全 文 ：收稿日期:2005-12-27初稿;2007-01-11二改稿
基金项目:上海市绿化管理局(林业局)项目资助(F040202)
作者简介:吕秀立(1980-),女 ,硕士研究生 ,工程师 ,主要从事木本 、草本花卉等珍稀植物的组织培养研究。 E-mai l:tkdyun@163.com;
Tel:(021)54357597
　＊通讯作者 , E-mail:zdm0512@sohu.com;Tel:(021)54352793
　上海农业学报　2007 , 23(1):34-38
　Acta Agriculturae Shanghai
文章编号:1000-3924(2007)01-34-05
花叶矮牵牛嵌合体再生体系的建立
吕秀立1 , 张冬梅1＊ , 钱又宇2
(1 上海市园林科学研究所 ,上海 200232;
2 上海城投绿化科技发展有限公司 ,上海 200232)
摘　要:以花叶矮牵牛为材料 ,研究了外植体 、激素浓度、光照强度 、叶片生理状态 、暗培养时间等因素对诱导
嵌合体不定芽的影响 ,建立了花叶矮牵牛嵌合体再生体系。结果表明:无菌苗在 2 000 lx 光照条件下 ,置于 MS+
6-BA 0.2 mg L培养基上 ,嵌合体诱导率最大达到 90.2%;生理年龄为 20 d 的叶片 , 在 MS+6-BA 0.4 mg L+IBA
0.01 mg L培养基中 , 嵌合体诱导率最大达到 34.8%,暗培养会降低嵌合体的诱导率。
关键词:花叶矮牵牛;嵌合体;再生体系
中图分类号:S681.6　　　　文献标识码:A
矮牵牛(Petunia hybrida Vilm.),又名碧冬茄 ,茄科矮牵牛属多年生草本花卉 ,早春及初夏开花不断 ,
花团锦簇 ,色彩丰富 ,常用做布置花坛 ,是美丽的“五一”节日花卉 ,也是世界上最普及 ,销售量最大的花卉
之一[ 1] 。花叶矮牵牛为上海市园林科学研究所种植的矮牵牛中出现的自然突变体 ,叶片边缘为淡黄色 ,属
于周缘嵌合体 ,除了具有一般矮牵牛的观赏特性外 ,杂色叶片表现出很高的观赏价值 。植物嵌合体是自然
界中广泛存在的一种遗传镶嵌形式 ,性状通常在花瓣 、叶片或枝条上出现 ,但不遗传给后代 ,如紫茉莉 、杜
鹃花瓣上的杂色 、斑块性状 ,只有把变异的部分直接繁殖 ,才有使这种变异性状固定下来的可能[ 2] 。为此
本试验选用花叶矮牵牛为材料 ,研究叶片 、茎段 2种外植体及各种培养条件对再生芽诱导的影响 ,建立稳
定 、高频的嵌合体再生系统 ,繁殖花叶性状明显的优良植株 。目前涉及矮牵牛组织培养及改良花色的转基
因研究比较多[ 3] ,利用组织培养的方法固定嵌合体性状的研究未见报道 。本文报道该项研究结果 。
1　材 料与 方 法
1.1　材　料
材料采自上海市园林科学研究所苗圃 ,选择生长健壮 ,无病虫害并且花叶性状明显的一年生花叶矮牵
牛的幼嫩茎段 、叶片 。
1.2　方　法
1.2.1　分化条件的筛选
将带腋芽的茎段经常规方法消毒后 ,剪成 1 cm 左右的带芽小段 , 放置于原初培养基 MS+6-BA
0.1 mg L上 ,得到一定量的无菌苗后 ,继代于附加不同种类 、不同浓度植物激素的培养基上 ,光照度设置为
500 、1 000 、2 000 、4 000 lx 4种梯度 ,观察各种因子对诱导不定芽的影响。
在上述所得无菌苗的基础上 ,选取生理条件相近并具有黄色边缘的叶片 ,横向剪切 3刀 ,远轴面向下
与培养基接触 ,放置于附加不同种类 、不同浓度植物激素的培养基上 ,初期暗培养条件设置为 0 、3 、5 、7 、9 d
5个梯度 ,观察各种因子对叶片诱导不定芽的影响 。
1.2.2　培养条件
无菌苗于光周期12 h d ,温度 25 ℃条件下培养 。叶片暗培养结束转入光下 ,光照度2 000 lx ,光周期12
h d ,温度 25 ℃。
1.2.3　数据统计
统计数据时 ,每处理调查 30个 ,无菌苗培养 1个月后 ,统计增殖系数;叶片培养 1个月后统计不定芽
分化率和叶片平均再生芽数。
2　结 果与 分 析
2.1　无菌苗的增殖
2.1.1　植物激素对无菌苗增殖及保持嵌合性状的影响
以MS为基本培养基 ,附加激素 6-BA 、KT ,其中 BA 、KT 各设 4个浓度梯度 ,设计 8种培养基配方 。将
生长健壮一致的无菌苗分别转到上述培养基中 ,光照度设置为 1 500 lx ,培养 1个月后统计结果。
表 1　不同激素及其浓度对嵌合体不定芽增殖的影响
