全 文 ：２０１５年１１月 四川大学学报（自然科学版） Ｎｏｖ．２０１５
第５２卷　第６期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５２　Ｎｏ．６
收稿日期：２０１４－０５－３０
基金项目：国家８６３计划（２０１３ＡＡ１０２８０２－０５）
作者简介：陈诚（１９９１－），男，四川宜宾人，硕士研究生，主要研究方向为植物微生物资源与利用．
通讯作者：张小平．Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｘｉａｏｐｉｎｇｐｈｄ＠１２６．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１５．１１．０３６
镍矿区紫茎泽兰根际及内生细菌多样性研究
陈　诚１，赵　珂１，李小林２，张　波１，辜运富１，郑林用３，张小平１
（１．四川农业大学资源环境学院微生物系，成都６１１１３０；２．四川省农业科学院土壤肥料研究所，成都６１００６６；
３．四川省农业科学院，成都６１００６６）
摘　要：利用变性梯度凝胶电泳（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）技术对四川
省攀枝花市镍矿区紫茎泽兰根际及不同器官中内生细菌多样性进行分析．结果表明，紫茎泽
兰根际与不同器官内生细菌多样性存在明显差异，香农－威纳指数（Ｈ）、丰度（Ｓ）及均匀度
（ＥＨ）皆表现为根际土＞叶＞茎＞根．土壤重金属含量与内生细菌多样性相关性分析表明，
样品的丰度（Ｓ）与Ｚｎ含量呈显著正相关 （Ｐ＜０．０５）．典型对应分析（ｃｏｎｏｎｉｃａｌ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎ－
ｄｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ＣＣＡ）显示，根际土细菌多样性受Ｚｎ、Ｃｄ、Ｐｂ、Ｎｉ等重金属负向影响；紫茎泽
兰叶内生细菌多样性与土壤Ｃｕ元素浓度呈负相关关系．ＤＧＧＥ条带回收测序结果显示，根
际及内生细菌主要为变形菌门（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、异常球菌－栖热菌门（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ－Ｔｈｅｒｍｕｓ）、
芽单胞菌门（Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ）、放线菌门（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）及部分不可培养的细菌．
关键词：镍矿区；紫茎泽兰；细菌；多样性；ＤＧＧＥ
中图分类号：Ｑ９３８．１　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：０４９０－６７５６（２０１５）０６－１３８７－０６
Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃ　ａｎｄ　ｅｎｔｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｏｆ
Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ　ａｄｅｎｏｐｈｏｒｕｍｉｎ　ｎｉｃｋｅｌ　ｍｉｎｅ
ＣＨＥＮ　Ｃｈｅｎｇ１，ＺＨＡＯ　Ｋｅ１，ＬＩ　Ｘｉａｏ－Ｌｉｎ２，ＺＨＡＮＧ　Ｂｏ１，ＧＵ　Ｙｕｎ－Ｆｕ１，
ＺＨＥＮＧ　Ｌｉｎ－Ｙｏｎｇ３，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏ－Ｐｉｎｇ１
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１１１３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｏｉｌ　ａｎｄ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６６，Ｃｈｉｎａ；３．Ｓｉｃｈｕａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ）ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｅｎｔｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｏｒｇａｎｓ　ｏｆ　Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ　ａｄｅｎｏ－
