全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 November 2009, 28(6): 813-818

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2009 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






*Corresponding author. E-mail: shaorong50@163.com
收稿日期: 2008-04-30, 接受日期: 2008-07-21

毛木耳子实体中活性多糖 APPⅡA 的分离纯化与结构初探
清源 1 余梦瑶 2,3 罗霞 2,3 江南 2,3 郑林用 2,4 葛绍荣 2*
1西昌学院食品科学系 西昌 615013
2四川大学生命科学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室 成都 610064
3四川省中医药研究院 中药细胞与分子生物学实验室 成都 610064
4四川省农业科学院 成都 610064



摘 要：毛木耳 Auricularia polytricha 子实体 500g 经热水浸提、乙醇沉淀、Sevage 法脱蛋白后，得到粗多糖 3.94g，得率为
0.79%。经小鼠 S180 载体实验证实，50mg/kg 该粗多糖对肿瘤的抑制率达 47.89%，呈极显著差异。利用离子交换柱对其进
行分离，共得到三个部分，分别命名为 APPⅠ、APPⅡ、APPⅢ。其中，APPⅡ对小鼠 S180 的抑制率达到 56.36%，明显优
于其他两部分。通过 Sephacryl S300凝胶过滤层析柱后，APPⅡ被进一步分离为A和B两个部分，APPⅡA的抑瘤率为 53.61%，
远高于 APPⅡB，呈极显著差异。通过紫外光谱、红外光谱等方法对该单一多糖组分进行结构分析，表明 APPⅡA 为一相对
分子质量约为 110,000Da、可能同时具有 α和 β构象的杂多糖，主要有木糖和甘露糖组成，且纯度较高，含有硫酸基。
关键词：粗多糖，抑瘤作用，木糖，甘露糖

Isolation, purification and structural characterization of
bioactive polysaccharide APPⅡA from Auricularia
polytricha
QING Yuan1 YU Meng-Yao2, 3 LUO Xia2, 3 JIANG Nan2, 3 ZHENG Lin-Yong2, 4 GE Shao-Rong2*
1Department of Food Science, Xichang College, Xichang 615013, China
2Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment, Ministry of Education, School of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China
3Cytological and Molecular Lab of Sichuan Institute of Chinese Materia Medica, Chengdu 610064, China
4Sichuan Academy of Agricultural Science, Chengdu 610064, China
Abstract: The water-soluble crude polysaccharide (APP) was isolated from fruit bodies of Auricularia polytricha by hot water
extraction, ethanol precipitation, and deproteination with Sevage method. It was found that APP could markedly inhibit growth of
Sarcoma 180 in mice. APPⅠ, Ⅱ and Ⅲ was separated from APP by ion-exchange on DEAE-Cellulose-52, and APPⅡ could
DOI:10.13346/j.mycosystema.2009.06.021
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significantly exhibit the anti-tumor effect. APPⅡ was further purified by gel-filtration chromatography on Sephacryl S-300 columns
and separated into APPⅡA and APPⅡB. It was confirmed that APPⅡA could significantly inhibit tumor growth. APPⅡA was
characterized by thin-layer chromatography (TLC), agarose gel electrophoresis (AGE), high performance liquid chromatography
(HPLC), and UV, IR and 1H-NMR spectroscopy. The results demonstrated that APPⅡA was homogeneous and its relative molecular
weight was approximately 110,000Da. Monosaccharide analysis showed that APPⅡA was a heteropolysaccharide which was
composed of xylose and mannose. The glycosidic linkages of APPⅡA was estimated to contains both α- and β- pyranoside form.
Key words: crude polysaccharide, anti-tumor effect, xylose, mannose


