全 文 ：RT-PCR法克隆拟南芥中NPR1基因及其
植物表达载体的构建
收稿日期:2006-03-29
基金项目:黑龙江省自然科学基金(C2004-01);黑龙江省研究生
创新科研专项基金(YJSCX2005-200HLP)
作者简介:刘永光(1982-),男,山东人,硕士,主要从事园林
植物分子生物学研究。
*通讯作者E-mail:daidiche@yahoo.com.cn
刘永光,车代弟*,王金刚,龚束芳,樊金萍
(东北农业大学园艺学院,哈尔滨 150030)
摘 要:园林植物多进行保护地栽培,高温高湿的局部小气候使园林植物更容易感染多种病害,一旦染病则
极大地影响园林植物的观赏价值,造成较大的经济损失。文章采用 RT-PCR扩增的方法从拟南芥基因组中克隆到
能够介导植物广谱抗病的NPR1基因,并将其构建植物表达载体,为下一步的转化园林植物工作打下基础。
关键词:NPR1基因;广谱抗病;载体构建
中图分类号:Q786 文献标识码:A
长期以来,病菌侵染对农业生产造成的各
种损失是非常巨大的。改进栽培措施和施用化
学杀菌剂不能从根本上解决问题,而化学药剂
所带来的环境污染和病原抗药性生理小种的形
成等问题又给病害防治带来了更大的障碍。采
用抗病品种被认为是最为有效的防治方法,但
常规育种很难在短期内育成具有较高抗性,尤
其是多基因联合水平抗性的优良品种。通过基
因工程将抗病基因转入异源植物具有高效、快
速的优点。然而,利用单一抗病基因或无毒基
因很难获得对多种病原的持久性的广谱抗性。
园林植物多进行保护地栽培,高温高湿的局部
小气候使园林植物更容易感染多种病害,而一
旦染病则极大地影响园林植物的观赏价值,造
成较大的经济损失。
拟南芥(Arabidopsisthaliana)中的 NPR1(Non-
expressorofpathogenesis-relatedgenes1)基因是植
物病程相关基因非表达子。NPR1基因在植物中的
过量表达可使植物的内源水杨酸得到高水平表达,
从而能够诱发过敏性反应(Hypersensitiveresponse,
HR)和系统获得抗病性(Systemicacquiredresist-
ance,SAR)的建立,从而达到广谱抗病的目的[1]。
本实验采用 RT-PCR扩增的方法从拟南芥基
因组中克隆到NPR1基因,并将其构建植物表达载
体,为将来转化到园林植物并获得广谱抗病的植株
和遗传材料打下基础。
1 材料和方法
1.1 材料
植物材料为本实验室所保存的拟南芥。Taq酶
为大连 Takara公司的 LATaq。T载体为购自于
Promege公司的 pGEM-Tvector。引物合成和序列
测序由上海生工公司完成。感受态细胞自己制备,
所用菌种为DH5α。
1.2 方法
1.2.1 引物设计
根据GenBank上所提供的NPR1基因的全序列
设计引物。引物由 Premier5和Oligo6.0两个引物
设计软件综合评价而成。上游引物:5′G↓
GATCCGGAACCTGTTGATGGA3′;下游引物:5′
GAGCT↓CGTCTCACCGACGACGATG3′。在上游引
物中加入了BamHI酶切位点,在下游引物中加入
了SacI酶切位点。
1.2.2 拟南芥基因组RNA的提取
采用 Invitrigen公司的 TrizolReagent提取拟南
芥总RNA,方法参照文献[2-3],并加以改良。
1.2.3 RT-PCR扩增
以水代替植物 RNA作为负对照,拟南芥总
RNA为模板,选用 Takara公司的 BcaBESTTM RNA
第38卷 第4期 东 北 农 业 大 学 学 报 38(4):491~494
2007年 8月 JournalofNortheastAgriculturalUniversity August2007
文章编号 1005-9369(2007)04-0491-04
PCR Kit Ver.1.1反转录试剂盒,进行 mRNA的反
转录反应以合成 cDNA,再以 cDNA为模板进行
PCR扩增出目的基因。PCR扩增的反应条件为:
94℃3 min;94℃30 s,52.6℃45 s,72℃1.5
min(34个循环) ;72℃10 min,4℃终止。
1.2.4 NPR1基因的回收、连接及测序
将目的条带在紫外透射仪下切下,采用Takara
的胶回收试剂盒,按照操作步骤进行胶回收,然后
与 pGEM-T载体连接。将连接好的载体转化大肠
杆菌 DH5α感受态细胞,在含有 X-gal和 IPTG的
LB+Amp选择抗性平板上筛选白色菌落。对重组子
进行PCR鉴定和酶切鉴定,选择鉴定结果正确的
送上海生工公司测序。
1.2.5 NPR1基因表达载体的构建
将NPR1基因与pGEM-T载体连接所得到的载