Table 1　Effects of different hormones and hormone concentrations on chimera bud multiplication
6-BA
mg·L -1 KTmg·L-1 接种数Inoculated plants 平均诱导芽数Mean of induced buds 诱导率 %Inductivity 嵌和体不定芽Chimera buds 嵌和体比率 %Rate of chimera
0.1 0.0 30 1.2 100 34 66.7
0.2 0.0 30 3.8 100 99 86.8
0.4 0.0 30 7.0 100 133　 63.3
0.8 0.0 30 11.0　 100 121　 36.7
0.0 0.1 30 1.1 100 25 75.8
0.0 0.2 30 2.3 100 53 76.8
0.0 0.4 30 5.3 100 93 58.5
0.0 0.8 30 6.3 100 97 51.3
注:诱导率=出芽外植体数 接种数;平均诱导芽数=不定芽总数 出芽外植体数;嵌和体所占比率=嵌和体不定芽总数 不定芽总数。
Notes:Inductivity=Budding explants Inoculated explants;Mean of induced buds=Adventitious buds Budding explants;Rate of chimera = Chimera
buds Adventitious buds.
表1结果表明 ,取花叶矮牵牛的茎段作为外植体很容易诱导不定芽产生 ,在添加 0.1 ～ 0.8 mg L 范围
内 BA 、KT的培养基 ,诱导率都可以达到 100%。随着激素浓度的升高 ,平均诱导芽数随之增多 ,BA浓度为
0.4 mg L ,KT浓度为 0.6 mg L时 ,试管苗开始出现玻璃化现象 。诱导产生的不定芽不能全部表现出花叶
性状 ,随激素浓度的升高 ,嵌合体不定芽所占比例逐渐减少 ,其中 BA 、KT 浓度为 0.2 mg L 时 ,嵌合体不定
芽所占比例最大 ,分别达到 86.8%和 76.8%。
2.1.2　光照对嵌合体不定芽增殖的影响
将生理条件一致的无菌苗放置于MS+BA 0.2 mg L 培养基中 ,光照度分别设置为 500 、1 500 、2 000 、4
000 lx ,培养 1个月后统计结果 。表 2结果表明 ,不同的光照强度对不定芽诱导率没有影响 ,全部为 100%,
对平均诱导芽数影响也不明显 ,但对嵌合体所占比例影响显著 ,随着光照强度的提高 ,嵌合体所占比例也
随之增加。在光照强度为 500 lx时 ,嵌合体比率仅为 54.3%,当光照强度为 2 000 lx时 ,嵌合体比率达到了
90.2%(图 1A),光照强度再进一步提高到 4 000 lx时 ,不定芽的部分叶片出现焦黄现象 ,植株生长非常快 ,
但茎秆细长。
表 2　不同光照对嵌合体不定芽增殖的影响
Table 2　Effects of different illumination on chimera bud multiplication
光照强度 lx
Intensity of illumination
接种数
Inoculated plants
平均诱导芽数
Mean of induced buds
诱导率 %
Inductivity
嵌和体不定芽
Chimera buds
嵌和体比率 %
Rate of chimera
500 30 3.5 100 57 54.3
1 500 30 3.8 100 99 86.8
2 000 30 4.1 100 111　 90.2
4 000 30 3.9 100 105　 89.2
2.2　叶片外植体诱导不定芽的分化
2.2.1　6-BA 、NAA 、IBA不同浓度对嵌合体不定芽诱导的影响
以生长良好的叶片为外植体 ,在 MS基本培养基中加入不同浓度的 BA 、NAA 、IBA等 ,筛选分化效果好
的培养基 ,每种培养基接种外植体数目为30个 ,培养 1个月后统计各种指标数据。结果表明 ,培养基中的
351 期　　　　　　　　　　　　　　吕秀立 , 等:花叶矮牵牛嵌合体再生体系的建立
激素成分对叶片分化不定芽至关重要(表3),在不添加任何激素的MS培养基中 ,叶片逐渐缩小干枯 ,不能
诱导不定芽的产生;添加 6-BA后 ,叶片可以分化出不定芽 ,但平均诱导芽数和诱导率比较低 ,再附加以 0.
