全 文 ：云南25份石榴资源的RAPD分析
杨荣萍,龙雯虹,张 宏,许 彬,李文祥 *
(云南农业大学园林园艺学院,昆明 650201)
摘 要:用 RAPD标记技术分析了 25份云南地方石榴材料(品种或类型)的亲缘关系,从 128个随机引物中筛选出
12个重复性好、条带清晰的多态性引物,并用这些引物对 25份云南石榴材料进行 RAPD扩增,共扩增出 110条谱
带,平均每个引物9.17条。多态性程度达到71.8%。用Statistic分析软件计算出的遗传距离为0.027~0.342,对25份
材料进行了UPGA法聚类,亲缘关系树状图显示,25份云南石榴材料的遗传背景较复杂,难以划分类群。研究结果与
生产上根据风味、花色、皮色、子粒颜色、核软硬程度等某一性状及栽培目的的分类方法不一致。
关键词:石榴;种质资源;RAPD;聚类分析;亲缘关系
中图分类号:S665.4 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2007)02-226-04
RAPDanalysisof25Punicagranatumgermplasmresourcescolectedin
Yunnanprovince
YANGRong-ping,LONGWen-hong,ZHANGHong,XUBin,LIWen-xiang*
(ColegeofLandscapeandHorticulture,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan650201China)
Abstract:25cultivarsofpomegranatePunicagranatumL.wereanalyzedbyusingrandomamplifiedpolymorphicDNAmark-
ers.12primers,whichhadrepeatableandclearbands,werescreenedfrom128arbitrary10-merprimers.The12random
primerswereusedtoamplify25pomegranatesamples.110bandswereobtainedandtheaveragebandsperrandomprimer
were9.17.Thegeneticdiversitydegreewas71.8%.Thegeneticdistancebetweencultivarswas0.027to0.342bytheaccount
ofstatisticanalysissoftware.Accordingtothedata,atreediagramofphylogeneticrelationshipwasconstructedusingUPGA.
TheresultsshowedthatthegenebackgroundofpomegranategermplasmresourcesinYunnanwascomplexanditwasdifi-
culttobeclassified.Theresultofthisstudydisagreedwiththetraditionaltaxonomybasedonflavor,thecolorofpetal,the
colorofpericarp,thecolorofseed,therigidityofpitandthepurposeofplanting.
Keywords:PomegranatePunicagranatumL.;Germplasm;RAPD;Clusteranalysis;Phylogeneticrelationship
石榴(PunicagranatumL.)为石榴科(安石榴科)
(Punicaceae)石榴属(PunicaL.)落叶灌木或小乔木。石
榴果实营养成分较高,是一种中高档的珍稀水果,还
可加工成果汁、酒、露等。石榴栽培历史悠久,世界各
地广泛种植。我国的陕西临潼、山东枣庄、安徽怀远、
四川(会理等攀西地区)和云南是我国最有影响的5
大产区[1-5]。
石榴在果树栽培上只有一种,但品种或类型很
多。据1987—1990年对国内12个主产省区调查,查
明我国现有石榴品种或类型 138个[3]。中国园艺学
家把石榴种下分为7个变种,品种或变种内遗传背
景差异较大;石榴是以异花授粉结果为主[3],主要采
用无性繁殖,不同地域间经常交换品种,导致品种混
杂、同品种异名、同名异品种现象十分普遍,给石榴
的引种和育种造成一定的困难。目前,石榴遗传与育
种基础的研究还非常薄弱,石榴的种质资源和演化
研究也没有系统开展。因此,开展石榴遗传资源的研
究具有重要意义。
1 材料和方法
1.1 材料
研究材料取自云南省红河州蒙自县、建水县,楚
雄州禄丰县人工种植的石榴栽培品种。研究材料的
名称、产地及分布见表1。
1.2 石榴基因组DNA的提取
试验材料均选取石榴嫩叶。采用改进的SDS法
提取DNA,方法参照文献[6-7]。
1.3 引物
果 树 学 报 2007,24(2):226～229
JournalofFruitScience
收稿日期:2006-08-01 接受日期:2006-12-19
基金项目:云南省科技厅自然科学基金(编号为2006C0037M)。
作者简介:杨荣萍,女,讲师,硕士,主要从事果树分类研究。Tel:0871-5220397,E-mail:yangrongping2002@163.com
= 通讯作者。Authorforcorespondence.Tel:0871-5220003,E-mail:WX-L522@sina.com
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2007.02.021
编号
No.
