全 文 ：123※基础研究 食品科学 2009, Vol. 30, No. 21
不同分子量铁皮石斛多糖体外抗氧化活性研究
鲍素华，查学强，郝 杰，罗建平 *
(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)
摘 要：采用分步醇沉法对铁皮石斛总多糖(DSP)进行分离，得到乙醇终浓度为40%(DSP3)、70%(DSP2)和90%(DSP1)
的多糖。进一步对 4种铁皮石斛多糖的抗氧化活性进行测定，结果显示：DSP1对 DPPH·的清除作用、总抗氧
化能力、抑制H2O2诱导红细胞氧化溶血和抑制 Fe2+-VC诱导的小鼠肝匀浆脂质过氧化作用效果最佳，DSP和DSP3
次之，DSP2相对较弱；对·OH的清除率大小依次为 DSP＞DSP3＞DSP1＞DSP2；且不同相对分子质量的铁皮
石斛多糖均可显著抑制羟基自由基介导的DNA氧化断裂。结果提示：不同相对分子质量铁皮石斛多糖均有抗氧化
作用，且抗氧化能力与其相对分子质量大小有关。
关键词：铁皮石斛；多糖；自由基；抗氧化；相对分子质量
in vitro Antioxidant Activity of Polysaccharides with Different Molecular Weights from Dendrobium candidum
BAO Su-hua，ZHA Xue-qiang，HAO Jie，LUO Jian-ping*
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)
Abstract ：Crude polysaccharide from Dendrobium candidum (DSP) was successively fractionated with different concentration
ethanol and three polysaccharides named DSP1, DSP2 and DSP3 were obtained at the concentrations of 90%, 70% and 40%,
respectively. Subsequently, DSP and its three fractions were tested for antioxidant activity in vitro. Results showed that DSP1
had the strongest DPPH radical scavenging activity, total antioxidant activity, inhibition against Fe2+-VC-induced lipid peroxidation
and inhibition against erythrocyte hemolysis induced by H2O2, DSP and DSP3 took the second place and DSP2. had the weakest
biological activities. The hydroxyl radical scavenging capacity of these test samples followed the order of DSP > DSP3 > DSP1
> DSP2. In addition, all fractions of Dendrobium candidum polysaccharides showed potential for protecting against DNA damage
mediated by hydroxyl radicals. These results suggested that polysaccharides from Dendrobium candidum had antioxidant
potential, which might be closely associated with their molecule weight.
Key words：Dendrobium candidum；polysaccharide；free radical；antioxidant；relative molecular weight
中图分类号：Q539 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)21-0123-05
收稿日期：2008-11-26
基金项目：国家自然科学基金项目(20872024)；国际科学基金项目(F/4577-1)；
高等学校省级优秀青年人才基金项目(2009SQRZ016ZD)
作者简介：鲍素华(1982－)，女，硕士研究生，研究方向为生物资源的综合利用。E-mail：zhaxueqiang@163.com