体命名为 pGEM-NPR1;将 pGEM-NPR1载体和已
经构建好的 p35ST-nos载体进行 BamH I和 SacⅠ
双酶切,回收含有NPR1的片断和p35ST-nos载体
片断,用 T4 DNA Ligase连接得到最后目的载体
P35ST-NPR1。
2 结果与分析
2.1基因的RT-PCR扩增
测序结果显示所克隆基因全长 1 782 bp,用
DNAman软件对测序结果和NCBI所公布的序列进
行比对可知,所克隆基因与 NCBI所公布的序列
100%同源。所克隆基因含有起始密码子 ATG和终
止密码子TGA,是完整的NPR1基因(见图1)。
2.2 NPR1基因的载体构建
通过一系列中间载体的酶切和连接,我们将
NPR1基因成功构建入含有NPTⅡ选择标记基因,并
带有 CaMV35S组成型启动子和 T-nos终止子的
p35T植物表达载体中。P35ST-NPR1载体可以用于
农杆菌介导的双子叶植物遗传转化,可以培育组成
型表达NPR1基因的转基因园林植物(见图2)。
2.3所构建P35ST-NPR1载体的酶切检测
对p35ST-NPR1载体用BamHⅠ/SacⅠ进行双酶
切,得到两个片段,一个为载体,一个为目的基因;
用BamHⅠ进行单酶切,得到一条带,为线形的载
体;用基因内部和载体上都存在的XbaⅠ对载体进行
单酶双切,所得目的片段大小正确;以所构建的载体
为模板进行PCR扩增,可以很好地得到目的基因。
综上所述,p35ST-NPR1载体构建正确(见图3)。
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M1 1 2 3 4 M2
M1-λDNA/EcoRI+HindⅢMarker;M2-DL2000Marker;1-BamHⅠ/SacⅠ双
酶切;2-BamHⅠ单酶切;3-XbaⅠ单酶切;4-以质粒为模板的PCR扩增
M1-λDNA/EcoRI+HindⅢMarker;M2-DL2000Marker;1-BamHⅠ/
SacⅠtwoenzymesdigestion;2-BamHⅠenzymedigestion;3-XbaⅠ
enzymedigestion;4-PCRamplification
图 3 载体的酶切鉴定
Fig. 3 Identification of vector by enzyme digestion
图 1 NPR1基因的RT-PCR扩增
Fig. 1 RT-PCR amplification of NPR1 gene
M-DL2000;1-用OligodT引物反转录后扩增;
2-用随机引物反转录后扩增;3-空白对照
M-DL2000 Marker;1-Amplification with OligodTprimer;
2-Amplification with randomprimer;3-CK
图 2 所构建植物表达载体p35ST-NPR1
Fig. 2 The p35ST-NPR1 plant expressing vector
LacZalpha
RB
pVS1 sta
NheⅠ(3008)
pVS1 rep
pBR322 bom
pBR322 ori
HindⅢ
SacⅡ(5933)
XhoⅠ(6451)
KpnⅠ(6495)
SacⅡ(6575)
SalⅠ(6704)
XhoⅠ(7015)
CaMV35Spromoter
EcoRⅠ(8045)
SacⅠ
T-nos
BamHⅠ
XbaⅠ
CaMV35Spromoter
p35ST-NPR1
NPR1
12 322 bp
Kan
LB
ppt
·492· 东 北 农 业 大 学 学 报 第38卷
3 讨 论
最早在1994年,Cao等[4]利用模式植物拟南芥
分析植物系统获得抗性的传导途径时得到一个拟南
芥NPR1突变体。此突变株在用高水平外源水杨酸
(Salicylicacid,SA)处理时,并不能像野生型拟南
芥一样诱导病程相关基因(Pathogenesis-related,
PR)的表达,也不能产生 SAR。Dong[5]的研究小组
做了类似的试验,并且通过图位克隆(Map-based
strategy)的方式克隆到了 NPR1基因。当把野生型
NPR1基因导入到拟南芥NPR1缺失突变体中去后,
拟南芥 NPR1突变体的 SA诱导活性得到恢复,
SAR得以重新建立[6]。
水杨酸作为植物抗病反应的重要信号分子,涉
及并参与植物的过敏性反应和系统获得抗病性建
立,在植物的 HR和 SAR信号传导的抗病反应中
起着关键的作用。Yu[7]提出并证明了 SA参与植物
SAR抗病的假说。在不同植物 SAR诱导和建立可
能存在二种不同分子机制:一个是烟草和拟南芥等
植物存在着有效的SA信号感知和信号传导机制或