名称
Name
产地及分布
Producingareaanddistribution
编号
No.
名称
Name
产地及分布
Producingareaanddistribution
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
S13
红子石榴Hongzishiliu
铁壳白子Tiekebaizi
青皮白子Qingpihongzi
单瓣观赏Danbanguanshang
薄红皮白子Bohongpibaizi
厚皮白子Houpibaizi
铁壳红子Tiekehongzi
大子酸Dazisuan
细子酸Xizisuan
红花甜Honghuatian
白花甜Baihuatian
酸甜石榴Suantianshiliu
酸光颜Suanguangyan
云南禄丰Lufeng,Yunnan
云南禄丰Lufeng,Yunnan
云南禄丰Lufeng,Yunnan
云南禄丰Lufeng,Yunnan
云南禄丰Lufeng,Yunnan
云南禄丰Lufeng,Yunnan
云南禄丰Lufeng,Yunnan
云南建水Jianshui,Yunnan
云南建水Jianshui,Yunnan
云南建水Jianshui,Yunnan
云南建水Jianshui,Yunnan
云南建水Jianshui,Yunnan
云南蒙自Mengzi,Yunnan
S14
S15
S16
S17
S18
S19
S20
S21
S22
S23
S24
S25
酸绿子Suanlvzi
厚皮甜沙子Houpitianshazi
甜绿子Tianlvzi
甜光颜Tianguangyan
绿皮酸Lvpisuan
红皮酸Hongpisuan
莹皮Yingpi
白花Baihua(又称三白sanbai)
火袍Huopao
绿皮甜Lvpitian
花红皮Huahongpi
糯石榴Nuoshiliu
云南蒙自Mengzi,Yunnan
云南蒙自Mengzi,Yunnan
云南蒙自Mengzi,Yunnan
云南蒙自Mengzi,Yunnan
云南会泽Huize,Yunnan
云南会泽Huize,Yunnan
云南会泽Huize,Yunnan
云南会泽Huize,Yunnan
云南会泽Huize,Yunnan
云南会泽Huize,Yunnan
云南会泽Huize,Yunnan
云南会泽Huize,Yunnan
表1 研究材料一览表
Table1Thelistofgermplasmtested
表2 引物名称、序列及扩增结果
Table2Thenameandsequenceofprimers
andamplifiedresults
选用北京赛百盛公司(SBS)生产的 12个引物,
引物名称及序列见表2。
1.4 RAPD扩增
PCR扩增在PCR扩增仪 (Eppendorf型,德国
产)上进行,反应总体积为25μL,其中包括10×bufer
2.5μL,MgCl22mmol/L,dNTPs(购自 Promega公司)
0.2mmol/L,TaqDNA聚合酶(购自Promega公司)2U,
引物16.5ng/μL,模板DNA1μL(约25ng)。扩增程
序为:(1)94℃2min;(2)94℃30s;(3)37℃1min;
(4)72℃2min;(2)(3)(4)40个循环;(5)72℃10
min;最后4℃保存。
1.5 PCR扩增产物的分析
统计全部条带,在重复扩增中稳定出现的带无
论强弱均赋值为 1,不存在时赋值为 0,并将观测结
果制作成Excel文件以便用于聚类分析。用Statistic
分析软件进行统计分析。采用 UPGA(Unweighted
Pair-GroupAverage)聚类分析方法构建聚类分析树
状图。
2 结果与分析
2.1 RAPD标记分析
选出的 12个引物对所有供试材料扩增结果都
显示出很好的多态性(表 2),在全部供试材料中共
扩增出110条谱带,平均每个引物9.17条。12个引
