全 文 ：园　艺　学　报　2002 , 29 (3):255 ～ 257
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期:2001-11-26;修回日期:2002-03-18
基金项目:荷兰 Wageningen大学育种实验室项目
＊本文为作者 1998年 1月 ～ 1999年 10月在荷兰Wageningen大学育种实验室作访问学者期间的部分工作 , 期间得到 Kuipers A G J、
De Jeu M J和Visser R G F博士的悉心指导和实验室其他同仁的热情帮助 , 在此一并致谢。
荧光原位杂交检测野生六出花 (Alstroemeria au-
rea)染色体命运＊
周树军
(山东农业大学林学院 , 泰安 271018)
摘　要:利用从野生六出花 (Alstroemeria aurea)中分离的一个种特异性串联重复序列 (A001-I)作荧光
原位杂交的探针 , 检测野生六出花染色体在其一系列杂交后代中的命运。试验结果表明 , 除最长的一对染
色体外 , 该方法能够检测到在其一系列杂种后代中其余 7 对染色体是否存在。
关键词:六出花;特异性重复序列;荧光原位杂交
中图分类号:S 68　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X (2002)03-0255-03
将有价值的外源基因或染色体导入栽培植物 , 对改良作物栽培品种起到了很大的作用 , 如燕麦染
色体的片段导入小麦中大大提高了小麦的抗病性〔1〕 。尽管利用现在基因工程的方法已克隆了一定数量
的基因并获得了转基因植物 , 但它不能取代传统的杂交育种方法 , 因为能够克隆的基因必须是单拷贝
的且基因产物是明确的 , 而很多农艺性状往往由多基因控制 , 且基因产物不清楚。传统育种方法需要
连续几代的回交 , 费力费时 , 存在着盲目性 , 因为在连续回交过程中会发生所需染色体丢失的现象。
近年来分子细胞遗传学利用分子探针能够检测外源染色体渗入栽培植物的过程 , 克服传统育种的盲目
性 , 提高育种的效率 , 加速育种的进程 。
六出花 (Alstroemeria), 又名百合水仙 , 在荷兰是重要的切花 。其野生种 (如 A.aurea 和 A.
psittacina)存在许多栽培品种中不具备的园艺学性状 (如抗病毒 , 瓶插寿命长 , 耐寒等特点)。De
Jeu等从野生六出花A.aurea 中分离了一组重复序列 , 其中 A001-I 含有 217 bp , 且为该种的特异性高
度重复序列〔2〕 , Kamstra等用荧光原位杂交鉴别了其每一对染色体〔3〕;Kuipers等研究了A.psittacina 高
度重复序列的特征和物理定位〔4〕 。De Jeu 等用 Southern杂交表明四倍体栽培品种 Jubilae 不含A.aurea
的A001-I 这一重复序列〔2〕 。本研究利用 De Jeu等从A.aurea分离的 A001-I作为荧光原位杂交的探针 ,
旨在检测A.aurea的染色体在其一系列杂交后代中的命运 , 希望为六出花的育种选材提供理论依据。
1　材料与方法
1.1 　材料
本研究所需原始植物材料的来源和编号列于表 1 , 其一系列杂种的关系和编号见图 1 , 这些杂种
是Wageningen农业大学育种实验室采用 De Jeu等〔5〕描述的胚培养技术获得的 , 并由 De Jeu提供 , 所
有植物材料均保存于该实验室 。
1.2 　荧光原位杂交 (FISH)
染色体制片基本根据周树军等的方法〔6〕 。待试管苗根长约 2 cm , 小心取出 , 用凉水洗掉凝胶 ,
放入 200μL/L cyclohexamide 中 , 在室温条件下处理 8 h , 然后切下根尖放入 4℃的乙醇和乙酸 (3∶1)
固定液中 , 12 h后用常规压片法进行染色体制片 。
探针标记用 Boehrings Mannbeim 公司生产的生物素 (biotin-16-dUTP), 采用 PCR 法进行标记。
50 μL 的反应混合物中含有插入的 A001-I 的 pUC19 质粒 200 ng 、 M13上游和下游引物各 50 pmol、
Perkin Elmer 生产的 Taq酶 1u 、 dNTP各 200 μmol·L-1 、biotin-16-dUTP 10 μmol·L-1 、 1倍的 Perkin Elmer
PCR缓冲液。PCR的反应程序为:第 1 个循环 95℃ 7 min 、 50℃1 min 、 72℃ 2 min , 接着进行 29个
95℃1 min 、 50℃1 min 、 72℃1 min重复循环 , 然后 72℃延长 10 min , 最后 4℃保存 。
用 RNase A(100 μg·mL-1)和 Pepsin(5 μg·mL-1)对染色体分别预处理 60 min和 10 min , 用 4%