01 mg L NAA或 IBA后 ,平均诱导芽数和诱导率有所提高 ,最高分别达到 7.5个和 76.7%。添加NAA的培
养基在分化芽的同时 ,外植体容易产生根 ,而添加 IBA的培养基外植体无根产生 ,对于不定芽的诱导率 、平
均诱导芽数及嵌合体诱导情况 ,NAA和 IBA 2者作用效果差别不明显。诱导出的不定芽也不能完全表现
出花叶性状 ,随 6-BA浓度提高 ,嵌合体所占比例降低 ,培养基MS+6-BA 0.4 mg L+IBA 0.01 mg L诱导嵌
合体不定芽最适合 ,嵌合体诱导率可以达到 25.5%。
表 3　不同激素浓度对嵌合体不定芽诱导的影响
Table 3　Effects of different hormone concentrations on chimera bud induction
6-BA
mg·L-1
NAA
mg·L-1
IBA
mg·L-1 平均诱导芽数Mean of induced buds 诱导率 %Inductivity 嵌合体不定芽Chimera bud 嵌合体比率 %Chimera rate 生根Root
0.0 0.00 0.00 0.0 0.00 0 0.0 Rootless
0.2 0.00 0.00 2.5 6.67 1 20.0 Rootless
0.2 0.01 0.00 5.3 23.30 7 18.9 Rooting
0.2 0.00 0.01 4.5 26.70 6 16.7 Rootless
0.4 0.00 0.00 2.4 16.70 3 25.0 Rootless
0.4 0.01 0.00 7.3 50.00 26　 23.7 Rooting
0.4 0.00 0.01 7.5 43.30 25　 25.5 Rootless
0.8 0.00 0.00 2.4 23.30 2 11.8 Rootless
0.8 0.01 0.00 6.0 73.30 13　 9.8 Rooting
0.8 0.00 0.01 6.6 76.70 15　 9.9 Rootless
2.2.2　叶片生理状态对嵌合体不定芽诱导的影响
叶片生理年龄对外植体再分化的影响已有报道 ,一般认为生理年龄比较低的分化程度小 ,容易脱分化
再诱导形成芽 ,出芽率比较高[ 4 , 5] ,但叶片生理年龄对嵌合体不定芽诱导的影响尚未见报道 。将不同叶龄
的外植体放置于 MS+6-BA 0.4 mg L+IBA 0.01 mg L培养基中 ,统计结果表明(表 4),20 d叶龄的叶片分
化率最高 ,达到 60%,平均诱导芽数为 7.8个 ,嵌合体不定芽的比率也达到最大 34.8%。早期叶片面积太
小 ,吸收不到足够的养分和外源激素 ,生理状况不合适 ,达不到成芽要求;叶龄过大叶片柔嫩度降低 ,芽的
分化率也随之下降。
表 4　不同叶龄对嵌合体不定芽诱导的影响
Table 4　Effects of different leaf ages on chimera bud induction
叶龄 d
Leaf age
接种数
Inoculated plants
平均诱导芽数
Mean of induced buds
诱导率 %
Inductivity
嵌合体不定芽
Chimera buds
嵌合体比率 %
Chimera rate
10 30 3.29 23.33 4 17.40
15 30 5.20 36.67 13 22.80