ｐｈｏｒｕｍｇｒｏｗｉｎｇ　ｉｎ　Ｎｉｃｋｅｌｉｎ　Ｎｉｃｋｅｌ　Ｍｉｎｅ　ｏｆ　Ｐａｎｚｈｉｈｕａ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃ　ａｎｄ　ｅｎｔｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．Ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｉｎｄｅｘ（Ｈ）ａｎｄ　ｒｉｃｈｎｅｓｓ（Ｓ）ａｎｄ　ｅｖｅｎｎｅｓｓ（ＥＨ）ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｓａｍｐｌｅ，ｆｏｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｌｅａｆ，
ｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｒｏｏｔ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｒｉｃｈｎｅｓｓ（Ｓ）ｓｈｏｗｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｒｒｅｌａ－
ｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｚｉｎｃ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｃｏｎｏｎｉｃａｌ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＣＡ）ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗａｓ　ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｚｉｎｃ（Ｚｎ），ｃａｄｍｉｕｍ （Ｃｄ），ｌｅａｄ
（Ｐｂ），ｎｉｃｋｅｌ（Ｎｉ）ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｈｅａｖｙ　ｍｅｔａｌｓ．Ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｅｎｔｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｌｅａｆ　ｏｆ　Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ
ａｄｅｎｏｐｈｏｒｕｍ ｗａｓ　ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｃｏｐｐｅｒ（Ｃｕ）ａｓ　ｗｅｌ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＤＧＧＥ　ｂａｎｄｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５２卷
ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｌｏｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｙ　ｃａｔｅｇｏｒｉｚｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ－Ｔｈｅｒｍｕｓ，
Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ，Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，ａｎｄ　Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｎｉｃｋｅｌ　ｍｉｎｅｓ；Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ　ａｄｅｎｏｐｈｏｒｕｍ；Ｂａｃｔｅｒｉａ；ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ＤＧＧＥ
１　引　言
紫 茎 泽 兰 （Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ　ａｄｅｎｏｐｈｏｒｕｍ
Ｓｐｒｅｎｇ．）是一种繁殖力极强的恶性杂草，一旦侵
入经济林地或农田，就会破坏原有生态系统，严
重危害农林牧副业的发展［１］．有研究发现，紫茎
泽兰的入侵会改变土壤微生物多样性，具体表现