毛木耳Auricularia polytricha (Mont.) Sacc.又称
黄背木耳、粗木耳、大木耳，是热带及亚热带地区
的主要食用菌之一，分类学上隶属于真菌门、担子
菌纲、木耳目、木耳科，具有药食两用价值，可滋
补强壮、扶正固本。部分学者研究表明，A. polytricha
子实体中的多糖成分是其药理学活性的重要物质
基础，具有增强机体免疫力、止血、降血脂、抗衰
老等方面的作用（张丹和郑有良 2004）。但是，有
关其多糖的抗肿瘤作用报道的较少。本文以小鼠
S180载体实验为验证平台，采用水提醇沉、离子交
换柱层析和凝胶过滤层析的方法分离纯化A.
polytricha中具有抗肿瘤活性的多糖并进行结构鉴
定，为进一步研究其在抗肿瘤方面作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料来源：Auricularia polytricha 781 号子实
体，购自四川省德阳市中江县。
1.1.2 仪器： Smart Spec Plus Spectrophotometer
（Bio-Rad）；中压天然产物分离系统（Buchi，Pump
Manager C-615 ， Pump Module C-605 ， RI
DETECTOR，UV Photometer C-635）；紫外分光光
度计（北京谱析通用仪器有限责任公司，TU-1800）；
旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司，SENCO
R201）；高速冷冻离心机（Beckman J-25）；电泳仪
（Bio-rad mini-sub cell）；高效液相色谱仪（Waters）；
蒸发光散射检测器（Alltech）；红外光谱仪（Nicolet
AVATR 3600）；核磁共振仪（Burker AC E200，Varian
INOVA-400）。
1.1.3 动物及试剂：昆明种标准小鼠，体重 18－22g，
雌雄各半，由四川省中药研究所提供（川实质第
2002－33 号）。巴比妥钠盐（Sigma）。其余均为国
产分析纯。
1.1.4 细胞株：S180 肉瘤细胞株（ATCC 编号：
TIB-66），购自中国科学院细胞生物学研究所。
1.2 粗多糖的制备及抗肿瘤活性检测
称取干燥的 A. polytricha 781 号子实体 500g，
去杂粉碎后，按 1:10（g:w）加水，浸提 3h，2,000r/min
离心 10min，上清液浓缩至一定体积。向其中加入
3 倍体积的无水乙醇，4℃条件下醇沉静置过夜，收
集沉淀，回收乙醇。沉淀物以一定体积水复溶后，
反复用 Sevage 法除去其中蛋白质。
无菌条件下，每只小鼠腋下接种 S180 瘤细胞
悬液 0.2mL（2.0 × 106 个/只），24h 后随机分为毛木
耳粗多糖组，荷瘤模型对照组，正常对照组。给药
组小鼠每天按 0.1mL/10g 腹腔注射粗多糖，剂量为
50mg/kg。荷瘤模型对照组小鼠和正常对照组小鼠
每天按 0.1mL/10g腹腔注射生理盐水。连续给药 10d
后，断颈处死小鼠，剖取瘤体并称重。
抑瘤率%＝（对照组平均瘤重－给药组平均瘤
重）×100%/对照组平均瘤重
1.3 粗多糖的分离与纯化
1.3.1 DEAE-Cellulose 52 离子交换柱层析分离（赵
凯等 2008）及抗肿瘤活性检测：将粗多糖溶于适
量的 20mmol/L，pH8.0 的 Tris-HCl 缓冲液，0.6µm