物扩增出不同的多态性条带,多态性程度达到
71.8%。扩增结果显示:25个石榴品种间具有一定的
亲缘关系。71.8%的多态性与石榴主要是异花授粉
以及长期的引种栽培驯化等有很大的关系。RAPD
引物扩增的部分结果见图1。
2.2 品种鉴定
本研究用引物F-10进行扩增,结果在 630bp
处,会泽的8份材料除了白花石榴(又称三白)无条
带以外,其余7份材料都有明显的条带,故可以用引
物F-10把白花石榴区分开。
2.3 遗传距离分析
遗传距离的大小能不同程度的反映其各供试材
料间亲缘关系的远近。25份材料两两间的遗传距离
如图 2,材料间的遗传距离为 0.027～0.342。青皮白
子、厚皮白子、铁壳红子的遗传距离最近,均为
0.027,说明它们之间的亲缘关系较近。亲缘关系最
远的为红花甜和绿皮酸,遗传距离为0.342。
2.4 聚类分析
如图2所示,在0.25域值下可将25个品种或
类型划分为 3类。第 1类群包括 S18、S19和 S20号材
料,分别为绿皮酸、红皮酸和莹皮。第2类群包括
S23、S24和 S25号材料,分别为绿皮甜、花红皮和糯石
榴。第 3类群包括 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、
S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17、S21和S22号材料,分别为红
引物
Primer
引物序列
(5’to3’)
Nucleotide
sequence
扩增条带数
Totalbands
多态性
条带数
Polymorphic
bands
多态百分率
Rateof
polymorphic
loci(%)
A-08
A-10
B-01
C-15
F-10
G-18
H-20
K-12
K-17
L-11
M-11
N-20
总计
Total
平均
Average
GTGACGTAGG
GTGATCGCAG
GTTTCGCTCC
GACGGATCAG
GGAAGCTTGG
GGCTCATGTG
GGGAGACATC
TGGCCCTCAC
CCCAGCTGTG
ACGATGAGCC
GTCCACTGTG
GGTGCTCCGT
12
5
10
11
9
8
9
8
15
6
11
9
9
110
4
7
6
8
6
6
5
8
4
9
8
8
79
80.0
70.0
54.5
88.9
75.0
66.7
62.5
53.3
66.7
81.8
88.9
88.9
71.8
杨荣萍等:云南25份石榴资源的RAPD分析2期 227
果 树 学 报 24卷
图2 25份石榴品种资源RAPD标记的聚类分析树状图
S1-S25的名称同表1。
Fig.2Dendrogramof25samplesbyRAPDmarkermethods
NameofS1-S25aresameasTable1.
子、铁壳白子、青皮白子、单瓣红花观赏、薄红皮白
子、厚皮白子、铁壳红子(又名青皮红子)、大子酸、细
子酸、红花甜、白花甜、酸甜石榴、酸光颜、酸绿子、厚
皮甜沙子、甜绿子、甜光颜、白花和火袍。各类群都具
有一些共同的特征,下面逐一分述:
第1类群的 3份材料的产地和花色都相同,产
于会泽县,花红色,但花瓣数、果皮颜色、子粒软硬程
度、子粒颜色及风味均不同。绿皮酸的花瓣6枚、果
皮黄绿色、阳面有红晕或细条纹、子粒硬、子粒大红
色、风味酸。红皮酸的花瓣7枚、果皮黄色、具大片鲜
红斑块、子粒软、子粒水红色、风味酸。莹皮的花瓣6
片、果皮底面黄绿带大红色、子粒软、子粒水红或大
红色、风味甜。
第2类群的3份材料产于会泽县,品质较好,是
当地的主栽品种。3份材料的树形丛生、开张,花红
色,萼筒中高,子粒较软,果实味甜,但叶形、花瓣数、
果实形状、果皮颜色和子粒颜色均不同。
第3类群的 19份材料产于会泽、禄丰、蒙自和
建水县。这一类的树形、叶形、枝条、花瓣颜色、花瓣