为提高土壤功能菌种群数量，增强土壤酶活［２］，
同时紫茎泽兰根际细菌种类和数量会随其入侵程
度增加而增加，微生物多样性呈上升趋势［３］．因
此，紫茎泽兰的入侵可在一定程度上改善土壤状
况．镍矿区土壤重金属含量高，紫茎泽兰的生长
对该环境下土壤微生物多样性的影响却鲜见报道．
植物根际与内生细菌可有效降解累积于植物
维管束中的有毒化合物，从而减轻土壤污染物对
植物 的 毒 害 作 用，使 植 物 进 行 自 我 修 复［４］．
Ｌｏｄｅｗｙｃｋｘ等［５］研究发现，将植物内生细菌接种
到植物根部，可增强宿主植物对重金属的吸收，
可见，内生细菌对重金属污染植物的自我修复有
积极作用．所以对镍矿区植物根际及内生细菌多
样性的研究可为开拓有价值微生物提供参考．
ＤＧＧＥ技术如今已被广泛运用于不同环境下
细菌多样性研究，并显示出较好的成效．通过变
性梯度凝胶电泳（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏ－
ｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）技术研究微生物多样性，既克服
了传统的可培养手段的缺陷，又能充分了解环境
中微生物多样性及其功能．本文拟通过ＤＧＧＥ技
术探究镍矿区正常生长的茎泽兰根际及内生细菌
多样性，以期了解该环境下主要的细菌种群，同
时分析重金属环境下生长的植物对其根际及内生
细菌多样性的影响．
２　材料与方法
２．１　材料
紫茎泽兰采自于四川攀枝花钒钛产业园区内
镍矿厂矿渣覆盖区域（２６°２９′２９″Ｎ，１０１°４９′４５″Ｅ，
海拔１３２０ｍ），该区域植被大多被破坏，但紫茎泽
兰长势良好．紫茎泽兰在矿渣区域丛生，丛与丛
之间距离３－５ｍ，随机选取３个样方，每个样方面
积约１ｍ２．每个样方中随机采集５株紫茎泽兰植
株，同时按Ｓｍａｌａ　Ｋ 等［６］方法采集适量根际土
壤．
２．２　方法
２．２．１　重金属浓度测定　按土壤环境质量标准
（ＧＢ１５６１８－１９９５）［７］测定紫茎泽兰根际和根茎叶器
官的重金属浓度，每种重金属浓度重复测定三次．
２．２．２　总ＤＮＡ提取　采用小量法［８］提取紫茎泽
兰根际土及根茎叶器官总ＤＮＡ．
２．２．３　ＰＣＲ扩增　采用巢式ＰＣＲ对目标片段进
行扩增．第１轮 ＰＣＲ 选用的引物为８－２７Ｆ 和
１５２４－１５０３Ｒ．第２轮ＰＣＲ以第１轮ＰＣＲ产物为
模板，选用Ｆ９８４－ＧＣ和Ｒ１３７８进行扩增［８］，ＰＣＲ
反应体系及程序参照张波等［９］．选用的引物序列
见表１．
表１　ＰＣＲ扩增的引物及其序列
Ｔａｂ．１　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒｓ
目标基因位置
Ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ
引物序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５′→３′）
８－２７Ｆ ８～２７ ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ
１５２４～１５０３Ｒ １５０３～１５２４ ＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡ
Ｆ９８４ＧＣ　 ９６８～９８４ ＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧ　ＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣ
Ｒ１３７８　 １３７８～１４０１ ＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧ
２．２．４　变性凝胶梯度电泳　ＤＧＧＥ在Ｄｃｏｄｅ系
统（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上进行，聚丙烯酰胺凝胶浓度为８％，
变性剂梯度浓度范围为３０％～６０％．在１×ＴＡＥ
缓冲液中，５０Ｖ电泳３０ｍｉｎ，然后１８０Ｖ ，６０℃
恒温恒压电泳６ｈ．电泳完毕后将剥离的聚丙酰胺
凝胶置于ＥＢ（０．５μｇ／ｍＬ）溶液中染色１５ｍｉｎ，然
８８３１
第６期 　　 陈诚，等：镍矿区紫茎泽兰根际及内生细菌多样性研究 　
后在Ｂｉｏ－Ｒａｄ凝胶成像系统下成像．
２．２．５　ＰＣＲ－ＤＧＧＥ图谱分析　采用 Ｑｕａｎｔｉｔｙ
Ｏｎｅ分析软件（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）对各样品电泳条带的数量
及强度进行分析．香农－威纳指数（Ｈ）、丰度（Ｓ）和