的滤膜过滤，滤液过 DEAE-Cellulose 52（2.6cm ×
20cm）层析柱分离。上样前，以同样缓冲液平衡层
析柱。以含 0－0.5mol NaCl 的 20mmol Tris-HCl
（pH8.0）缓冲液进行线性梯度洗脱，以硫酸-苯酚
法检测，多糖被分为 APPⅠ、APPⅡ和 APPⅢ。利
用小鼠 S180 载体实验对分离得到的各部分多糖进
行抗肿瘤活性检测，方法同上。
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1.3.2 Sephacryl S-300 凝胶过滤层析分离及抗肿瘤
活性检测：根据离子交换柱层析分离和抗肿瘤活性
检测结果，收集其中具有显著抑肿瘤作用的 APPⅡ
部分并浓缩，经 Sephacryl S-300（2.6cm × 100cm）
进一步纯化为 A 和 B 两部分。利用小鼠 S180 载体
实验对这两部分多糖进行抗肿瘤活性检测，方法同
上，结果显示 APPⅡA 活性较高为所需要部分。
1.4 多糖 APPⅡA 的结构研究
1.4.1 相对分子质量测定：采用 Sephacryl S-300 凝胶
过滤层析法（和寿英和熊子仙 1999）测定 APPⅡA
的分子量。已知分子量的标准多糖参照品，以出峰
体积对分子量对数作图，得到回归方程，求出多糖
的表观分子质量。
1.4.2 TLC 分析单糖组成：APPⅡA 5.0mg，加入
2.0mol/L 的 TFA（三氟乙酸）1.0mL，封管后 100℃
水浴 6h，冷却后减压抽去 TFA，再加入甲醇 1.5mL
溶解后减压蒸干，重复 3 次。然后将样品溶于 200µL
蒸馏水中，即可点样。点样后用展开剂（乙酸乙酯:
吡啶:乙醇:水＝8:1:1:2）展开，喷上显色剂，100℃
下将硅胶板烘干，分析结果。
1.4.3 紫外光谱检测：称取 3.0mg APPⅡA，用 0.9%
NaCl 溶液溶解，配置成 1.0mg/mL 的多糖溶液，用
紫外可见分光光度计在200－400nm之间，每隔2nm
扫描一次，记录各吸光值。以波长为横坐标，吸光
值为纵坐标，做 APPⅡA 的紫外光谱图。
1.4.4 红外光谱检测：称取适量的 APPⅡA，用溴化
钾压片，红外光 4,000－400cm-1 区间扫描。
1.4.5 核磁共振光谱检测：称取纯化后的 APPⅡA
30mg，溶于 D2O 0.5mL 中，60℃在 Burker AC-E200
核磁共振仪上分别进行 1HNMR 的测定。
2 结果与分析
2.1 粗多糖的提取及抗肿瘤活性检测
500g A. polytricha子实体经水提醇沉、除蛋白
质后得到粗多糖3.94g，得率0.79%，该粗多糖为淡
黄棕色。对毛木耳粗多糖的抗肿瘤作用研究发现，
其能够明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长（P<0.01），且
抑瘤率约为47.89%（表1）。
2.2 粗多糖的分离与纯化
2.2.1 DEAE-Cellulose 52离子交换柱层析分离及抗
肿瘤活性检测：通过DEAE-Cellulose 52离子交换柱
层析，以苯酚-硫酸法测定，可将A. polytricha子实
体粗多糖中的酸性多糖分为3个部分，分别为
APPⅠ、APPⅡ及APPⅢ，得率分别为17.8%，29.2%
和11.3%（图1）。干燥后的多糖为白色，略带浅黄
色粉末。