*通讯作者：罗建平(1966－)，男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：jianpingluo1966@yahoo.com.cn
自由基(free radical)是一类含有未配对电子的基团、
分子或原子，主要包括超氧阴离子、羟自由基等，是
人体内的代谢产物，在正常情况下，处于动态平衡，
且浓度很低。当这一平衡被打破，就会对机体造成损害、
引发一系列疾病，目前已发现有 100余种此类疾病[1]。多
糖(polysaccharide)是一类存在于植物、动物和微生物中
的主要的天然活性物质，具有调节机体免疫力[2]、抗肿
瘤[3 ]、抗氧化[4 ]等药理作用，且不同来源多糖表现出不
同的生物学活性。迄今为止，人们已成功地从百种植
物中提取了多糖，并广泛用于医药和保健食品中的研究
和开发中。抗氧化是多糖的重要应用领域之一，与其
他外源性抗氧化剂相比，抗氧化多糖具有低毒、安全
和来源广等特点[5-7]。
铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall. ex Lindl)是兰
科石斛属植物，为《中华人民共和国药典》中收载的
名贵中草药之一，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止
咳的功效[ 8 ]。现代药理研究表明它具有提高机体免疫
力、抗肿瘤和防治白内障等功能[9]。药理学和植物化学
成分分析表明铁皮石斛中主要的生物活性物质是多糖类
化合物，且含量较高。近年来，石斛多糖的研究逐渐
引起人们的重视，有报道，多糖的生物活性与其相对
分子质量的大小有关[10]，因此本实验通过考察相对分子
2009, Vol. 30, No. 21 食品科学 ※基础研究124
质量不同的铁皮石斛多糖与其抗氧化活性的关系，以期
为进一步探讨铁皮石斛多糖的药理作用机理奠定基础，
也为铁皮石斛多糖在天然保健产品领域的开发利用提供
科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
铁皮石斛采自云南思茅山区云南思茅山区，并按照
文献[11]方法进行繁殖；雄性昆明种小白鼠，体重(21±
2 ) g，购于安徽医科大学。
质粒 pBR322DNA 宝生物工程(大连)有限公司；
ABTS(2,2-联氨 -双(3-乙基苯并噻唑啉 -6-磺酸)二胺盐)
AM公司；溴化乙锭、DPPH(1,1-二苯基 -2-苦基肼)、
ferrozine(菲啰嗪二钠盐) Sigma公司；其他试剂均为国
产分析纯。
V-1100型分光光度计；BC-R501型旋转蒸发器；
SHZ-D循环水式真空泵；BT1-200恒流泵；SBS-100
数控计滴自动部份收集器；LGJ-18S原位冷冻干燥机；
DYY-10型(ECP3000)三恒电泳仪；LRH-2500-G光照培
养箱。
1.2 铁皮石斛总多糖及分离多糖的制备和相对分子质量
的测定
将繁殖 60 d 后的铁皮石斛苗洗净，烘干粉碎，水
提醇沉，TCA 脱蛋白，离心，沉淀真空干燥后得铁皮
石斛粗多糖(DSP)。将一定体积铁皮石斛粗多糖加无水
乙醇调醇浓度为 40 %，收集沉淀，再将上清液调节醇
浓度为 70% ，收集沉淀，最后将上清液调节醇浓度为
90%。分别得 40%(DSP3)、70%(DSP2)、90%(DSP1)醇
沉多糖。将醇沉物冷冻干燥，备用。
铁皮石斛总多糖(DSP)及 DSP1、DSP2、DSP3四个
组分，分别经 Sephadex G-100凝胶柱层析测定各组分的
分子质量范围分别为1.57×104～15.7×104、 1.48×104、
3.53× 104～7.44× 104、11.51× 104～15.7× 104u。
1.3 体外实验方法
1.3.1 羟基自由基(·OH)清除能力的测定
以文献[12]方法为基础加以改进，样品组试管中加
入 1ml 0.15mmol/L FeSO4、0.4ml 2mmol/L水杨酸、0.2ml
不同浓度的多糖溶液、1ml 6mmol/L H2O2和 0.4ml 蒸馏
水；空白组用蒸馏水代替多糖溶液，对照组用蒸馏水代
替水杨酸。以上 3组试管放入水浴锅中 37℃恒温水浴 1h
后，取出冷却，用蒸馏水调零，测定 510nm处吸光度，
设 3 个平行，结果取平均值，吸光度越小，清除·O H
的效果越好。以抗坏血酸(VC)作阳性对照。用以下公式
计算多糖对·O H 的清除率。

A空白－(A样品－A对照)
·OH清除率(%)=—————————× 100

A空白
1.3.2 DPPH·清除能力的测定[13]
样品管中加入 0.5ml不同浓度的多糖溶液与 2.5ml的
0.004%溶于 95%乙醇的DPPH溶液；对照管用 95%乙
醇代替DPPH溶液；空白管用蒸馏水代替多糖溶液。以
上 3组置于 28℃水浴 30min后，用 0.5ml蒸馏水和 2.5ml