均匀度（ＥＨ）等指标被用来描述与比较各个样品的
细菌多样性［１１］．
Ｈ＝ －∑Ｐｉ·ｌｎＰｉ
ＥＨ＝Ｈ／Ｈｍａｘ＝Ｈ／ｌｎＳ
式中，Ｐｉ是试验样品中单一条带的灰度在该
样品中所有条带灰度的比率，Ｓ为丰富度，即试验
样品每一泳道的条带数目．
２．２．６　方差及统计分析　实验数据的方差分析采
用ＳＰＳＳ（１７．０），图表制作采用Ｅｘｃｅｌ（２００３），重
金属含量与紫茎泽兰根际及内生细菌多样性的分
析运用典型对应分析，采用 ＭＶＳＰ　ｖ３．１３软件
包［１２］．
２．２．７　ＤＧＧＥ条带测序与系统发育树构建　将
ＤＧＧＥ图谱上特异性条带切割下，用灭菌去离子水
清洗３次后，用钝吸头将胶块捣成碎屑，加入２０μＬ
ｄｄＨ２Ｏ，－８０℃冷冻１０ｍｉｎ，然后立即放在３７℃水浴
１０ｍｉｎ，反复冻融处理３次，以充分释放胶块中的
ＤＮＡ．再以含有目标ＤＮＡ片段溶液为模板，使用
不带ＧＣ夹子的第２轮ＰＣＲ引物进行扩增，扩增体
系和程序不变．ＰＣＲ扩增产物进行克隆测序，测序
结果在美国生物技术研究中心（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮＣＢＩ）数据库中进行ＢＬＡＳＴ比对，
在ＧｅｎＢａｎｋ中寻找同源性最大的序列，采用Ｎｅｉｇｈ－
ｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ法构建系统发育树
［１３］．
３　结果与分析
３．１　细菌ＤＧＧＥ图谱分析
ＤＧＧＥ图谱直观显示了镍矿区紫茎泽兰根际
与各组织样品细菌多样性的差异（图１）．由图可
见，每个样品（３次重复）都呈现出一定数量的条
带，细菌种群显示出一定的丰富度；各个泳道存
在一些共有条带，可见紫茎泽兰根际土及各器官
存在某些相同的细菌类群．对比不同供试样品，
其中根际土电泳条带数目最多，且条带亮度最高；
各器官电泳条带差异较小，其中叶的条带数目最
多．对泳道条带灰度值比较发现，上部灰度值高，
说明样品的优势群落迁移率低，其ＧＣ含量低．
图１　紫茎泽兰根际及内生细菌ＤＧＧＥ指纹图谱
Ｆｉｇ．１　ＤＧＧＥ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｓｏｉｌ　ａｎｄ　ｅｎｔｏ－
ｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｏｆ　Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ　ａｄｅｎｏｐｈｏｒｕｍ
３．２　ＤＧＧＥ条带多样性指数、丰度和均匀度分析
根据ＤＧＧＥ图谱不同条带强度及迁移率，计
算紫茎泽兰根际与内生细菌多样性的相关指标（表
２），其根际与不同器官内生细菌香农－威纳指数、
丰度及均匀度都存在差异，皆表现为根际土＞叶
＞茎＞根．通过方差分析比较，根际土、叶及茎的
香农－威纳指数和丰度显著大于根 （Ｐ＜０．０５）；紫
茎泽兰根际土与各器官之间均匀度差异不显著．
表２　供试样品ＤＧＧＥ条带多样性指数、丰度和均匀度
Ｔａｂ．２　Ｓｈａｎｎｏｎ－ｗｉｅｎｅｒ　ｉｎｄｅｘ（Ｈ），Ｒｉｃｈｎｅｓｓ（Ｓ）ａｎｄ　Ｅｖｅｎｎｅｓｓ（ＥＨ）ｏｆ　ｔｅｓｔｅｄ　ｓａｍｐｌｅｓ
样品Ｓａｍｐｌｅｓ 香农－威纳指数Ｓｈａｎｎｏｎ－ｗｉｅｎｅｒ　ｉｎｄｅｘ 丰度Ｒｉｃｈｎｅｓｓ 均匀度Ｅｖｅｎｎｅｓｓ
根际土Ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　Ｓｏｉｌ　 ２．７６±０．１１ａ １６．００±１．７３ａ ０．９９７±０．０００ａ
根Ｒｏｏｔ　 ２．３３±０．２４ｂ　 １０．６７±２．８９ｂ　 ０．９９４±０．００５ａ
茎Ｓｔｅｍ　 ２．５８±０．０８ａ １３．３３±１．１５ａ ０．９９５±０．００４ａ
叶Ｌｅａｆ　 ２．６４±０．２１ａ １４．３３±３．２１ａ ０．９９６±０．００２ａ
　　同一列中相同字母代表无显著性差异，数据为三次重复的平均值
Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｌｅｔｔｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＝０．０５）ｂｙ　ＬＳＤ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｒａｎｇｅ　ｔｅｓｔ．Ｖａｌｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｎｓ±ＳＤ（ｎ＝３）
９８３１
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５２卷
３．３　重金属含量与细菌多样性的相关性分析