paraformaldehyde固定 10 min , 用 70%、 90%、 100%的乙醇各脱水3 min后在空气中干燥。杂交液中含
有 50%deionized formamide 、 10%dextran sulphate、 2×SSC (即 0.30 mol·L-1NaCl和 0.030 mol·L-1 sodi-
um cirtate , pH 7.0)、 0.25 % SDS 、 1.25 ～ 2.5 ng·μL-1 A00I 、 0.06 ～ 0.25μg·μL-1sonicated herrring
sperm DNA 。杂交液在70℃的条件下变性 10 min后迅速埋入冰中至少 5 min , 将每张经预处理的染色
体片滴加 40μL变性杂交液 , 然后将其在 80℃的条件下变性 5 min , 杂交反应在一个保湿盒中于 37℃
的恒温箱中进行 12 h。杂交松紧度约 80%, 即:反应后的载玻片用 2×SSC洗 15 min , 用 42℃的 0.1
×SSC 洗 30 min , 再用 2×SSC洗 15 min , 然后在 buffer 1 (0.1 mol·L-1 Tris-HCl和 0.15 mol·L-1NaCl ,
pH 7.5)中洗 5 min。
Biotin-16-dUTP 分别用 4 μg·mL-1 streptavidin-Cy3(Jackson Immuno Research Laboratories)、10μg·mL-1
biotinylated-antistreptavidin(Vector Laboratories)、再用 4μg·mL-1 strptavidin-Cy3进行 3次检测 。每次每张
载玻片先用200 μL blocking buffer (buffer 1中含有
1% Boehringer Mannheim 生产的封阻剂)保温
5 min , 再用 100 μL 含以上相应抗体的 blocking
buffer在 37℃的条件下保温 1 h , 最后用在 37℃的
水浴锅中用buffer 1洗 3次 , 每次 5 min。用 1μg·
mL-1 DAPI (4 , 6-diamidino-2-phenylindole)复染 ,
用5 μL Vector Laboratories生产的 Vectashied封片 ,
用Zeiss Axiophot荧光显微镜镜检测 , 用 400 ASA
彩卷照相 , 将负片扫入计算机 , 用 CorelDraw 软件
获得最佳对比度的照片。
2　结果与分析
结果见插页 4图版和图 1。野生种A.aurea和
栽培品种 Jubilee 杂交产生的杂种 92JA010为三倍
体 , 且7条染色体有较强的簇状A001-I的FISH信
号 (见插页 4图版 , A)。这一结果同前人报道的
结果一致 , 表明了 8对染色体中有 7对存在A001-
I的 FISH 信号 , 同时也表明四倍体的六出花品种
Jubilee不含 A001-I 重复序列〔2 ,4〕 。A.psittacina 与
92JA010的杂交种 BCJA1为四倍体 (2n=4x =32)
(见插页 4图版 , B)。结果表明 92JA010产生了不
减数的雄配子 (n=3x=24), 因此 BCJA1的基因
组中亦含有 7 条显示 A001-I 信号的染色体(见插
页4图版 ,B 和 C;B 中的红色箭头与 C 中的红色
信号相对应)。
表 1　本研究所用的两个六出花野生种和一个栽培品种
Table 1　Two species and a cultivar of Alstroemeria
used in the present study
种和品种
Species and
Cultivar
来源
Origin
染色体数目
Chromosome
numbers
编号
Code
A.aurea 智利　Chile 2n=2x=16 A001
A.psittacina 巴西　Brazil 2n=2x=16 93Z390.4
Jubilae 栽培种　Cultivar 2n=4x=32 CV118
图 1　与野生六出花相关的杂种来源示意图
带星号的斜体数字表明有 A001-I荧光原位杂交信号的
A.aurea染色体数.
Fig.1　A series of hybrids related with A.aurea
3x or 4x in the brackets show the results of the polyploidy of the
hybrids and the italic numbers marked with asterisks represent the
umber of A.aurea chomosome (s)which had FISH sigal (s)of A001-I.