数、果实形状、果皮颜色、子粒软硬程度、子粒颜色及
风味都不同。花色除了白花甜和会泽的白花石榴为
白色外,其余材料均为红色。其中蒙自的酸绿子、厚
皮甜沙子和甜绿子先聚在一起,从遗传距离看,酸绿
子和厚皮甜沙子为 0.054,厚皮甜沙子和甜绿子为
0.045,酸绿子和甜绿子为 0.081,也较近,但从外部
形态来看,差异较大。
3 讨 论
利用RAPD技术进行品种鉴定,在梨[8-10]、樱
桃[11-12]等果树上已有报道。本研究利用RAPD技术
对云南25份材料进行品种鉴定,结果能把白花石榴

图1 引物C-15对部分供试材料DNA的扩增结果
M:DL2000maker;1.厚皮甜沙子;2.甜绿子;3.甜光颜;4.绿皮酸;5.红皮酸;6.莹皮;7.白花;8.火袍;9.绿皮甜;10.花红皮;11.糯石榴
Fig.1AmplificationproductsofprimerC-15forpartmaterials
M:DL2000maker;1.Houpitianshazi;2.Tianlvzi;3.Tianguangyan;4.Lipisuan;5.Hongpisuan;6.Yingpi;
7.Baihua;8.Huopao;9.Lvpitian;10.Huahongpi;11.Nuoshiliu
228
2期 杨荣萍等:云南25份石榴资源的RAPD分析
鉴别出来,但有部分品种或类型暂时没有找到特征
带,有待进一步研究。
RAPD技术在石榴资源的亲缘关系分析上是可
行的。在聚类分析中,花红皮和糯石榴聚在一类,据
报道,糯石榴是花红皮的变异类型[3],花红皮为倒卵
圆形叶、花瓣6枚、果实圆球形、果皮底面黄绿具鲜
红彩色、子粒水红色,糯石榴为长披针形或倒卵圆形
叶、花瓣7枚、果实扁圆形、果皮底面浅绿带大红色、
子粒水红色、具芒状,故这2份材料聚在一类较为合
理。还有禄丰的青皮白子和厚皮白子首先聚在一起,
它们的树形开张,长披针形叶,花瓣5枚、红色,果皮
底面绿色、具微红色,萼筒中高、闭合,子粒软、白色
带微红,味甜。从外部特征看这2份极为相似,从遗
传距离看也是最近的,为 0.027,有可能是同一个品
种或芽变类型,但由于受当地的生态环境和栽培条
件影响,2者又有一定的差异,需要做进一步的研
究。
生产上的分类方法很多,依据生产上的分类方
法,如石榴品种按风味划分,分甜、酸2大类群;按花
色分红花和白花石榴;按皮色分红皮、绿皮、青皮、黄
皮、白皮、粉皮及条纹等类群;按皮的厚度分厚皮和
薄皮;按子粒颜色分红子、粉红子和白子;按核的硬
度分硬核、半软核及软核3种类型[2]。从RAPD标记
建立的聚类图上看,与生产上根据某一性状分类的
结果相差较远。
石榴品种间的亲缘关系越近,RAPD多态性程
度越低。从RAPD标记建立的树状图显示来看,有
些关系与形态特征相吻合,有些却相差较远。形态特
征与RAPD聚类结果的不完全吻合,说明了石榴栽
培品种有较复杂的遗传背景和丰富的种质资源。生
产上根据风味、花色、皮色、子粒颜色、核软硬程度及
栽培目的等分类方法分成的品种群间的差异从
RAPD聚类图中不能反映出来,这可能是因为生产
上只是根据形态的某个性状命名和分类,而品种间
的遗传差异是多个性状的综合反映,RAPD技术所
探测的范围涉及整个基因组,此技术是根据品种间
的综合遗传差异分类。根据试验结果,建议根据石榴
品种或类型的综合性状进行统一的命名和分类。
4 结 论
本研究利用引物F-10在630bp处,能把白花
石榴从会泽的材料中鉴别出来,证明可以利用
RAPD标记技术进行石榴资源的品种鉴定,特别是
在类群方面,能够揭示它们之间的亲缘关系。RAPD
聚类结果与25份材料的形态性状分类比较,结果与
生产上根据风味、花色、皮色、子粒颜色、核软硬程度
及栽培目的等某性状的分类有一定的差距。
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