对供试样品重金属浓度与多样性指数、丰度和
均匀度进行相关性分析（表３）表明，Ｎｉ、Ｚｎ、Ｐｂ、
Ｃｄ、Ｃｒ、Ａｓ相互之间呈极显著正相关关系，相关系
数大于０．９５，可见这些重金属元素的浓度及其之
间的比率具有相对的稳定性，元素之间容易形成
化合物积累于矿区中；样品丰度（Ｓ）与Ｚｎ含量呈
显著正相关关系，相关系数为０．５７７，表明Ｚｎ含
量对细菌多样性影响较大．
表３　供试样品重金属浓度与细菌多样性的相关系数
Ｔａｂ．３　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　ｈｅａｖｙ　ｍｅｔａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｔｅｓｔｅｄ　ｓａｍｐｌｅｓ
Ｃｕ　 Ｚｎ　 Ｐｂ　 Ｃｄ　 Ｃｒ　 Ａｓ　 Ｎｉ　 Ｈ　 Ｓ　 Ｅｈ
Ｃｕ　 １．０００ ．
Ｚｎ　 ０．４０５　 １．０００ ．
Ｐｂ　 ０．２２１　 ０．９７８＊＊ １．０００ ．
Ｃｄ　 ０．３２５　 ０．９８８＊＊ ０．９９２＊＊ １．０００
Ｃｒ　 ０．１２８　 ０．９５７＊＊ ０．９９５＊＊ ０．９７５＊＊ １．０００ ．
Ａｓ　 ０．２０２　 ０．９７１＊＊ ０．９９９＊＊ ０．９９０＊＊ ０．９９５＊＊ １．０００
Ｎｉ　 ０．１３５　 ０．９５８＊＊ ０．９９６＊＊ ０．９７７＊＊ １．０００＊＊ ０．９９６＊＊ １．０００
Ｈ　 ０．２７５　 ０．５７５　 ０．５１０　 ０．５０９　 ０．５０５　 ０．４８４　 ０．４９９　 １．０００
Ｓ　 ０．２８３　 ０．５７７＊ ０．５１２　 ０．５１４　 ０．５０７　 ０．４９０　 ０．５０３　 ０．９９２＊＊ １．０００
Ｅｈ　 ０．１９８　 ０．２８８　 ０．２６０　 ０．２３２　 ０．２５３　 ０．２４６　 ０．２５１ －０．２１７ －０．２３３　 １．０００
　　“＊＊”表示相关性在０．０１水平上显著，“＊”表示相关性在０．０５水平上显著．
“＊＊”Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｉｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ａｔ　ｔｈｅ　０．０１ｌｅｖｅｌ（２－ｔａｉｌｅｄ）．“＊”Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｉｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ａｔ　ｔｈｅ　０．０５ｌｅｖｅｌ（２－ｔａｉｌｅｄ）．
３．４　细菌ＤＧＧＥ多样性与重金属含量的典型对
应分析
典型对应分析中，重金属对紫茎泽兰根际及
内生细菌多样性的影响如图２．前２个排序轴所能
解释的相关变量分别为９９．８％和０．１７％．样品朝
一个方向排开，主要重金属都在第３象限，可见根
际土壤细菌多样性受Ｚｎ、Ｃｄ、Ｐｂ、Ｎｉ等多种重金属
负向影响，但影响程度差异不大．并且紫茎泽兰
叶组织细菌多样性受Ｃｕ含量负向影响，其叶组织
中Ｃｕ含量越低，其内生细菌越丰富．
３．５　克隆条带分析
根据细菌ＤＧＧＥ图谱，选取优势较高与特异
性较强条带进行测序，成功克隆１６个条带的基
因．通过Ｇｅｎｂａｎｋ数据库中Ｂｌａｓｔ比对，选取与目
标同源性最大的１６ＳｒＲＮＡ序列作为参比序列共
同构建系统发育树（图３）．由系统发育树可见，大
部分序列隶属于变形菌门 （Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、异常
球菌－栖热菌门（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ－Ｔｈｅｒｍｕｓ）、芽单胞菌
门（Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ）以 及 放 线 菌 门 （Ａｃｔｉ－
ｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）．其中３条序列与未培养细菌的序列
具有高度相似性，说明镍矿区紫茎泽兰根际及内
生细菌较为丰富，存在一部分不可培养的细菌类
群．整个发育树可分为两簇，簇Ⅰ包含１０个克隆
条带，簇Ⅱ包含６个克隆条带．簇Ⅰ又可分为三个
亚簇，均属于变形菌门，说明变形菌是优势细菌
类群．簇Ⅱ可分为两个亚簇三个小簇，Ｌ２－２与Ｌ１－
２属于异常球菌－栖热菌门；Ｌ２－３属于芽单胞菌
门；Ｔ３－２、Ｓ３－１与Ｒ２－１属于放线菌门．该系统发
育树表明本研究的镍矿区紫茎泽兰根际及内生细
菌具有丰富的多样性．
图２　紫茎泽兰根际及内生细菌ＤＧＧＥ多样性与重
金属含量的典型对应分析
