全 文 ：分子植物育种，2011年，第 9卷，第 1期，第 41-45页
Molecular Plant Breeding, 2011, Vol.9, No.1, 41-45
研究报告
A Letter
果子蔓凤梨 Actin基因的克隆与序列分析
刘建新 * 葛亚英 田丹青 张智 丁华侨 沈福泉 王炜勇
浙江省农业科学院花卉研究开发中心,杭州, 311202
*通讯作者, ljxljx20002000@yahoo.com.cn
摘 要 持家基因 Actin常被用作定量、半定量 PCR试验的内参，以确定目标基因的相对表达量。基于前期从
全长 cDNA文库中获得 Actin基因的 EST单克隆，进行 Primer Walking测序，获得一个 Actin基因的全长
cDNA序列，序列长 1 625 bp，ORF为 1 131 bp，可编码 377个蛋白氨基酸，命名为 Goactin1 (GenBank登录号:
HQ184438)。蛋白质理论分子质量为 41.7 kD，等电点 pI为 5.31，包含一个 Actin superfamily保守区，二级结构
主要由随机卷曲、Alpha螺旋、延伸链和 Beta转角组成。此外以 2BTFA链为基础建立起了 Goactin1蛋白的三
级结构图。系统进化树分析表明 Goactin1蛋白与马铃薯、棉花、烟草、短柄草、拟南芥等的 Actin蛋白聚为一
类，它们的亲缘关系最近。
关键词 果子蔓凤梨, Actin,克隆
Cloning and Sequence Analysis of Actin Gene from Guzmania
Liu Jianxin * Ge Yaying Tian Danqing Zhang Zhi Ding Huaqiao Shen Fuquan Wang Weiyong
Research&Development Centre of Flower, ZhejiangAcademyofAgricultural Sciences, Hangzhou, 311202
* Corresponding author, ljxljx20002000@yahoo.com.cn
DOI: 10.3969/mpb.009.000041
Abstract As a house keeping gene, Actin was often used as inner control in quantitative and semiquantitative
PCR tests to determine relative expressive amount of target genes. Based on EST monoclones of Actin gene ob-
tained from Guzmania full length cDNA library, its full length cDNA sequence was obtained by Primer Walking
sequencing. The gene, named for Goactin1 (GenBank accession No. HQ184438), consisted of 1 625 bp cDNA se-
quence, 1 131 bp ORF (open reading frame) which encoded a protein with 377 amino acids residues, and a putative
protein which was 41.7 kD at estimated molecular weight, 5.31 at isoelectric point and had a ‘actin superfamily’
conservative domain. The secondary structure of the protein was composed of random coil, alpha helix, extend
strand and beta turn by SPOMA analysis. Furthermore, its tertiary structure was also build based on A chain of
2BTF. Through phylogenetic tree analysis, Goactin1 was gather to a same group with Actin protein in Solanum
tuberosum, Gossypium hirsutum, Nicotiana tabacum, Brachypodium sylvaticum, and Arabidopsis thaliana．
Keywords Guzmania (Guzmania Ruiz & Pav), Actin, Clone
基金项目：本研究由浙江省重大科技专项重点项目(2009C12095)和浙江省农科院科技创新能力提升工程项目共同资助
植物肌动蛋白(Actin)是广泛存在的组成型表达
蛋白质，具有高度的保守性(Meagher et al., 1999)。自
从 1963年，阎隆飞等人第一次提出在高等植物中存
在肌动蛋白开始(阎隆飞和石德权, 1963)，目前已经
在高等植物的花粉、根毛、茎形成层、茎韧皮部、叶鞘
细胞、叶表皮细胞、卷须和内果皮等组织中都已发现
存在肌动蛋白(Kost et al., 1999)，而且与动物及真菌
中的肌动蛋白一样，为多基因家族(张少斌和刘国琴,
2006; Hussey et al., 2006)。植物肌动蛋白与微丝形成
相关，而微丝是细胞骨架的主要组分，它参与细胞内
胞质环流、形状维持、运动、分裂、分化、物质运输、信
号转导以及极性建成等重要的生理活动 (马雄风等,
2010)。Actin作为持家基因，在不同个体及组织细胞
中的表达相对稳定，具有组成型表达、易于扩增等许
多优点，因此与其它持家基因GAPDH、18S rRNA、TBP