20 30 7.80 60.00 49 34.80
25 30 4.10 40.00 11 22.40
30 30 3.50 20.00 2 9.50
2.2.3　暗培养时间对嵌合体不定芽诱导的影响
暗培养可以活化伤口细胞 ,减少外植体酚类物质的溢出 ,有利于芽的分化[ 6 , 7] 。本试验取生理年龄为
20 d的叶片置于 MS+6-BA 0.4 mg L+IBA 0.01 mg L培养基上 ,分别做不同暗培养时间处理后 ,转入正常
光下 , 1个月后统计观察结果。结果表明(表 5), 暗培养对花叶矮牵牛叶片的分化产生了明显的促进作
表 5　不同暗处理对嵌合体不定芽诱导的影响
Table 5　Effects of different dark treatments on chimera bud induction
暗处理 d
Dark treatment
接种数
Inoculated plants
平均诱导芽数
Mean of induced buds
诱导率 %
Inductivity
嵌合体不定芽
Chimera buds
嵌合体比例 %
Chimera rate
0 30 7.80 60.0 49 34.80
2 30 7.95 76.7 41 25.80
4 30 8.04 83.3 39 19.40
8 30 8.13 100 　 31 12.70
12 30 7.60 100 　 14 6.10
16 30 6.70 100 　 0 0.00
36 上　　海　　农　　业　　学　　报　　　　　　　　　　　　　　　23卷
用 ,暗处形成的突起芽点为黄色 ,转移至光下 2 d 后转变为绿色突起 ,很快形成肉眼可见的不定芽。暗处
理以 8 d为宜 ,诱导率达到了100%,平均诱导芽数达到最大 8.13 ,暗处理时间过长 ,切口处产生愈伤组织 ,
平均诱导芽数及诱导率降低 ,并且后期成长为畸形苗 ,长势弱 。但暗培养对于嵌合体的诱导起负面作用 ,
暗培养时间越长 ,嵌合体所占的比例越小 ,暗培养时间为 16 d 时 ,诱导的不定芽全部为绿色 ,完全失去了
花叶性状(图 1B)。
2.3　试管苗生根及移栽
由茎段和叶片分化得来的试管苗长至 1 ～ 2 cm 时 ,可以切下用来诱导生根。表 6可以看出:大量元素
减半的1 2MS 比MS更有利于生根 ,附加生长素可以明显促进生根 ,细胞分裂素对生根没有明显促进或滞
后作用 ,但是引起试管苗的增殖 ,给移栽带来困难 ,故生根时应该去掉细胞分裂素 。嵌合体和非嵌合体的
无菌苗在生根方面没有差别 ,生根培养基选用 1 2MS+NAA 0.4 mg L ,生根频率达到了 100%(图 1C)。移
栽时用自来水洗净根部的培养基 ,用500倍托布津水溶液浸泡根部数秒后 ,移栽到珍珠岩∶红土∶腐殖质为
1∶1∶1的基质中 ,相对湿度 85%,移栽初期应适当遮荫 ,后期管理逐渐加强光强至全光照 ,当苗长到 10 cm
高时 ,可移动到同样基质的花盆或吊盆内。
A.嵌合体不定芽的增殖;B.叶片分化出不定芽;C.试管苗生根
A.Multiplication of plant chimera;B.The buds induced f rom leaves;C.Rooting test-tube plant let
图 1　花叶矮牵牛不同的培养阶段
Fig.1　The different cul ture stages of Petunia hybrida Vilm.