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｔｙｐｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＤＧＧＥ　ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｂｅ－
ｔｗｅｅｎ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ａｎｄ　ｅｎｔｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｏｆ
Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ　ａｄｅｎｏｐｈｏｒｕｍ　ａｎｄ　ｈｅａｖｙ　ｍｅｔａｌ
ｃｏｎｔｅｎｔ
０９３１
第６期 　　 陈诚，等：镍矿区紫茎泽兰根际及内生细菌多样性研究 　
图３　ＤＧＧＥ条带细菌１６ＳｒＲＮＡ基因系统发育树
Ｆｉｇ．３　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　１６ＳｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｆｒｏｍ　ＤＧＧＥ　ｂａｎｄｓ
４　讨　论
紫茎泽兰能在富含重金属的镍矿土壤中正常
生长、定居并成为优势植株，却未因重金属而表现
出被毒害的状态．本研究中，重金属Ｚｎ的含量对
紫茎泽兰根际及内生细菌多样性影响较大，达到
了显著水平．同时，典型对应分析中，根际细菌的
多样性受Ｚｎ、Ｃｄ、Ｐｂ等多种重金属负向影响．相
关研究表明，重金属元素之间通过协同作用对植
物和微生物产生影响［１４］，紫茎泽兰对Ｃｄ、Ｚｎ、Ｐｂ
等重金属具有较强的耐性和富集特性，且对其具
有较强的迁移能力［１５，１６］．本研究中，镍矿区紫茎
泽兰根际及内生细菌多样性与对Ｚｎ和Ｃｄ浓度关
系紧密，二者呈负相关充分反映微生物对该重金
属有一定解毒能力．有对于矿区植物内生细菌的
研究表明，内生细菌能够减少植物对 Ｎｉ和Ｃｄ的
吸收量，促进重金属向植物茎叶的转移，提高植
物茎叶中的重金属含量［１７］．该研究结果可为进一
步探究重金属地区微生物与重金属作用机制提供
相关参考．
本试验选用镍矿区正常生长的紫茎泽兰及其
根际土壤进行研究，没有进行人为干预，能够真
实反应自然条件下微生物状况．试验中直接抽提
紫茎泽兰根际及内生细菌的总ＤＮＡ，避免了培养
过程中的筛选和富集作用，对全面掌握污染环境
中细菌群落具有重要意义．克隆结果表明，紫茎
泽兰根际及内生细菌属于４个细菌门，显示出一
定的细菌多样性．对于矿区植物内生细菌的研究，
内生细菌多样性丰富，包括变形菌门（如假单胞
菌、杆菌和伯克氏菌）、放线菌门、硬壁菌门等［１８］．
１９３１
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５２卷
所有克隆序列中，变形菌门为优势种群，占到
４３．８％，有对紫茎泽兰根际细菌的研究发现，变
形菌为优势种群，这与本研究结果一致［１９］．另外，
放线菌占到克隆条带１８．８％，仅次于变形菌，为
紫茎泽兰根际及内生细菌的重要组成部分．放线
菌与变形菌同为优势种群，且可产生许多重要的
抗生素［２０］，这可能是紫茎泽兰不受土传病害，能
在重金属地区正常生长的重要因素之一．
综上所述，镍矿区紫茎泽兰根际及内生细菌
存在丰富的多样性，且相互间存在差异．同时重
金属含量在一定程度上影响着细菌群落，可为深
入研究重金属与微生物多样性关系提供理论参考．
参考文献：
［１］　 Ｄａｉ　Ｈ　Ｙ，Ｈｕａ　Ｊ　Ｓ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｋｉｌｉｎｇ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ
Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｎ　Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ
ａｄｅｎｏｐｈｏｒｕｍ［Ｊ］．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　＆Ｔｅｃｈｎｏｌ－
ｏｇｙ，２０１４，１５（１）：７９．
［２］　 戴莲，李会娜，蒋智林，等．外来植物紫茎泽兰入
侵对根际土壤有益功能细菌群、酶活性和肥力的影
响［Ｊ］．生态环境学报，２０１２，２１（２）：２３７．
［３］　 Ｌｉｕ　Ｗａｎ－ｘｕｅ，ＮＩＵ　Ｈｏｎｇ－ｂａｎｇ，ＷＡＮ　Ｆａｎｇ－ｈａｏ，ｅｔ
ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｌｅａｃｈａｔｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｖａｓｉｖｅ　ｐｌａｎｔ，Ａｇｅｒ－
ａｔｉｎａ　ａｄｅｎｏｐｈｏｒａ（Ｓｐｒｅｎｇｅｌ）ｏｎ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍ－
ｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｅｃｏｌｏｇｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ，２０１０，３０（４）：
１９６．
［４］　 Ｓｉｃｉｌｉａｎｏ　Ｓ　Ｄ，Ｆｏｒｔｉｎ　Ｎ，Ｍｉｈｏｃ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｂｙ　ｐｌａｎｔｓ　ｉｎ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｓｏｉｌ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎ－
ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，６７（６）：２４６９．
［５］　 Ｌｏｄｅｗｙｃｋｘ　Ｃ，Ｔａｇｈａｖｉ　Ｓ，Ｍｅｒｇｅａｙ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ
ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｅａｖｙ　ｍｅｔａｌ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｅｎｄｏ－
ｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｏｎ　ｈｅａｖｙ　ｍｅｔａｌ　ｕｐ－ｔａｋｅ　ｂｙ　ｔｈｅｉｒ　ｈｏｓｔ
ｐｌａｎｔ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｍｅｄｉ－
ａｔｉｏｎ，２００１，３（２）：１７３．
［６］　 Ｓｍａｌａ　Ｋ，Ｗｉｅｌａｎｄ　Ｇ，Ｂｕｃｈｎｅｒ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｕｌｋ　ａｎｄ
ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｓｏｉｌ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ
ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ｐｌａｎｔ－ｄｅ－
ｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｓｅａｓｏｎａｌ　ｓｈｉｆｔｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ
［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅ－ｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
２００１，６７（１０）：４７４２．
［７］　 土壤环境质量标准 ［Ｓ］．中华人民共和国行业标准
（ＧＢ１５６１８－１９９５），１９９５．
［８］　张海燕，王彩虹，龚明福，等．一种简单有效且适于
土壤微生物多样性分析的ＤＮＡ提取方法 ［Ｊ］．生物
技术通报，２００９，８：１５１．
［９］　Ｍｉｔａｌｉ　Ｄａｓ，Ｔｏｄｄ　Ｖ．Ｒｏｙｅｒ，ｅｔ　ａｌ．Ｌｅｆｆ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ
Ｆｕｎｇｉ，Ｂａｃｔｅｒｉａ，ａｎｄ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ　ｏｎ　Ｌｅａｖｅｓ　Ｄｅ－
ｃｏｍｐｏｓ－ｉｎｇ　ｉｎ　ａ　Ｓｔｒｅａｍ ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎ－
ｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，７３（３）：７５６．
［１０］　张波，李小林，张小平，等．花苜蓿内生放线菌多
样性及群落结 ［Ｊ］．草业学报，２０１３，２２（５）：１１３．