以及 β-2-microglobulin等一样，常在定量、半定量
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
PCR研究中用作内参，以确定目标基因的相对表达量
(朱华等, 2006;杨发龙等, 2007; Liu, 2003)。
果子蔓凤梨为花卉市场上占比最大的观赏凤梨
种类，是果子蔓属(Guzmania Ruiz & Pav)又称为擎天
凤梨属植物，目前国内外有关该属的 Actin基因研究
未见报道。本研究在前期已获得观赏凤梨的全长
cDNA文库，并经随机挑取单克隆、批量测序获得大
量 EST信息的基础上，获取 Actin基因全长 cDNA
序列，进行生物信息学分析，为建立观赏凤梨的定
量、半定量 PCR技术体系打下坚实基础。
1结果与分析
1.1 Goactin1基因的克隆
将单克隆 |ppfca0_001242.z1.scf|进行 PrimerWal-
king测序，获得了 Actin基因的全长 cDNA序列，序
列长 1 625 bp，ORF为 1 131 bp，推断的蛋白氨基酸
数目为 377个，起始密码子为 ATG，终止密码子为
TAA，将其命名为 Goactin1 (图 1)，GenBank登录号为
HQ184438。
1.2全长 cDNA及推定氨基酸序列的 Blast分析
将获得的 Goactin1基因全长 cDNA序列进行核
苷酸同源性 (BlastN) 比对，发现与毛果杨(Populus
trichocarpa)、绿豆 (Vigna radiata)、亮叶桦 (Betula
luminifera)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、拟南芥
(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、棉花
(Gossypium hirsutum)、豌豆 (Pisum sativum)、篦麻
(Ricinus communis)、西洋梨(Pyrus communis)、桐花树
(Aegiceras corniculatum)、李 (Prunus salicina)、菜豆
(Phaseolus vulgaris)、蝴蝶兰(Phalaenopsis sp)、欧洲云
杉(Picea abies)、兴安落叶松(Larix gmelinii)、含羞草
(Mimosa pudica)、柿子树 (Diospyros kaki)、大车前
(Plantago major)、亚麻 (Linum usitatissimum)、马铃薯
(Solanum tuberosum) 等的 Actin基因有较高的同源
性。其中与毛果杨(XM_0023111-31,GENE: 7467546)，
绿豆 (AF143208.1)，亮叶桦 (FJ4-10442.1) 的一致性
(Identities)最高，达到 84%。
将推断出的 377个蛋白氨基酸序列与蛋白质数
据库进行氨基酸序列同源性(BlastP)比对，结果表明
与篦麻(XP_002530711.1, EEF31665.1)、马铃薯(CAA-
39280.1)、棉花(AAC31886.1)、毛果杨(XP_002308365.1,
XP_002322664.1, ABK92789.1, XP_002311167.1, EE-
E88534.1,XP_002316289.1,ABK92513.1,EEF02460.1)、
柠条(ACK87035.1)、烟草(ACH69153.1, CAA45149.1)
的一致性最高(Identities)，达到 99%。
1.3推定编码蛋白的一级、二级结构及保守区分析
对推定的氨基酸序列进行 ProtParam预测，可知
蛋白质的相对分子质量为 41.7 kD，等电点 pI为 5.31，
负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)有 50个，正电荷氨基酸
残基(Arg+Lys)有 38个。采用 SPOMA进行二级结构
预测，实验结果表明：推定蛋白的二级结构主要由随
机卷曲 (random coil, 33.69%)、Alpha螺旋 (alpha helix,
39.26%)、延伸链(extend strand, 20.42%)和 Beta 转角
(beta turn, 6.63%)组成(Combet et al.,2000) (图 2)。在
NCBI上进行利用 Specialized Blast工具进行保守区
分析，推定的氨基酸序列保守区分析发现，包含一个
保守区 Actin superfamily (图 3)。该保守区含有多处
6个氨基酸残基的 ATP结合位点、11个 profilin结合
位点和 9个氨基酸残基 gelsolin 结合位点(Marchler
Bauer et al., 2009; Marchler-Bauer and Bryant, 2004)。
1.4三级结构的预测
将推定的蛋白氨基酸序列提交给 ESyPred3D，
获得 Goactin1的三级结构模型如图 4所示，该三级
结构模型是用 2BTF A链的 3D结构作为模板而建
立起来的，经比对两者有 88.3%的同源性(Lambert et
al., 2002)。
1.5分子进化分析
采用 ClustalX (1.81)程序对 Goactin1 及其它物
种 Actin蛋白氨基酸序列进行多序列比对，并将比对
结果用 MEGA4.0生成的圆形分子系统树(Neighbor-
Joining法)。结果表明(图 5)，Goactin1与马铃薯(gi|2-
31503|, gi|231496|)、棉花(gi|54035683|)、烟草(gi|1973-
22805|, gi|461465|)短柄草(gi|226858185|)、拟南芥(gi|1-
5231447|, gi|15238387|, gi|28393806|)聚为一类，它们
的亲缘关系最近。