95%的乙醇调零，于 515nm处测定吸光度，设 3个平
行，结果取平均值。以抗坏血酸(V C)作阳性对照。用
以下公式计算多糖对 D PPH·清除率。

A空白－(A样品－A对照)
DPPH·清除率(%)= ————————× 100

A空白
1.3.3 ABTS法测总抗氧化能力的方法[14]
将 5ml 7mmol/L ABTS和 88μl 140mmol/L过硫酸钾
混合，在室温、避光的条件下静置过夜，形成 A B TS
自由基储备液。然后按 1:50(V/V)的比例用蒸馏水稀释
工作液，使其在 30℃、734nm波长下的吸光度为 0.7±
0.02。
样品管中加入200μl不同浓度的多糖样品液和3ml的
ABTS溶液；空白管用蒸馏水代替多糖溶液；对照管用
蒸馏水代替ABTS溶液。以上 3组在室温条件下避光放
置 1h后，于 734nm处测定其吸光度，设 3个平行，结
果取平均值。以抗坏血酸(VC)作阳性对照。按以下公式
计算：
　　
A空白－(A样品－A对照)
ABTS自由基清除率(%)=————————× 100
　　 A空白
1.3.4 Fe2+-VC诱导小鼠肝匀浆脂质过氧化的测定[15]
肝匀浆的制备：小鼠脱颈椎处死，迅速摘取肝组
织用冷生理盐水漂洗，滤纸吸干后称重，冰浴匀浆，
制成 10%的悬浮液，4000r/min离心 15min，上清液即
为肝组织匀浆液。
样品组：取上述肝组织匀浆 0.2m1，加入不同浓度
多糖溶液 0.2ml，0.5mmol/L FeSO4 50μl，0.5mmol/L VC
50μl；样品对照组：用 0.2m1生理盐水代替肝组织匀浆，
其他同样品组；空白组：用 0.1ml 生理盐水代替多糖溶
液，其他同样品组。以上 3组均在 37℃水浴温育 lh后，
加入 10%的 TCA 2ml，0.6%的 TBA 1ml摇匀，于沸
水浴中煮沸 15min迅速冷却后，3000r/min 离心 15min，
取上清液在 532nm下测吸光度。实验设 3个平行，结
果取平均值，以抗坏血酸(VC)作阳性对照。按以下公
式计算：
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A空白－(A样品－ A对照)
抑制率(%)= —————————× 100
　　 A空白
1.3.5 H2O2诱导红细胞氧化溶血的测定[16]
红细胞悬浮液的制备：小鼠禁食 12h 后眼眶取血，
肝素抗凝，4℃ 3000r/min离心得红细胞，冷生理盐水
洗 3 次，制成 0 .5 % 悬浮液。
分别取红细胞悬液 0.5ml(样品对照管用生理盐水代
替)，加入 0.2 ml不同浓度的多糖溶液 (空白管用蒸馏水
代替)，然后再加入 0.1ml的 50mmol/L H2O2启动反应，
37℃作用 1h，生理盐水稀释5倍，3000r/min离心10 min，
取上清液在 415nm下测吸光度，实验设 3个平行，结
果取平均值，以抗坏血酸(VC)作阳性对照。用以下公式
计算抑制率：
　　
A空白－(A样品－ A对照)
抑制率(%)= —————————× 100
　　 A空白
1.3.6 对羟自由基介导的DNA损伤保护作用的测定[17-18]
样品管中加入100ng的质粒pBR322 DNA和10μl不
同浓度的多糖溶液，于 37℃水浴 10min后，再加入溶于
20mmol/L pH7.4的磷酸钾缓冲液(PBS)中的 Fenton氧化剂
(100μmol/L的 FeSO4、100μmol/L的抗坏血酸、1mmol/L的
H2O2和 104μmol/L 的 EDTA)5μl，再用 PBS补足体积
至25μl；空白管用PBS代替多糖溶液；未损伤管加100ng
的 pBR322DNA，并用 PBS补充体积至 25μl；以上 3组
在 37℃水浴反应 1h后，放在冰块上 10min以终止反应。
反应产物经 1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染
色后于凝胶成像分析系统中观察照相。以抗坏血酸(VC)
作为阳性对照。
2 结果与分析
2.1 不同分子量多糖对·OH 清除活性的影响
图1 不同分子量铁皮石斛多糖对羟自由基的清除能力
Fig.1 Radical scavenging activities of polysaccharides with
different molecular weights from Dendrobium candidum against
hydroxyl radicals
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
DSP
DSP1
DSP2
DSP3
VC
清
除
率
(%
)
多糖浓度(mg/ml)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