［１１］　Ｓａｉｋａｌｙ　Ｐ　Ｅ，Ｓｔｒｏｏｔ　Ｐ　Ｇ，Ｏｅｒｔｈｅｒ　Ｄ　Ｂ．Ｕｓｅ　ｏｆ　１６Ｓ
ｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｔｏ
ａｓｓｅｓｓ　ｔｈｅ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　ｓｏｌｉｄｓ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｂａｃ－
ｔｅｒｉａｌ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｓｌｕｄｇｅ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，７１（１０）：５８１４．
［１２］　Ｆｏｕｒａｎｓ　Ａ，ｄｅ　Ｏｔｅｙｚａ　Ｔ　Ｇ，Ｗｉｅｌａｎｄ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　ａ
ｈｙｐｅｒｓａｌｉｎｅ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｍａｔ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ（Ｓａｌｉｎｓ－ｄｅ－Ｇｉ－
ｒａｕｄ，Ｃａｍａｒｇｕｅ，Ｆｒａｎｃｅ）［Ｊ］．ｆｅｍｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｅｃｏｌ，
２００４，５１：５５．
［１３］　Ｔａｍｕｒａ　Ｋ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　Ｄ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．
ＭＥＧＡ５：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｕ－
ｓｉｎｇ　ｍａｘｉｍｕｍ　ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｄｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ
ｍａｘｉｍｕｍ　ｐａｒｓｉｍｏｎｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ－
ｇｙ　ａｎｄ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２０１１，２８（１０）：２７３１．
［１４］　任广明．铅锌矿区污染对土壤细菌群落结构的影响
及优势细菌吸附性能的研究 ［Ｄ］．东北农业大学，
２００９．
［１５］　汪文云，张朝辉．贵州水银铜金矿紫茎泽兰重金属
元素测定与分析 ［Ｊ］．植物研究，２００８，２（１）：７６０．
［１６］　赵小英．紫茎泽兰在Ｃｄ、Ｚｎ、Ｐｂ和Ｃｕ胁迫下的耐
性和富集特性研究 ［Ｄ］．四川农业大学，２０１３．
［１７］　Ｍａｄｈａｉｙａｎ　Ｍ，Ｐｏｏｎｇｕｚｈａｌｉｓ　Ｓ，Ｔｏｎｇｍｉｎ　Ｓ．Ｍｅｔａｌ
ｔｏｌｅｒａｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｒｅｄｕｃｅｓ　ｎｉｃｋｅｌ　ａｎｄ
ｃａｄｍｉｕｍ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｏ－
ｍａｔｏ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ　Ｌ．）［Ｊ］．Ｃｈｅｍｏ－
ｓｐｈｅｒｅ，２００７，６９（２）：２２０．
［１８］　朱雪竹，倪雪，高彦征．植物内生细菌在植物修复
重金属污染土壤中的应用 ［Ｊ］．生态学杂志，２０１０，
２９（１０）：２０３５．
［１９］　牛红榜，刘万学，方万浩，等．紫茎泽兰根际土壤
中优势细菌的筛选鉴定及拮抗性能评价 ［Ｊ］．应用生
态学报，２００７，１８（１２）：２７９５．
［２０］　Ｚｈａｏ　Ｋ，Ｐｅｎｔｔｉｎｅｎ　Ｐ，Ｇｕａｎ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ａｎｄ　ａｎｔｉ－ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ－
ｔｅｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　ｐｌａｎｔｓ　ｉｎ　Ｐａｎｘｉ　ｐｌａｔｅａｕ，
Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，６２（１）：
１８２．
２９３１