表 6　不同培养基对根诱导的影响
Table 6　Effects of different culture media on root induction
培养基 mg·L-1
Culture medium
接种数
Inoculated plants
生根率 %
Rooting rate
增殖情况
Multiplication state
MS+NAA 0.1 30 43.3 No mult iplication
1 2 MS+NAA 0.1 30 63.3 No mult iplication
1 2 MS+NAA 0.2 30 93.3 No mult iplication
1 2 MS+NAA 0.2+BA 0.1 30 90.0 Multiplication
1 2 MS+NAA 0.4 30 100 　 No mult iplication
1 2 MS+NAA 0.4+BA 0.1 30 100 　 Multiplication
3　结 论与 讨 论
嵌合体主要是由于植物顶端细胞系中存在遗传基础不同的细胞而形成的 ,嵌合体中嵌合状态的持久
性取决于顶端原始细胞的数量和顶端细胞层的稳定性 ,对于研究植物生长发育过程中细胞间的相互作用
十分有价值[ 8] 。本试验探讨了影响花叶矮牵牛嵌合体再生植株的几个因素 ,如外植体 、激素及其浓度 、光
照强度 、叶片生理状态 、暗培养时间等。
取材对于嵌合体性状保持至关重要 ,采用茎段诱导时 ,是通过定芽途径即从顶芽和腋芽处再生植株 ,
在合适条件下 ,诱导率达到90.2%;而外植体为叶片时 ,是通过不定芽途径即细胞脱分化再分化为植株 ,
诱导率最高仅为 34.8%。定芽途径获得再生植株的幼芽来自于外植体中存在的芽或芽原基 ,从细胞学角
度来说 ,定芽的遗传性质十分稳定 ,自发变异频率低 ,可以使母株的优良性状在后代中保持不变。而通过
不定芽途径 ,培养过程中存在细胞的脱分化 ,可能在很大程度上破坏了决定嵌合体性状细胞的数量 ,并引
371 期　　　　　　　　　　　　　　吕秀立 , 等:花叶矮牵牛嵌合体再生体系的建立
起该部分细胞的深刻变化 ,导致后代嵌合体的性状部分或全部丧失。
激素是影响嵌合体性状的另一重要因素 ,随着激素浓度的升高 ,嵌合体的比例下降 ,在定芽和不定芽
2种途径中都存在这种现象。嵌合体中后期发育为绿色和黄色的 2种原始细胞系 ,在内部组成或基因水
平上存在差异 ,2种类型的细胞对外源激素的刺激反应不同 ,过高的激素浓度使得表达绿色的细胞分裂增
殖速度加快 ,从而抑制了表达黄色的细胞数量的增加 ,进而影响到嵌合体性状的稳定性 ,使得后代诱导出
嵌合体不定芽比例下降。
光是植物生长发育不可缺少的一个重要因子 ,植物利用光进行光合作用制造营养和储存能量 ,在光信
号作用下进行光形态建成等。在定芽途径中 ,光照强度增加可以提高嵌合体不定芽的诱导率 ,在不定芽途
径中 ,暗培养时间延长会降低叶片嵌合体不定芽的诱导率 ,适当的暗培养却可以提高叶片诱导正常芽的比
率 ,这说明花叶矮牵牛嵌合体不定芽的诱导需要一定的光照强度 。在弱光和暗培养的条件下 ,表达绿色的
细胞系分裂速度比较快 ,诱导出的不定芽为绿色 ,可以吸收到更多的光能 ,以供自身的各种需要。据此可
以推断 ,表达黄色的细胞中可能缺少叶绿素 ,并且对光的捕捉能力远远不及表达绿色的细胞。
值得一提的是 ,在叶片诱导过程中 ,嵌合体不定芽大多产生于叶片黄色和绿色的交界处 ,叶片内侧的
绿色部分诱导出的是绿色的不定芽 ,边缘黄色部分分化出的芽初期表现为黄色 ,后逐渐白化死亡。据此初
步判断 ,花叶矮牵牛嵌合体性状的出现是由于质体缺失而引起体细胞之间的分离 ,或者是表达黄色的细胞
中失去了一段能抑制黄色素形成的染色体片段。对于花叶矮牵牛嵌合体性状出现的原因 ,还有待于借助
分子生物学等手段从细胞和基因水平上深入研究 。
参　考　文　献
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Establishment of plant chimera
regeneration system in Petunia hybrida Vilm.
L Xiu-li1 , ZHANG Dong-mei1 , QIAN You-yu2
(1Shanghai Landscape Gardening Research Institute , Shanghai 200232 , China;
2
Shanghai Chengtou Landscaping Technology Development Co., Ltd ., Shanghai 200232 , China)
Abstract:The plants of Petunia hybrida were used as a testmaterial , and the effects of different explants ,
hormone concentrations , illumination conditions , explants physiological conditions , and dark-culture time on inducing
chimera buds were studied.The experimental results showed that the inductivity of chimera buds reached the
maximum , or 90.2%when the germ-free plantlets were on the medium of MS +0.2 mg L 6-BA and under light
treatment of 2 000 lx.The leaves at physiological age of 20 days on the medium of MS+0.4 mg L 6-BA+0.01 mg
L IBA reached the maximum inductivity of chimera buds , or 34.8%.And dark culture reduced the inductivity of
chimera buds.
Key words:Petunia hybrida Vilm.;Plant chimera;Regeneration system
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