表 1 Auricularia polytricha 粗多糖的抗肿瘤作用
Table1 Anti-tumor effect of Auricularia polytricha crude
polysaccharides
实验分组
Group
剂量
Dosage
瘤重
Tumor weight
抑瘤率
Tumor growth
inhibition ratio
粗多糖组 Crude
polysaccharides
50mg/kg 1.73±0.75**g 47.89%
模型对照组
Control
－ 3.32±0.57g －
注：与模型对照组比较，**P<0.01.
Note: Statistical significance test for comparison vs control group was
done by Student’s test, **P<0.01.


图1 DEAE-cellulose 层析图
Fig. 1 DEAE-cellulose ion-exchange chromatography of Auricularia
polytricha polysaccharides.

APPⅠ、APPⅡ、APPⅢ均对小鼠S180肉瘤的
生长存在不同程度的抑制作用，抑瘤率分别为
13.25%、56.36%、5.72%（表2）。与模型对照组相
比，仅APPⅡ可显著抑制肿瘤生长（P<0.01）。故选
择APPⅡ这部分酸性多糖作为进一步纯化的对象。
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表 2 各部分多糖对小鼠 S180 肉瘤生长的抑制作用
Table 2 Inhibiting effect of Auricularia polytricha polysaccharides on
S180 tumor growth in vivo
实验分组
Group
剂量
Dosage
瘤重
Tumor weight
抑瘤率
Tumor growth
inhibition ratio
APPI 10mg/kg 2.71±0.69g 13.25%
APPII 10mg/kg 1.36±0.77**g 56.36%
APPIII 10mg/kg 2.95±0.71g 5.72%
模型对照
组 Control
- 3.13±0.66g -
注：与模型对照组比较，**P<0.01.
Note: Statistical significance test for comparison vs control group was
done by Student’s test, **P<0.01.

2.2.2 Sephacryl S-300凝胶过滤层析分离及抗肿瘤活
性检测：离子交换柱层析得到的各部分多糖经过小
鼠S180载体实验研究对比后，确定使用Sephacryl
S-300分子筛凝胶过滤层析将APPⅡ这部分酸性多
糖按照分子量大小进一步纯化。由图2看出，APPⅡ
被分为两个部分即APP AⅡ 和APP BⅡ 。经浓缩、透
析、干燥后，这两部分的得率分别为35.7%和26.1%，
干燥后，多糖为白色粉末。

图 2 Sephacryl S-300 分子筛层析
Fig. 2 Sephecryl S-300 gel filtration chromatography of polysaccharide
APPII from Auricularia polytricha.

APPⅡA、APPⅡB 均对小鼠 S180 肉瘤的生长
存在抑制作用，抑瘤率分别为 53.61%和 15.66%（表
3）。与模型对照组相比，APPⅡA 可显著抑制小鼠
肿瘤的生长（P<0.01）。由此从毛木耳中分离得到具
有抗肿瘤活性的一个单一多糖即 APPⅡA。

表 3 APPⅡA 及 APPⅡB 对小鼠 S180 肿瘤生长的抑制作用
Table 3 Inhibiting effect of polysaccharides APP A and APP B from Ⅱ Ⅱ
Auricularia polytricha on S180 tumor growth in vivo
实验分组
Group
剂量
Dosage
瘤重
Tumor weight
抑瘤率
Tumor growth
inhibition ratio
APPIIA 10mg/kg 1.53±0.79**g 53.61%
APPIIB 10mg/kg 2.80±0.59g 15.66%
模 型 对 照
组 Control
- 3.30±0.75g -
注：与模型对照组比较，**P<0.01.
Note: Statistical significance test for comparison vs control group was
done by Student’s test, **P<0.01.

2.3 多糖 APPⅡA 的结构研究
2.3.1 相对分子质量：标准多糖参照品Dextran T-100
（MW 100,000Da），T-70（MW 70,000Da），T-40
（MW 40,000Da），T-10（MW 10,000Da）。以出峰
体积对分子量对数作图（图3）。而APPⅡA经
Sephacryl S-300凝胶过滤层析后，由回归方程可以
得到多糖的表观分子质量约为110,000Da。

图 3 Sephacryl S-300 凝胶过滤层析测定 APPⅡA 分子量
Fig. 3 Molecular weight determination of polysaccharide APPⅡA from
Auricularia polytricha by Sephacryl S-300 gel filtration.
2.3.2 TLC 分析：图 4 显示的是经展开系统展开后的
薄层板上各个单糖样品和多糖水解样品。其中，葡
萄糖醛酸显暗红色，山梨糖显橙黄色，果糖显橙红
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色，甘露糖和葡萄糖显蓝紫色，木糖和半乳糖显蓝
绿色，阿拉伯糖显黄绿色。APPⅡA 水解产物进行
薄层层析显示主要有两种单糖组成，经过与单糖标
准品 Rf 值和显色颜色对比，确定这两种单糖分别
为木糖和甘露糖。