2讨论
肌动蛋白(Actin)是普遍存在的最保守的古老蛋
白质之一，具有高度的保守性(Meagher et al., 1999)，
是微丝的主要组分。在决定细胞分裂、维持细胞骨架
结构，指导细胞的伸长及细胞壁的沉积中所起的作
用对于植物正常的形态建成是至关重要的(周海飞等,
2001)。经 GenBank数据库搜索及文献查找可知，目
前已在拟南芥、水稻、玉米、毛果杨、江南卷柏、篦麻、
油橄榄、小立碗藓、微孔草、蒙古冰草、黄瓜、八棱海
棠、盐藻、向日葵等植物克隆了肌动蛋白基因。
42
在 Blast分析中，BlastN分析同源性(Identities)最
高的毛果杨(XM_002311131, GENE ID:7467546)、绿
豆 (AF143208.1)、亮叶桦 (FJ410442.1)，为 84%。而
BlastP分析中，同源性最高的篦麻(XP_002530711.1,
EEF31665.1)、马铃薯(CAA39280.1)、棉花(AAC31886.1)、
图 1 Goactin1基因的 mRNA序列及推定氨基酸序列
Figure 1 mRNA sequence and deduced amino acid sequence of Goactin1 gene
毛果杨(XP_002308365.1, XP_002322664.1, ABK927-
89.1, XP_002311167.1, EEE88534.1, XP_002316289.1,
ABK92513.1, EEF02460.1)、柠条 (ACK87035.1)和烟
草(ACH69153.1, CAA45149.1)一致性达到 99%。为了
排除非编码区的影响，取 cDNA编码区序列(CDS)进
果子蔓凤梨 Actin基因的克隆与序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Actin Gene from Guzmania 43
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
行 BlastN，可知同源性最高的还是毛果杨(XM_00-
2311131, GENE ID: 7467546)、绿豆(AF143208.1)、亮
叶桦(FJ410442.1)，而且同源性也为 84%。可见，cDNA
的同源性远小于其推定的氨基酸，表明 Actin基因的
碱基序列虽然在不同植物中存在较大变异，但蛋白氨
基酸序列在不同植物中却保持了高度的稳定性和一
致性，以确保植物生长发育过程的正常进行。
3材料与方法
3.1材料
植物材料为果子蔓属凤梨栽培品种 Ostara的早
期花器官。
3.2方法
笔者从 2008年开始，构建了果子蔓凤梨(Ostara)
花器官的质粒型全长 cDNA文库，并对 2004个阳性
克隆进行 5EST测序，获得高质量序列 1758条的基础
上(刘建新等, 2009)。对相关序列进行Blast分析后，确
定属于 Actin基因的 EST有 10条，包括三条单 EST
——|ppfca0_000981.z1.scf|、|ppfca0_000514.z1.scf|、
|ppfca0_000958.z1.scf|和两个重叠群——|ppfca0_0001_
C12.ab1|，|ppfca0_001242.z1.scf|，|ppfca0_000453.z1.
scf|和 |ppfca0_0011- 61.z1.scf|，|ppfca0_001244.z1.scf|，
|ppfca0_000774.z1.s- cf|，|ppfca0_001078.z1.scf|。每个
重叠群取一个单克隆和单 EST送至杭州华大基因研
发中心进行 Primer Walking 测序测通，其中
|ppfca0_001242.z1.scf|测序后得全长 cDNA序列，其
余测序结果另行分析并发表。
采用多种生物信息学方法对目标基因的核苷酸
序列、蛋白氨基酸序列的特征以及亲缘关系进行了分
析，如以 ExPASy结合 BlastP法来推定氨基酸序列、
Blast法对核苷酸及氨基酸进行多序列比对、ProtParam
预测蛋白的理论分子量及等电点，SPOMA确定蛋白
质的二级结构构成、Find conserved domains(NCBI)查
找保守区、ESyPred3D预测蛋白质的三级结构、Clus-
talX(1.81)结合MEGA4.0软件构建分子进化图等。
参考文献
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图 3 Goactin1蛋白氨基酸序列的保守区
Figure 3 Conservative domain of Goactin1 amino acid sequence
图 4基于 2BTF A链推定的 Goactin1蛋白三级结构
Figure 4 Tertiary structure of putative Goactin1 protein based on
a chain of 2BTF
图 2 Goactin1推定蛋白的二级结构
注:蓝线: Alpha helix;深红线: Extended strand;绿线: Beta turn;
浅红线: Random coil
Figure 2 Secondary structure of putative Goactin1 protein
Note: Blue line: Alpha helix; Deep red line: Extended strand;
Green line: Beta turn; Pale Red: Random coil
图 5 Goactin1推定氨基酸序列的分子进化分析
Figure 5 Molecular evolution analysis in putative amino acid se-
quence of Goactin1
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