途径,但缺乏高水平的内源 SA。在病原菌感染后
SA生物合成被诱导或激活,SA水平急剧上升,从
而激活信号传导途径。相反,马铃薯、水稻、西红
柿、大麦和大豆等植物存在着高水平的内源 SA,
但缺乏有效的 SA信号感知和信号传导机制或途
径,病原菌感染可能激活其SA信号感知和信号传
导,从而诱导 SAR建立。NPR1基因就是后者 SA
信号感知和信号途径的关键结点。
近几年逐渐阐明,TGA转录因子和NPR1相互
协作来调节 PR基因的表达和抗病基因的起始。
NPR1与TGA转录因子相互作用共同协调对防卫反
应基因的表达和抗性的调控[8]。Despres等[9]实验证
明TGA2转录因子是NPR1正常表达所必需的,在
整个过程中,TGA家族中的TGA2转录因子起到了
非常重要的作用。
关于 NPR1在植物体抗病反应中起到什么功
能,以及将NPR1基因导入各种植物获得具有广谱
抗性的转基因植株是这几年来的研究热点。Cao[4]第
一次得到拟南芥NPR1突变体。RNA点杂交表明,
水稻抗病性的提高需要NPR1基因的高表达,首次
证明 NPR1基因可以提高单子叶植物的抗病性[10]。
胡凤仙[11]将构建好的含有NPR1基因的植物表达载
体通过根癌农杆菌介导的方式导入到烟草中去,并
且证明NPR1基因能够稳定遗传。Lin等[12]将NPR1
基因导入到番茄中去,并且用多种真菌和细菌对转
基因植株进行侵染,证明NPR1介导对病原菌的广
谱抗性[12]。鉴于NPR1基因在各种转基因植物中只
是过量表达从而提高了植物的抗病性,而无其它显
著有害影响这一性状,NPR1基因作为植物广谱抗
性基因愈来愈受到人们的关注。
拟南芥 NPR1基因最早从模式植物拟南芥中
得到。在花椰菜、甘蓝、烟草、番茄、马铃薯、
小麦、玉米等中存在其同源基因,在烟草和番茄
中分离到其cDNA克隆,而且水杨酸介导的系统
获得性抗性是植物中普遍存在的抗病途径。如前
所述,NPR1是植物抗病的关键调节基因,因此
NPR1介导的抗性途径可能是多种植物共同保守的
途径。因此可以设想,通过遗传工程将 NPR1基
因应用于植物保护,使植物避免多种病害的发生
应有光明的前景。
[ 参 考 文 献 ]
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刘永光等:RT-PCR法克隆拟南芥中NPR1基因及其植物表达载体的构建 ·493·第4期
AmplifiedbyRT-PCRandplantexpressingvector
constructionoftheArabidopsisthaliana
NPR1disease-resistancegene
LIUYongguang,CHEDaidi,WANGJingang,GONGShufang,FANJinping
(ColegeofHorticulture,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)
Abstract:Thehorticulturalplantsusualyarecultivatedinthegreenroomwhereiseasytocausemany
bacterialandfungaldiseases.Oncetheywereinfectedbyalkindsofdiseases,thehorticulturalplantsvalueof
viewandadmirewasseriouslyafectedandtheeconomyvaluewasseriouslyreduced.Intheexperiment,NPR1
genewhichcansignificantlyenhancetheresistanceforbroadrangeofpathogensfromtheArabidopsisthaliana
genomewasamplifiedbyRT-PCRandtheplantexpressionvectorcontainingNPR1genewasconstructed.It
providesanavenuefortransgenicbreedingofhorticulturalplants.
Keywords:NPR1gene;disease-resistanceforbroadrangeofpathogens;constructionofplantexpression
vector
proteinenhancestheDNAbindingactivityofasubgroupofthe
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·494· 东 北 农 业 大 学 学 报 第38卷