图 4 薄层层析分析 APPⅡA 单糖组成
1：葡萄糖醛酸；2：山梨糖；3：木糖；4：阿拉伯糖；5：半乳糖；6：
多糖水解物；7：甘露糖；8：葡萄糖；9：果糖.
Fig. 4 Monosaccharide composition of polysaccharide APPⅡA from
Auricularia polytricha analyzed by thin-layer chromatography. 1:
Glucuronic acid; 2: Sorbose; 3: Xylose; 4: Arabinose; 5: Galctose; 6:
Hydrolyte of APPIIA; 7: Mannose; 8: Glucose; 9: Fructose.
2.3.3 紫外光谱检测：APPⅡA 在 260nm 和 280nm
处无吸收峰（图 5），表明它不含核酸、多肽和蛋白
质等结构。此外，APPⅡA 的最大吸收区间处于低
波长紫外区。

图 5 APPⅡA 的紫外光谱
Fig. 5 Ultraviolet spectrum of polysaccharide APPⅡA from
Auricularia polytricha.

2.3.4 红外光谱检测：取 APPⅡA 2.0mg，加 100mg
溴化钾压片，红外光 4,000cm-1－400cm-1区间扫描，
得到 APPⅡA 的红外光谱图（图 6）。APPⅡA 具有
3,416.36cm-1 处的 O-H 吸收峰和 2,926.54cm-1 处的
C-H 吸收峰（Mitry et al. 2000），这是糖类的特征吸
收峰。在 892.93cm-1 处有特征峰，代表它是 β-吡喃
型多糖（霍光华等 2002），但同时可能具有 α-构象
结构。1,251.01cm-1 处的吸收峰显示其含有硫酸基，
而不含蛋白质、氨基酸结构即在 1,650 和 1,548cm-1
处没有峰。

图 6 APPⅡA 的红外光谱
Fig. 6 IR spectrum of polysaccharide APPⅡA from Auricularia
polytricha.
2.3.5 核磁共振光谱检测：对APPⅡA进行了1HNMR
的测定（图7）。综合1HNMR和化学分析结果考虑，
在4.4－5.5ppm范围内出现了两个异头氢信号，说明
存在两种单糖，即5.252ppm代表的α-D-甘露糖和
4.437ppm代表的β-L-木糖。

图 7 APPⅡA 的 1HNMR 扫描图谱
Fig. 7 1HNMR spectrum of polysaccharide APPⅡA from Auricularia
polytricha.
3 讨论
多糖是一切有生命机体不可缺少的成分，具有
复杂的结构。近些年来，多糖的抗肿瘤、抗衰老、
抗病毒等活性正逐渐被发现并加以利用。由于多糖
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的生物活性与其纯度、化学结构等有着重要的联
系，因此，对多糖的开发包含了多糖的分离纯化、
结构研究、活性测定、结构修饰等内容（韦巍
2005）。而真菌多糖则是从真菌子实体、菌丝体、
发酵液中分离得到的，具有控制细胞分裂、调节细
胞生长和衰老等作用的高分子聚合物，现已成为当
今医药和食品行业共同关注的焦点（吴新君等
2004）。目前，已经开发利用的真菌多糖主要有香
菇多糖、灵芝多糖、茯苓多糖等。
毛木耳A. polytricha作为药食两用真菌，具有易
栽培，产量高的优点，是我国食用菌产业发展的主
要品种，与黑木耳具有相似的功效（赵因和张悦
2001）。但是，仅有少数学者对A. polytricha的药理
学活性如止血、降血脂等作用进行了研究。到目前
为止，很少有学者将其子实体多糖的结构与活性相
结合进行详细研究的报道。本文作者通过运用小鼠
S180载体实验、多糖的分离纯化技术以及结构研究
方法，展开对A. polytricha多糖的研究，主要是抗肿
瘤活性方面的研究，以期为A. polytricha深层次的研
究和开发奠定理论基础。结果显示，从A. polytricha
781号子实体中分离纯化得到的APPⅡA具有较好
的抑制小鼠S180生长的作用，且属于典型的抗肿瘤
活性多糖的结构。不过，由于分离得到的APPⅡA
分子质量较大，13CNMR扫描图谱信号微弱，不能
提供有效的信息，仍需进一步深入研究，如使用更
高频率的NMR仪和2D-NMR技术等。

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