3.2.4 RT-qPCR 检测 AtFtsHi4 基因在转基因植株中
的表达
以 3周幼苗 cDNA为模板，利用实时荧光定量
PCR (RT-qPCR)检测 AtFtsHi4 基因(F: 5-AAGGGA
CATTTGAGACTGGACAA-3; R: 5-GAGATAACA
AGCAAGAACAGCAACA-3)在野生型和转基因植
株中的表达量。拟南芥 TUB基因(F: 5-CTCAAG-
AGGTTCTCAGCAGTACC-3; R: 5-TTTGTGCTCA-
TCTTGCCACGGAAC-3)用做内参。设置 3次技术
重复，3次生物学重复。PCR反应在 Light Cycler 480
实时荧光定量 PCR系统(Roche公司)上进行。反应条
件如下：95℃，30 s (预变性 )；95℃，5 s，58℃，20 s，
72℃，10 s，45个循环(产物扩增)；65℃至 95℃ (溶解
曲线测定)。基线与循环阈值(Ct 值)使用 Light Cy-
clerH 480软件自动生成。利用 Kenneth和 Thomas报
道的 2-⊿⊿Ct方法(Livak and Schmittgen, 2010)，计算相
对表达量和标准误 S.E.。
3.2.5拟南芥类囊体膜蛋白的提取
称取 0.5 g拟南芥叶片放入干净的研钵中，加入
3 mL SHS (Sucrose 0.4 mol/L, NaCl 10 mmol/L, Hepes
20 mmol/L, MgCl2 2 mmol/L; pH 7.5) 等渗缓冲液，冰
上研磨，4℃ 5 000 g离心 10min后弃上清，加入 0.3mL
SHS缓冲液悬浮测量叶绿素含量。
3.2.6 West blot 检测 AtFtsHi4 蛋白在转基因植株中
的表达
分别提取 3周野生型和转基因植株的类囊体膜
蛋白，等全蛋白上样进行 12% SDS-PAGE电泳。采用
湿转法将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移至醋酸纤维
素膜。以 5%脱脂牛奶封闭 4~5 h，加入 AtFtsHi4抗体
(1:2000稀释)，4℃过夜孵育，TBST缓冲液清洗后换
用辣根过氧化物酶标记的二抗(1:3000稀释)，室温孵
育 2 h，TBST缓冲液清洗后进行显影检测。
3.2.7叶绿素的测定
分别取 10 d、23 d 野生型及 T3代转基因植株，
用 80%丙酮浸提叶绿素，暗中浸提 48 h后取出用紫
外分光光度计测定 646 nm与 663 nm下的吸光值，
按照 Lichtenthaler(1987)方法计算叶绿素含量(叶绿
素含量=(叶绿素浓度×提取液总体积×稀释倍数)/样
品鲜重)。设置 3个生物学重复。
3.2.8透射电镜观察
以拟南芥叶片为材料，利用透射电镜观察野生
型及 RNAi转基因植株叶绿体亚显微结构的变化情
况。具体步骤为：(1)材料的固定：利用锋利刀片取 3
周拟南芥莲座叶，切成 0.5 mm×0.5 mm的小块，置于
5%戊二醛固定液中真空抽气(0.7 MPa) 2 h，直至材
料沉于管底，4℃过夜。(2)脱水：去除戊二醛固定液，
166
拟南芥 AtFtsHi4基因 RNA干扰载体的构建及转基因植株的表型分析
Construction of RNA Interference Vector for AtFtsHi4 and Phenotype Analysis of Transgenic Arabidopsis thaliana
用 PBS (pH 7.2)缓冲液清洗 4次后，1%锇酸固定 1 h，
PBS缓冲液冲洗后，依次利用 30%、50%、70%、80%、
90%和 100%丙酮对其梯度脱水，每步 30 min。(3)浸
透及包埋：利用丙酮(A)和包埋剂(B)按照 A/B=7/3，
A/B=3/7，B的比例浸透，每步至少 6 h。最后在 65℃
纯包埋剂中聚合 24 h。(4)切片：先切半薄切片，体式
显微镜下找到想要观察的组织部位后，利用 Leica
EM UC6切片机(Leica 公司)将其切成 60~90 nm 的
超薄切片，0.5%的柠檬酸铅染色 8 min，ddH2O冲洗
掉多余的染液。(5)观察：利用 Hitachi H-7650显微镜
(Hitachi公司)进行观察，拍照。
作者贡献
周翠燕和温泽文是本研究的实验设计和实验研
究的执行人，完成论文初稿的写作；柴国华、曹英萍
和于昌江参与实验设计，试验结果分析；张东远是项
目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论
文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然基金项目(31070217)和中国科
学院知识创新工程重要方向项目(KSCX2-EW-Q-22)
共同资助。
参考文献
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