有机体过氧化损伤的主要因素[19 ]。从图 1可以看出，4
种不同相对分子质量铁皮石斛多糖对羟基自由基均有不
同程度的清除作用，其清除能力随多糖浓度的增大而增
强，呈现显著的量效关系。在浓度为 2.4mg/ml时，DSP
和 DSP 3 显示较强的清除·OH 的能力，其清除率均达
到了 75.0%以上，是 DSP2(33.8%)的 2.3倍左右。说明
相对分子质量较大的铁皮石斛多糖有较强的清除·O H
作用。
2.2 不同分子量多糖对DPPH自由基清除活性的影响
DPPH自由基在有机溶剂中是一种稳定的自由基，
在 517nm处有吸收峰，呈紫色。当自由基清除剂存在
时，D P PH 的孤电子被配对，颜色变浅，在最大吸收
波长处吸光度变小，且颜色变化与配对电子数成化学计
量关系[ 2 0 ]。因此，可用来评价自由基的清除情况。结
果见图 2，D S P 1 的清除作用最强，其次为 D S P，而
DSP2、DSP3相对较弱，在浓度为 2mg/ml时DSP、DSP1、
DSP2、DSP3的清除率分别为 60.1%、85.3%、49.9%、
45.6%，可见 4种铁皮石斛多糖对 DPPH·的清除能力
差异较大，但均表现出了较强的清除能力，并且呈明
显的剂量依赖性关系。
图2 不同分子量铁皮石斛多糖对DPPH自由基的清除能力
Fig.2 Radical scavenging activities of polysaccharides with
different molecular weight from Dendrobium candidum against
DPPH
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
DSP
DSP1
DSP2
DSP3
VC
清
除
率
(%
)
多糖浓度(mg/ml)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
2.3 不同分子量多糖对ABTS法测总抗氧化能力的影响
羟自由基被认为是毒性最强的活性氧自由基，辐射
损伤等物理、化学因子都会促进其形成，是造成生物
图3 不同分子量铁皮石斛多糖总抗氧化能力的影响
Fig.3 Total antioxidant activities of polysaccharides with different
molecular weight from Dendrobium candidum
100
80
60
40
20
0
DSP
DSP1
DSP2
DSP3
VC清
除
率
(%
)
多糖浓度(mg/ml)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
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ABTS自由基 和DPPH自由基类似，均为稳定的有
机自由基，样品抗氧化能力越强，其提供电子的能力
也就越强，与该有机自由基反应量越大，反应速率也
越快，因此都可以通过测定反应液吸光度的变化，直
接反应出样品还原能力的大小[21]。从图 3可知， DSP1表
现出较高的清除能力，在浓度为 3mg/ml时，清除率达
85.6%，约是DSP(35.4%)的 2.4倍，DSP2(20.9%)的 4倍，
DSP3次之，为 65.1%，且 4种铁皮石斛多糖对ABTS的
清除能力与浓度呈线性相关，不同相对分子质量多糖之
间的清除率存在明显差异。
2.4 不同分子量多糖对 Fe2+-VC诱导小鼠肝组织匀浆脂
质过氧化的影响
生物体内的脂质过氧化主要发生在细胞膜上，由于
细胞膜的主要成分磷脂中含有多不饱和脂肪酸，最容易
发生脂质过氧化反应，而膜质的过氧化和细胞损伤的发
生，可引起人体衰老和心脏病、动脉粥样硬化、癌化、
炎症、糖尿病等严重疾病[22-23]。在 Fe2+-VC体系诱导小
鼠肝匀浆抑制脂质过氧化的研究中，石斛多糖均有明显
的抑制作用，且随着浓度的增大抑制作用增强(图 4)。在
浓度为 2mg/ml时 DSP1抑制作用达到了 65.0%，DSP、
DSP2的抑制能力无显著性差异，抑制率分别为 36.5%、
38.3%，DSP 3最小，只有 26.6%。
图4 不同分子量铁皮石斛多糖对Fe2+-VC诱导小鼠肝脂质过氧化的影响
Fig.4 Inhibitory effects of polysaccharides with different molecular
weights from Dendrobium candidum against lipid peroxidation in
rat liver homogenates induced by Fe2+-VC
85
75
65
55
45
35
25
15
5
DSP
DSP1
DSP2
DSP3
VC
抑
制
率
(%
)