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　　 A.psittacina 和 BCJA1的回交后代为三倍体 (2n=3x=24), 其基因组中只有一条染色体A001-I的
信号 (见插页 4图版 , D);BCJA1 和A.psittacina 的杂交后代虽然亦为三倍体 , 但有四条染色体上具
有A001-I的信号 。一般情况下 , 三倍体极少产生可育的配子 , 如果产生可育配子 , 它们一般为二倍
体。试验结果表明三倍体的 BCJA1无论是作父本还是母本产生的可育的配子都是二倍体 , 但它们的
染色体组成是不同的 , 雄配子中只有 1条染色体 A001-I 的信号 , 雌配子有 4条染色体上具有 A001-I
的信号 , 它们都清楚地反映在其后代的个体中 (图1和插页 4图版D 、 E和 F)。因此A001-I能够作为
A.aurea 的一个分子标记用于检测其染色体在一系列杂交后代中的命运。当然仅用 A001-I 作分子标记
存在一定的局限性 , 因为 A.aurea 的一号染色体上没有A001-I的信号〔4〕 。我们试图用基因组原位杂
交 (GISH)的方法来检测A.aurea一号染色体在其一系列杂种中的命运 , 但 GISH 的结果与 FISH 的结
果几乎相同 , 因此难以将A.aurea 一号染色体与最长的 Jubilae 和 A.psittacina 的染色体区分开来。
Kuipers等利用 GISH 区分了A.aurea 和 A.inodora 的基因组〔7〕 , 本试验仍未得到理想 GISH 结果的原因
有待进一步探讨 。
根据试验结果和以上分析 , 我们认为A001-I可以作为A.aurea 的分子标记用于六出花的杂交育种
中检测A.aurea 染色体的命运。这既有助于克服该杂交育种工作的盲目性 , 又将会有助于判断一些性
状和其相关的基因连锁群 。当然由于只用A001-I作分子标记不能一一区分A.aurea 的每一条染色体 ,
因此如同其他探针结合使用会得到更好的结果。
参考文献:
1　Jiang J , Friebe B , Gill B S.Recent advances in alien gene transfer in wheat.Euphytica , 1994 , 73:199～ 212
2　De Jeu M J , Lasschuit J , Kuipers A G J , et al.Characterisation and localisation of repetitive DNA sequences in the ornamental Alstroemeria aurea
Graham.Theor.Appl.Genet., 1997, 94:982～ 990
3　Kuipers A G J , Kamstra S A , De Jeu M J , et al.Molecular characterisation and physical localisation of highly repetitive DNA sequences f rom Brazi li an
Alstroemeria species.1999 , Submitted.
4　Kamstra S A , Kuipers A G J , De Jeu M J , et al.Physical localisation of repetitive DNA sequences in Alstroemeria:karyotyping of two species with
species-specific and ribosomal DNA.Genome , 1997 , 40:652～ 658
5　De Jeu M J , Jacobsen E.Early postfertilization ovule culture in Alstroemeria L.and barriers to inerspecific hybridization.Euphytica , 1995 , 86:15～ 23
6　周树军 , 汪劲武.10种菊属植物的细胞学研究.武汉植物学研究 , 1997 , 15 (4):289～ 292
7　Kuipers G J , vanOs D P M , de Jong J H , et al.Molecular cytogenetics of Alstroemeria:identification of parental genomes in interspecific hybrids and
characterization of repetitive DNA families in constitutive heterochromatin.Chromosome Res., 1997 , 5:31～ 39
Detection of Alstroemeria aurea Chromosomes in a Series of Its Hybrids
Zhou Shujun
(College of Forestry , Shandong Agricultural University , Tai an 271018 , China)
Abstract:A001-I , a species-specific repetitive sequences isolated from Alstroemeria aurea , was used in fluo-
rescence in situ hybridization to detect the fate of A.aurea chromosomes in a series of its hybrids in this study.We
could clearly detect the change of the number of A.aurea chromosomes in its related hybrids except for Chromosome
1 , the longest chromosome of A.aurea .This could be helpful to select materials in further Alstroemeria breeding.
Key words:Alstroemeria aurea;Species-specific sequence;Fluorescence in situ hybridization
2573 期　　　　　　　周树军等:荧光原位杂交检测野生六出花 (Alstroemeria aurea)染色体命运