多糖浓度(mg/ml)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
2.5 不同分子量多糖对H2O2诱导红细胞氧化溶血的影响
红细胞内含有启动和催化脂质过氧化反应的金属络
合物血红蛋白，细胞膜上富含多价不饱和脂肪酸，这
些特点均使该类细胞对氧化损伤极为敏感，当向红细胞
悬液中加入H 2O 2后，红细胞膜会受到氧化损伤，而导
致溶血现象的发生[24]。因此红细胞膜常被用作分析和筛
选天然抗氧化剂的实验体系。由图 5可知，4种铁皮石
斛多糖均能有效抑制红细胞溶血现象的发生，并显示出
一定的量效关系。在浓度为 0.8mg/ml时，4种铁皮石斛
多糖抑制红细胞溶血的效果由强到弱为 DSP1(69.7%)＞
DSP3(59.1%)＞DSP(50.8%)＞DSP2(35.9%)。推测是因为
小分子量的多糖更容易渗透到细胞里面，发挥生物活
性，而分子量大的多糖生物活性就受到了一定的限制。
2.6 不同分子量多糖对羟基自由基介导的DNA损伤的
保护作用
图5 不同分子量铁皮多糖对H2O2诱导红细胞氧化溶血的抑制作用
Fig.5 Inhibitory effects of polysaccharides with different molecular
weights from Dendrobium candidum against RBC hemolysis
induced by H2O2
75
65
55
45
35
25
15
DSP
DSP1
DSP2
DSP3
VC
抑
制
率
(%
)
多糖浓度(mg/ml)
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
A1、B1表示 pBR322DNA组；A2、B2表示 pBR322DNA+Fenton氧化剂
组；A 3～A 6分别表示 0.5、2、3、5mg/ml DSP处理组；A 7～A 10分
别表示 0.5、2、3、5mg/ml DSP2处理组；A11～A12与 B11～B12分别表
示 2、4mg/ml VC处理组；B3～B6分别表示 0.5、2、3、5mg/ml DSP1
处理组；B 7～B 1 0分别表示 0 . 5、2、3、5 m g / m l D S P 3 处理组。
图 6 不同分子量铁皮石斛多糖对羟基自由基引起的 pBR322 DNA
(4ng/μl)链断裂的保护作用
Fig.6 Protection of polysaccharides with different molecular
weights from Dendrobium candidum against pBR322 DNA(4 ng/μl)
strand breakage induced by hydroxyl radicals
A
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
B
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
·OH介导的DNA链断裂通过质粒 pBR322DNA 被
氧化断裂为开环型和链型通过电泳可将三者分开[25]，据
此可判断试剂的保护作用。不同分子量的铁皮石斛多糖
对由·OH引起的DNA链断裂的保护作用见图 6，质粒
pBR322DNA未被氧化降解时主要以超螺旋的形式存在，
其电泳时速度最快，位于电泳最前端而经·OH 诱导的
DNA产生环型和线型DNA(图 6中A2和B2)；加入不同
分子量的铁皮石斛多糖就能部分或者完全抑制·OH介
导的 DNA氧化损伤，随着多糖浓度的增加，生成的环
型和线型DNA量不断减少，在 0.5mg/ml时铁皮石斛多
糖均已经起到了抑制 DNA氧化损伤的作用，DSP几乎
100%的抑制了 DNA氧化性断裂。
127※基础研究 食品科学 2009, Vol. 30, No. 21
3 结 论
本实验研究发现铁皮石斛多糖表现出了很强的抗氧
化能力，且随浓度的增大清除率也逐渐增强，但不同
相对分子质量的多糖，在不同抗氧化体系中，其抗氧
化活性差异显著，其中DSP对·OH清除作用强于其他
多糖，在实验的浓度范围内最高清除率和抑制率分别为
79.0%；DSP1对DPPH·的清除率、抑制 Fe2+-VC诱导
小鼠肝匀浆脂质过氧化能力、抑制H2O2诱导红细胞氧化
溶血能力和总抗氧化能力最佳，最大作用效应分别达到
85.3%、65%、69.7%、85.6%；DSP2在上述所有化学
模拟体系中其抗氧化能力都是最弱；同时发现不同相对
分子质量的铁皮石斛均有较强抑制 D N A 损伤的作用，
且明显强于 VC。研究还发现铁皮石斛多糖分子质量小
于 3.53× 104u或大于 7.44× 104u时生物活性较高，表
明多糖抗氧化作用与其分子质量的大小有关。
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